导读:本文包含了切口酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:定点整合,rDNA,人多能干细胞,TALE
切口酶论文文献综述
胡志青,吴涌,庞佳伦,周妙金,王晓琳[1]（2015）在《利用TALE切口酶促进人多能干细胞基因定点整合》一文中研究指出目的:干细胞因其具有快速自我更新能力和多向分化潜能,为以基因编辑为核心的基因治疗提供了理想的靶细胞来源。然而在干细胞中较低的基因打靶效率极大限制了基因治疗的临床转化。为了能够高效而且安全促进人多能干细胞外源基因定点整合,利用在类转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)基础上自主设计改造的TALE切口酶(TALENickases)针对血友病A病人特异性iPSCs(HA-iPSCs)的rDNA多拷贝位点、F 8原位位点进行基因打靶,以评估TALENickases应用于人多能干细胞rDNA区和原位基因打靶的可行性。方法:单用rDNA区或原位TALENs/TALENickases转染HEK293T细胞及HA-iPSCs,通过细胞凋亡检测、CCK8检测来比较不同组别之间细胞毒性;在此基础上,使用携带外源基因F8的载体与原位修复载体联合相对应位点的TALENickases共转染HA-iPSCs,筛选得到抗性克隆后进行鉴定。结果:(1)细胞毒性检测均显示rDNA区TALENickases相比TALENs毒性更低,而在原位TALENs相比TALENickases毒性较低;(2)iPSCs打靶结果显示在rDNA区TALENickases可显着提高7kb片段的定点整合效率,原位TALENickases也能有效促进基因定点整合。结论:在HA-iPSCs中,TALENickases可以有效促进多拷贝的rDNA位点与F8原位转基因的定点整合。由于TALENickases仅能产生单链断裂(single strand break,SSB),不易产生NHEJ介导的DNA修复,即不易引起indels的产生,对于基因组的影响更小,更有利于保持基因组的完整性。(本文来源于《第十四次全国医学遗传学学术会议论文汇编》期刊2015-11-01）
吴海波[2]（2015）在《TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究》一文中研究指出结核病是一种由结核分支杆菌在人与动物或者人与人之间传播引起的人畜共患病。牛结核病在全世界范围内传播严重的影响了人类健康和农业发展,特别是在亚洲和非洲的一些发展中国家,由于没有有效的政策和方案来消除或控制,结核病的危害尤其严重。因此控制和抵御结核菌传播的研究变的紧迫和重要。有文献报道小鼠SP110基因可以控制结核杆菌的生长并且诱导感染细胞凋亡,本研究的前期工作也确认SP110基因可以增强牛巨噬细胞的抗结核菌功能。因此本研究旨在通过TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因组上定点插入SP110基因,生产具有抵抗结核杆菌侵染功能的转基因牛。基因组编程酶TALEN能够在精确位点对基因组进行切割,因此被广泛用于基因功能研究以及转基因动物的生产。在过去的两年中,TALEN介导的基因敲除已有大量文献报道,但是基因敲入成功的例子却非常少;TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物并生产转基因动物,但是尚未见有TALEN介导基因敲入的转基因牛报道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在牛基因组上进行基因敲入,并生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。通过体外攻菌证明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖,结核杆菌侵染的转基因细胞会启动凋亡途径而不是坏死途径;通过体内攻菌以及细菌传染试验证明转基因牛可以有效的抵御结核杆菌的侵染。本研究的主要内容如下所示:1.针对牛28号染色体的表面活化蛋白A1(SFTPA1)和甲硫氨酸腺苷基转移酶I A(MAT1A)的基因间序列设计3对特异性的TALENs。使用荧光素酶单链退火实验在人的293-FT细胞中对TALENs的切割活性进行的了初步鉴定。随后用Surveyor酶切实验在牛的胎儿成纤维细胞中进行了进一步检测,以DNA切割后发生非同源末端连接修复的比率来表征TALENs的切割活性,结果表明所设计的叁对TALENs中,第二对TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一个点突变(第450位天冬氨酸突变为丙氨酸),该点突变可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影响TALEN二聚化以及DNA序列的识别,从而构建TALE核酸切口酶系统。DNA体外切割试验证明了该系统可以在预期的位点造成单链断裂,并具有将DNA修复途径限定为同源重组的能力。3.获得SP110定点打靶的阳性细胞克隆。通过junction PCR及Southern blot实验确认为定点打靶并且筛选出单等位基因打靶的细胞。以此细胞为核供体,通过体细胞核移植生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。4.对转基因牛的巨噬细胞进行体外攻菌试验,结果表明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖。利用流式细胞术分析攻菌后巨噬细胞的凋亡率和坏死率,发现结核杆菌侵染的普通巨噬细胞会启动坏死途径,而转基因牛巨噬细胞则会启动凋亡途径;使用支气管点滴法进行体内攻菌试验,尸检发现转基因牛脏器的病理得分以及荷菌数均明显低于普通牛;通过将转基因牛与结核病牛在密闭环境下共同饲养的方法进行模拟传染试验,皮试检测、伽马干扰素释放水平检测以及酶联免疫斑点检测均证明转基因牛具有拮抗结核菌的功能,尸检发现转基因牛脏器的病理得分显着低于普通牛。5.针对肌成束同源蛋白1(FSCN1)和肌动蛋白(ACTB)的基因间序列设计并构建3对TALENs并获得针对F-A位点打靶的单克隆细胞。通过序列相似性比对,在牛基因组上分别找了8个靶向M-S位点和F-A位点TALE切口酶的潜在脱靶位点并进行脱靶效应分析。在22株F-A位点打靶细胞和19株F-A位点打靶细胞中发现一株细胞克隆存在脱靶效应。说明TALE切口酶虽然可以在牛基因组上任意位点进行基因操作,但仍有可能会对细胞造成不可预知的损伤,因此在基因敲入前需要注意寻找可以容纳外源基因的“安全港湾”。本研究首次利用TALE切口酶对牛基因组进行基因敲入,并生产出具有抗结核病功能的转基因牛。研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义,同时为动物抗病育种提供新思路。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
朱桂池,杨用,张春阳[3]（2014）在《基于双功能链取代扩增及切口酶信号扩增技术对汞离子与银离子进行同时分析》一文中研究指出汞离子与银离子是两种常见的有毒金属污染物,能够对人体和水体生态系统造成严重的损害。基于双功能链取代扩增及切口酶信号扩增技术,我们发展了一种汞离子与银离子的同时检测方法。当加入待测离子后,双功能链取代扩增被启动,从而产生两条不同序列的寡核苷酸链。然后,扩增出的寡核苷酸链可以去结合相应的淬灭团-荧光团探针,形成两条不同的双链DNA。接着,两条双链DNA将分别被两种切口酶识别并进行切割,造成淬灭团和荧光团的分离,进而产生不同发射光谱的荧光信号。这一新方法具备高灵敏度的优点,汞离子与银离子的检测底限浓度分别达到了2 pM和16 pM。此方法能够被应用于实际水样的分析,在环境保护与食品安全领域具有广阔的应用前景。(本文来源于《中国化学会第29届学术年会摘要集——第04分会：纳米生物传感新方法》期刊2014-08-04）
切口酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
结核病是一种由结核分支杆菌在人与动物或者人与人之间传播引起的人畜共患病。牛结核病在全世界范围内传播严重的影响了人类健康和农业发展,特别是在亚洲和非洲的一些发展中国家,由于没有有效的政策和方案来消除或控制,结核病的危害尤其严重。因此控制和抵御结核菌传播的研究变的紧迫和重要。有文献报道小鼠SP110基因可以控制结核杆菌的生长并且诱导感染细胞凋亡,本研究的前期工作也确认SP110基因可以增强牛巨噬细胞的抗结核菌功能。因此本研究旨在通过TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因组上定点插入SP110基因,生产具有抵抗结核杆菌侵染功能的转基因牛。基因组编程酶TALEN能够在精确位点对基因组进行切割,因此被广泛用于基因功能研究以及转基因动物的生产。在过去的两年中,TALEN介导的基因敲除已有大量文献报道,但是基因敲入成功的例子却非常少;TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物并生产转基因动物,但是尚未见有TALEN介导基因敲入的转基因牛报道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在牛基因组上进行基因敲入,并生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。通过体外攻菌证明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖,结核杆菌侵染的转基因细胞会启动凋亡途径而不是坏死途径;通过体内攻菌以及细菌传染试验证明转基因牛可以有效的抵御结核杆菌的侵染。本研究的主要内容如下所示:1.针对牛28号染色体的表面活化蛋白A1(SFTPA1)和甲硫氨酸腺苷基转移酶I A(MAT1A)的基因间序列设计3对特异性的TALENs。使用荧光素酶单链退火实验在人的293-FT细胞中对TALENs的切割活性进行的了初步鉴定。随后用Surveyor酶切实验在牛的胎儿成纤维细胞中进行了进一步检测,以DNA切割后发生非同源末端连接修复的比率来表征TALENs的切割活性,结果表明所设计的叁对TALENs中,第二对TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一个点突变(第450位天冬氨酸突变为丙氨酸),该点突变可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影响TALEN二聚化以及DNA序列的识别,从而构建TALE核酸切口酶系统。DNA体外切割试验证明了该系统可以在预期的位点造成单链断裂,并具有将DNA修复途径限定为同源重组的能力。3.获得SP110定点打靶的阳性细胞克隆。通过junction PCR及Southern blot实验确认为定点打靶并且筛选出单等位基因打靶的细胞。以此细胞为核供体,通过体细胞核移植生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。4.对转基因牛的巨噬细胞进行体外攻菌试验,结果表明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖。利用流式细胞术分析攻菌后巨噬细胞的凋亡率和坏死率,发现结核杆菌侵染的普通巨噬细胞会启动坏死途径,而转基因牛巨噬细胞则会启动凋亡途径;使用支气管点滴法进行体内攻菌试验,尸检发现转基因牛脏器的病理得分以及荷菌数均明显低于普通牛;通过将转基因牛与结核病牛在密闭环境下共同饲养的方法进行模拟传染试验,皮试检测、伽马干扰素释放水平检测以及酶联免疫斑点检测均证明转基因牛具有拮抗结核菌的功能,尸检发现转基因牛脏器的病理得分显着低于普通牛。5.针对肌成束同源蛋白1(FSCN1)和肌动蛋白(ACTB)的基因间序列设计并构建3对TALENs并获得针对F-A位点打靶的单克隆细胞。通过序列相似性比对,在牛基因组上分别找了8个靶向M-S位点和F-A位点TALE切口酶的潜在脱靶位点并进行脱靶效应分析。在22株F-A位点打靶细胞和19株F-A位点打靶细胞中发现一株细胞克隆存在脱靶效应。说明TALE切口酶虽然可以在牛基因组上任意位点进行基因操作,但仍有可能会对细胞造成不可预知的损伤,因此在基因敲入前需要注意寻找可以容纳外源基因的“安全港湾”。本研究首次利用TALE切口酶对牛基因组进行基因敲入,并生产出具有抗结核病功能的转基因牛。研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义,同时为动物抗病育种提供新思路。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
切口酶论文参考文献
[1].胡志青,吴涌,庞佳伦,周妙金,王晓琳.利用TALE切口酶促进人多能干细胞基因定点整合[C].第十四次全国医学遗传学学术会议论文汇编.2015
[2].吴海波.TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究[D].西北农林科技大学.2015
[3].朱桂池,杨用,张春阳.基于双功能链取代扩增及切口酶信号扩增技术对汞离子与银离子进行同时分析[C].中国化学会第29届学术年会摘要集——第04分会：纳米生物传感新方法.2014