胡勇[]刘芳通讯作者
（贵州医科大学，550004）
摘要目的研究载脂蛋白E（ApoE）的多态性与主观认知减退（SCD）的相关性。方法选取SCD患者130例为SCD组，另选取同期体检的健康人120例为对照组，应用聚合酶链反应检测两组ApoE基因多态性，并分析其与SCD患病之间的相关性。结果最常见的基因型是ε3/ε3，SCD组为64.61%，对照组为67.86%，SCD组ε3/4（18.46%）及ε4/4（6.15%）基因型频率高于对照组(14.17%，0.90%)，差异存在统计学意义（χ2=4.139、4.173，P＜0.05）。SCD组和对照组ε4等位基因频率分别为17.69%、7.91%，两者比较差异存在统计学意义（χ2=4.421，P=0.036），两组ApoE等位基因频率均以ε3最高（SCD组为75%，对照组为81.67%)；ApoEε4等位基因频率与SCD患病呈正相关性(OR=1.922，P=0.036)。结论ApoEε4基因是SCD患病的重要危险因素。
关键词载脂蛋白E；主观认知下降；基因多态性；相关性
CorrelationbetweenApolipoproteinEGenePolymorphismsandSubjectiveCognitiveDeclineHUYong，LIUFangDepartmentofNerology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China
ABSTRACTAIMToresearchthecorrelationbetweenthepolymorphismsofapolipoproteinE(ApoE)andsubjectivecognitivedecline(SCD).MethodsTotal130SCDpatientswereenrolledasSCDgroup,and120healthyoldpeoplewereenrolledascontrolgroup.Polymerasechainreaction(PCR)wasusedtodetectthepolymorphismofApoEgeneintwogroupsanditscorrelationwithSCDprevalencewasanalyzed.ThepolymorphismsofApoEgenewereidentifiedwiththemethodofpolymerasechainreaction-restriction,ItscorrelationwithSCDwasanalyzed.Resultsε3/ε3wasthemostcommongenotype.TheSCDgroupwas64.61%,controlgroupwas67.86%.ε3/4（18.46%）andε4/4（6.15%）genotypefrequencyintheSCDgroupwashigherthanthatinthecontrolgroup(14.17%，0.90%),withsignificantdiffer-ence(χ2=4.139、4.173,P＜0.05).Thefrequencyofε4allelespolymorphismintheSCDgroupandthecontrolgroupwere17.69%、7.91%,withsignificantdifference(χ2=4.421，P=0.036).ε3allelespolymorphismwasthemostcommon(75%inSCDgroupand81.67%incontrolgroup).ApoEε4allelewaspositivelycorrelatedwithSCD(OR=1.922，P=0.036).ConclusionApoEε4geneisanimportantriskfactorforSCD.
KEYWORDSapolipoproteinE;subjectivecognitivedecline;geneticpolymorphism;correlation
阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease，AD)即俗称的老年痴呆症，是一种病程缓慢的认知障碍性疾病，一般患者发病初期会出现轻度的主观认知减退，随着病情的加重会逐渐出现轻度的认知障碍和痴呆期三个阶段[1，2]。Jessen等[3]提出，患者出现的认知功能减退是一种主观意识上的功能下降无法通过现代医学检查进行客观的诊断，也就是说患者本身感受到认知水平相比之前有所减退，但是客观检查上却未发现患有轻度认知障碍或者痴呆。患者一旦发生认知功能减退后，就会逐渐的变得更加严重，这是一种慢性的过程，而并非突然的抑郁、情绪下降以及重度或系统病变等突然导致的。患者一旦出现主观上的认知减退，接下来就会逐渐转变为轻度认知障碍，甚至最终发展成为痴呆[4]。载脂蛋白E基因(ApolipoproteinEgene)基因多态性被公认与AD及MCI发病密切相关，ApoEε4等位基因是阿尔兹海默症发病的一个独立危险因素。本文探讨SCD患者与正常老年人的ApoE基因多态性，分析其与SCD的相关性,旨在为SCD的防治提供依据。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1对象从2016年9月到2017年9月到贵州医科大学附院及解放军44医院神经内科住院及门诊就诊患者中，选取病人年龄≥60岁患者为研究对象。纳入标准：（1）能够与医生及护士有效沟通；（2）知道本次研究的目的，患者和患者家属均对本次研究知情同意且签署相关同意书说明者；（3）自我感觉和家属发现患者的记忆力下降明显。排除标准：（1）发现可能引起中枢系统神经损伤的疾病及病史，包括脑血管疾病、脑外伤和帕金森以及肿瘤、酗酒及已明确的AD、MCI等；（2）弱者、耳聋等原因导致的不能与医护人员进行正常沟通者；（3）长期使用可能影响认知的药物及糖皮质激素服用患者；（4）简易智力状态检查量表（MMSE）及北京版蒙特利尔认知评估量表(montrealcognitiveassessment，MoCA)达到痴呆评分者。
1.1.2入组标准SCD入组标准：（1）记忆减退主诉的评定：采用Lam等[5]开发的中国记忆症状量表(ChineseMemorySymptomsScale)。该量表包括5个条目:“您是否经常遗忘物品的摆放位置”,“无法想起好朋友的姓名”，“对谈话的内容无法想起”，“有主观记忆问题”及“明显感觉自己的记忆力比同龄其他老人差”。被试者如果上述问题2个以上条目均回答有，则认为有主观记忆减退；（2）认知功能的评定：采用简易智力状态检查量表及北京版蒙特利尔认知评估量表进行认知功能评定：两量表均采用按文化程度校正的临界分值标准，即MMSE得分中学或以上(受教育年限>6年)者≤24分，则视为存在认知功能障碍，27-30分为正常。MoCA得分中学或以上(受教育年限>6年)者≤24分，视为有认知功能障碍，≥26分认知正常。本研究以受教育程度为中学以上为对象进行对照研究，故以MMSE≥27分，MoCA≥26分排除认知功能障碍。（3）符合纳入及排除标准。正常对照组入组标准：（1）无记忆减退主诉；（2）MMSE≥27分、MoCA≥26分；（3）符合纳入标准第1、2点及排除标准。
1.1.3入组信息SCD组130例，男75例，女55例；年龄60~83岁，平均（72.8±8.1）岁；对照组为120例健康者，男68例、女52例，其中最年轻的患者61岁，最年长的患者85岁，平均（73.1±8.6）岁。在年龄、性别等有关信息上，两组间的情况相似，可以进行比较（P＞0.05）。
1.2方法
1.2.1DNA提取提取每名患者2毫升的外周静脉血，采用3.8%柠檬酸钠抗凝，将白细胞基因组DNA通过盐析法进行提取，之后放置于零下20度的冰箱中储藏。
1.2.2ApoE基因多态性检测将提取出来的基因进行扩增，使用PrimerPremier5软件设计及并合成ApoE基因的引物，上游引物为物序列5’-AGGAACAACTGACCCCGGT-3’下游引物为5’-TGCTCCTTCACCTCGTCCA-3’。聚合酶链反应(PCR)体系50μl:PremTaq(ExTagVersion)2.0D331A12.5μl，基因组DNA0.3μg，上下游引物(10μmol/L)各1μl，加灭菌蒸馏水定容至50μl。PCR反应条件:95℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火35s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃继续延伸6min后降至4℃。PCR产物经纯化回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司SK1141)纯化后，对靶基因进行直接测序，采用的仪器是3730序列分析仪，得到不同ApoE基因型。
1.3统计学处理
通过PCR扩增得到ApoE基因型，对各组基因型频率和等位基因频率进行计算，参考Hardy-Weinberg平衡检验对样本人群基因频率进行判断，是否符合平衡规律以及是否具有恒定性。对组间频数采用χ2检验，使用SPSS22.0进行统计学上的分析和处理。用均数±标准差(χ±s)表示计量资料，样本间均数使用t检验，当p<0.05视为差异具有统计学上的意义。
3结果
2.1Hardy-Weinberg吻合度检验两组的ApoE基因型频率及等位基因频率分布与Hardy-Weinberg平衡定律相符合，具有较好的吻合度(χ2=4.78、2.35，P＞0.05)。
2.2ApoE基因型分布分析2组ApoE基因型多态性，最常见的基因型是ε3/ε3，SCD组为64.61%，对照组为67.86%，SCD组ε3/4（18.46%）及ε4/4（6.15%）基因型频率高于对照组(14.17%，0.90%)，差异有统计学意义（χ2=4.139、4.173，P＜0.05）。见表1。
2.4ApoE等位基因频率风险分析通过计算OR值估计ApoE基因与SCD的关系，结果证明ApoEε2(OR=0.657，95%CI:0.322～1.298)、ε3(0R=0.795，95%CI:0.521～1.301)等位基因与SCD发病无显著相关性。ApoEε4等位基因与SCD呈正相关性(OR=1.922，95%CI:1.065～3.513)。
4讨论
认知功能损伤是AD的主要表现，其病因不明，具体的发病机制上不明确，在进行早期诊断时容易出现误诊和漏诊，因此在治疗结果上存在一定的困难和差异。临床上开始对AD的研究时比较重视对痴呆这方面的研究，但病情发展到此时患者的大量神经元已经死亡了，因此在治疗上非常困难和麻烦，没有有效的药物能够治疗，治疗效果较差，无法逆转病程，[6,7]。对于主观认知功能减退这一阶段，能够让临床工作者们正确的分别出认知功能正常者到不正常者，同时也能够让我们知道，患者从一开始的认知功正常到痴呆的过程中间还会经历主观认知减退，有利于早期发现患者的病情并做出治疗。也就是说老年人在MMSE及Moca等相关认知量表评测上还没有表现出明显认知下降时，就针对患者的病情做出有效的护理和防治对延缓患者的病情蔓延和发展具有十分重要的意义。对早期预防阿尔兹海默症及治疗具有重大意义。目前进行载脂蛋白E（ApoE）的多态性与MCI及AD相关性的研究较多，而比较与SCD相关性文章较少，这也是开展本项研究的意义所在。
ApoE基因位点具有多态性这一结论是1975年一名外国的学者在进行电聚焦实验时发现的。组成ApoE基因的主要物质是核苷酸3597个，含有外显因子多个以及内含子3个。在氨基酸序列中排行第112位和158位的半胱氨酸和精氨酸互换是ApoE基因多态分子学的基础。
其中最常见的等位基因和遗传表型是ApoEε3/3及等位基因ε3。目前比较统一的说法是由于年龄、种族和区域的不同，ApoE等位基因的分布频率也不同。ε3是野生型基因，ε2和ε4是突变型基因，ε3几乎不会对血脂产生任何的影响，但是ε2和ε4基因却会产生明显的影响。目前认为机体血清中的Ch和脂质的代谢受到ApoE基因的影响从而产生各种疾病。
为了进一步探讨ApoE与SCD发病率之间的关系，本研究重点比较SCD患者与正常老年人的ApoE基因多态性。曾有相关研究对患者与健康受试者的ApoE基因数据进行回顾性分析，结果表明：SCD患者的ε4基因频率明显增高，提示其可能与SCD患病存在相关性[3]。在本研究中，我们发现2组ApoE基因型多态性相比，SCD组ε3/4（18.46%）及ε4/4（6.15%）基因型频率高于对照组(14.17%，0.90%)（χ2=4.139,4.173，P<0.05），ε3/ε3是最常见的基因型（SCD组为64.61%，对照组为67.86%）。在等位基因多态性分布频率比较中，结果显示SCD组和对照组ε4等位基因频率分别为17.69%、7.91%，比较差异巨具有统计学上的意义（χ2=4.421，P=0.036）,ε3是最常见的等位基因，其中SCD组为64.61%，对照组为67.86%。这一结果支持ApoEε4基因与SCD患病存在可能联系。有相关文献报告，人淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）基因会受到ε4基因的一定程度上的影响，通过影响APP基因的水解位点，增加淀粉样蛋白沉淀和降低乙酰胆碱含量，最终导致发生AD[8,9]。
本研究通过风险分析提示ApoEε4等位基因与SCD呈正相关性(OR=1.922)，携带ApoEε4等位基因者患SCD的可能性是未携带者的2.24倍，推测ApoEε4等位基因可能是SCD患病的风险因子之一。有报道称，发现SCD的患病率与ε4基因的个数呈正相关，家族性的SCD患者中随着ε4基因的个数增加，SCD的患病率甚至可增至90%，这与本研究结果相似[10，11]。
Jessen等[3]发现更有可能发展成为AD的SCD阶段出现的特征包括：（1）患者自觉记忆下降更加明显；（2）发病时年龄超过了60岁；（3）发病的时间在5年之内；（4）情绪比较焦虑，担心认知下降；(5)和其他患者相比，认知功能下降更加明显；(6)有知情者能证实其记忆下降明显；(7)有载脂蛋白Eε4(APOEε4)基因型；(8)有生物标志性证据证实AD
。综上所述，ApoEε4基因是SCD患病的重要危险因素，ε4基因个数的增加会提高SCD的患病率。
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[作者简介]：胡勇，贵州医科大学在读硕士研究生，主要从事认知功能障碍临床和基础研究。