导读:本文包含了可溶性融合蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:可溶性CD95-Fc,异天冬氨酸,脱酰胺修饰,反相高效液相色谱
可溶性融合蛋白论文文献综述
于雷,陶磊,毕华,李响,饶春明[1]（2019）在《RP-HPLC法测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸的含量》一文中研究指出目的测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸(IsoAsp)含量。方法采用ISOQUANT悖异天冬氨酸检测试剂盒结合反相高效液相色谱法测定样品中IsoAsp含量,采用Phenomenex Synergi 4μm Hydro RP-80 C18色谱柱(150 mm×3 mm,4μm),以7.9 mmol/L磷酸二氢钾-1.1 mmol/L磷酸氢二钾-10%甲醇为流动相A,以甲醇为流动相B,梯度洗脱,流速为0.43 mL/min。结果对照品和3批原液中IsoAsp含量相近(0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc),3批成品中IsoAsp含量明显增高(0.51～0.53 mol/mol sCD95-Fc);25℃和37℃处理24 h后成品中IsoAsp含量无明显变化,60℃处理后明显增加。结论该法适用于可溶性CD95-Fc融合蛋白中IsoAsp含量检测,高温处理可加快样品中IsoAsp生成。(本文来源于《中国医药导报》期刊2019年06期）
陈晶,吴俊,曹江[2]（2018）在《可有效结合肿瘤细胞的重组可溶性PD-1/TIM-3融合蛋白》一文中研究指出背景:PD-1(programmed cell death-1)和TIM-3(T-cell immunoglibulin and musin-3)是两类负性调节T细胞免疫功能的免疫检查点,肿瘤细胞通过表达相应配体抑制T细胞免疫功能而产生免疫逃逸,阻断其受体-配体相互作用可解除免疫抑制从而清除肿瘤细胞,但在单一的免疫检查点抑制治疗中,肿瘤细胞可通过活化其他免疫抑制通路产生耐药性。研究目的:制备一种重组的可溶性PD-1/TIM-3融合蛋白,使与肿瘤细胞表面的两类相应受体相结合,以用于进一步对T细胞免疫抑制解除和对肿瘤细胞自身作用的研究。材料和方法:设计并合成含有人源可溶性PD-1、TIM-3、分泌肽、铰链区及6xHis标签的表达序列,将该片段克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl并进行重组慢病毒的包装,并感染HEK293T细胞,根据细胞荧光及Western blot结果筛选高表达重组融合蛋白的稳定转染细胞,利用细胞免疫荧光检测重组融合蛋白与肿瘤细胞表面相应配体PD-L1、PD-L2、Galactin-9的结合能力,并以冻干、透析、Ni-NTA琼脂糖凝胶对细胞培养上清中的sPIT3进行纯化,通过SDS-PAGE鉴定所纯化蛋白。结果:通过分子克隆及重组慢病毒的包装与感染,成功获得了高表达重组融合蛋白的稳定转染HEK293T细胞株;通过RT-PCR筛选了高表达Galactin-9的SW620结肠癌细胞,同时中等水平表达PD-L1、PD-L2、Galactin-9的MDA-MB-231乳腺癌细胞,以及低表达PD-L1、PD-L2、Galactin-9的PC-3前列腺癌细胞,在细胞免疫荧光中检测到的荧光强度与各肿瘤细胞表面配体的表达水平相符,叁种细胞达到同等荧光强度时的曝光时间分别为4.1s,6.0s,11.4s。结论:重组sP1T3融合蛋白可特异性地与表达PD-1和TIM-3对应配体的肿瘤细胞结合,为进一步探究其作用与机制建立了基础。(本文来源于《浙江省免疫学会第六次会员代表大会暨第十一次学术大会论文汇编》期刊2018-11-16）
于雷,陶磊,李响,郭莹,饶春明[3]（2018）在《液质联用技术分析可溶性CD95-Fc融合蛋白N-糖组成》一文中研究指出目的:分析鉴定可溶性CD95-Fc融合蛋白的N-糖组成。方法:采用Glyco Works Rapi Fluor-MS N-糖分析试剂盒酶解并标记、纯化N-糖基,糖基纯化产物经Waters BEH Glycan糖蛋白分析柱分离后,依次进入荧光检测器和飞行时间质谱仪检测。结果:结合荧光和质谱检测结果,鉴定出15种糖型:G0-GN,G0FGN,G0,G0F,Man5,G1F,G1F,G2F,G2F+SA,G2F+SA,G3F,G2F+2SA,G3F+SA,G3F+2SA和G3F+3SA;各糖型组分实测单同位素分子量与理论值差异均不足0.1Da;所占比例最高的糖型依次为G0F(30%),G1F(25%),G2F+SA(14%)和G2F(13%);不同批次相同糖基组分保留时间的RSD均低于0.2%,峰面积百分比的RSD均低于15%。结论:本研究成功鉴定出可溶性CD95-Fc融合蛋白的15种主要糖型,不同批次的糖型荧光图谱基本一致,可作为UPLC法对可溶性CD95-Fc融合蛋白N-糖定性定量的标准参考图谱。(本文来源于《中国新药杂志》期刊2018年13期）
付大伟,陈启蒙,徐伟[4]（2018）在《融合蛋白Trx-T4 DL可溶性表达、纯化与其生物活性应用》一文中研究指出构建含SUMO、IF2、GST、Nus A、Msy B、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,转化到大肠杆菌E.coli Transetta(DE3)中进行自诱导(auto-induction,AI)表达,以提高T4 DNA连接酶(T4 DL)的表达产量。通过磁珠法检测融合蛋白的可溶性表达情况,10%SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Transetta(DE3)(p NBEVII-T4 DL)诱导表达的可溶性融合蛋白Trx-T4 DL的产量最多,经诱导培养条件优化后,Trx-T4 DL的可溶性大幅度提高,确定了最佳诱导条件为30℃、装瓶量50 m L/250 m L、接种量2‰、p H7。分别用镍柱和Mag Ni磁珠纯化重组菌破碎后上清中的融合蛋白Trx-T4 DL,结果显示后者纯化效率更高,最终获得的融合蛋白浓度为1700.462 mg/L。与其他公司T4 DL活性进行比较,检测其酶活性约为500 U/μL,并使其成功应用于低背景重组克隆载体构建中,为融合蛋白Trx-T4 DL的生产及应用提供理论基础。(本文来源于《食品工业科技》期刊2018年07期）
贾长增[5]（2017）在《促进curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达研究》一文中研究指出目的:麻疯树毒蛋白-转铁蛋白受体结合肽(curcin-TfRBP9)融合蛋白在原核表达系统中以包涵体形式表达,且复性较为困难。本论文通过采用类弹性蛋白表达系统及小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)等途径,构建多种重组表达载体,探讨其对实现curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达的可行性,为实现规模化制备curcin-TfRBP9蛋白提供高效的表达纯化工艺,为麻风树毒蛋白(curcin)的研究与应用打下一个基础。方法:1.采用PCR技术分别扩增curcin和curcin-TfRBP9基因,经限制性内切酶消化及连接,将curcin和curcin-TfRBP9基因分别克隆到类弹性蛋白表达载体pET-ELP-Intein,构建重组表达载体pET-ELP-Intein-curcin和pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9。2.重组表达载体pET-ELP-Intein-curcin和pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9转化表达菌株E.coli BLR(DE3);菌落PCR筛选重组子,DNA测序鉴定。3.BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin,BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9经低温渗透表达及可逆相变循环(ITC),纯化分析curcin和curcin-TfRBP9蛋白的可溶性表达。4.构建pQE-30-sumo-curcin-TfRBP9,pQE-30-GST-sumo-curcin-TfRBP9表达载体,分别转化表达菌株E.coli M15,菌落PCR鉴定,诱导表达,筛选重组子,基因测序分析。重组子经IPTG低温诱导表达分析融合蛋白可溶性表达。5.融合蛋白GST-sumo-curcin-TfRBP9经Glutathione Sepharose 4B柱,sumo特异性酶消化,CM SepharoseTM Fast Flow纯化后,MTT检测curcin-TfRBP9蛋白对肿瘤细胞的抑制作用。结果:含有表达质粒的菌株BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin,BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9在TB培养基中培养,在OD600=0.6-0.8时,将菌体的培养条件转变为18℃220rpm低温渗透表达融合蛋白,经基于类弹性蛋白的可逆相变循环(ITC)纯化,及12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析,未发现curcin和curcin-TfRBP9蛋白的可溶性表达。两株含有不同重组质粒的菌株E.coli M15/pQE-30-sumo-curcin-TfRBP9,E.coli M15/pQE-30-GST-sumo-curcin-TfRBP9在LB培养基中经1mmol IPTG终浓度在低温诱导表达,表达产物的上清和沉淀经12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析,sumo-curcin-TfRBP9融合蛋白主要以包涵体的形式表达,而GST-sumo-curcin-TfRBP9融合蛋白显示很强的可溶性表达。在30℃是的可溶性比例可以占目的蛋白的55%以上。融合蛋白GST-sumo-curcin-TfRBP9经Glutathione Sepharose 4B柱,sumo特异性酶消化,CM SepharoseTM Fast Flow纯化后,可溶性的curcin-TfRBP9融合蛋白被收获,MTT实验结果显示,同剂量浓度时curcin-TfRBP9与curcin相比,对高表达TfR的A549细胞有着显着抑制作用,而在对LO-2细胞的抑制率上没有显着差异。相比LO-2细胞Curcin-TfRBP9对A549细胞有更强的抑制作用。结论:使用类弹性蛋白表达系统和单独使用sumo标签系统未发现促进curcin-TfRBP9的可溶性表达,而GST和SUMO标签联合应用可显着促进curcin-TfRBP9的可溶性表达;融合蛋白GST-sumo-curcin-Tf RBP9经酶切消化和纯化后,可溶性curcin-TfRBP9蛋白被收获;curcin-TfRBP9对TfR高表达的肿瘤细胞的抑制作用与curcin相比有显着差异。(本文来源于《暨南大学》期刊2017-04-01）
邓斌[6]（2016）在《新型可溶性融合蛋白TAT-PEP对SD大鼠缺血性脑损伤的保护作用及相关机制研究》一文中研究指出脑缺血再灌注损伤为脑中风、脑创伤、脑肿瘤等很多疾病的基本病理生理学基础。在缺血中心区周围,损伤的脑组织具有一定恢复和修复能力,这部分可以被“挽救”的脑组织称为缺血半暗带(Ischemic penumbra,IP),是治疗缺血性脑血管病竭力挽救的区域,也成为临床治疗脑卒中的关键区域。研究表明,近年来新发现的髓磷脂相关抑制因子的共受体,即成对性免疫球蛋白样受体B(Paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)在脑缺血再灌注损伤后损伤区内表达上调可能是导致轴突再生抑制、突触可塑性下降和加重神经元损伤的重要因素之一。因此,阻断Pir B受体信号通路是促进轴突再生、突触可塑性恢复和神经元存活的有效途径。然而,基因水平干涉或抑制Pir B表达很难应用于临床实践,而蛋白质药物虽然可以较好的临床应用,但因其分子量较大,往往难以通过血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)在脑损伤区内发挥作用,影响了治疗效果。在本研究中,我们首先利用MCAO模型,发现神经元Pir B在SD大鼠大脑皮层IP内表达显着上调,并持续至再灌注后第28 d。体外实验进一步发现,通过pirb RNAi干涉Pir B表达后,可以促进氧糖剥夺后神经元轴突生长和神经元存活。随后,我们利用蛋白转导技术和重组蛋白融合技术将转录反式激活因子(Trans-activator of transcription,TAT)转导蛋白结构与Pir B受体胞外段(Pir B extracellular peptide,PEP)重组,制备并表达了新型可溶性融合蛋白TAT-PEP。体外实验表明,其与MAG、OMgp、Nogo-A具有较好的亲和力,并可以逆转它们的抑制效应,促进轴突生长。体内实验显示,其经腹腔注射后可以通过BBB并分布于皮层IP内。TAT-PEP能够减少MCAO后脑梗死容积,促进MCAO后模型动物长期的神经功能恢复。研究进一步发现,TAT-PEP可以促进轴突再生和皮质脊髓束重塑,加强突触可塑性。体外实验也证实,TAT-PEP能够促进OGD后神经突起生长,减轻生长锥崩溃瓦解。这些作用的机制可能与TAT-PEP通过阻遏髓磷脂抑制因子与Pir B的结合,抑制下游分子POSH和Rho A表达,进而促进GAP43表达有关。此外,我们还发现TAT-PEP可以通过减轻缺血再灌注后神经元变性和凋亡,发挥神经保护作用,其机制可能与TAT-PEP通过影响Bax和Bcl-2表达,进而抑制线粒体相关的Caspase3活化有关。这些发现提示,缺血再灌注损伤后神经元Pir B呈现高表达,对神经元造成严重损害。TAT-PEP通过阻遏MAG、OMgp、Nogo-A与Pir B的作用,进而抑制Pir B功能,发挥神经保护作用。综上所述,该研究明确了Pir B在SD大鼠大脑皮层半暗带内的时空表达变化,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的靶点;首次提出并证实通过制备含有Pir B胞外段的新型融合蛋白TAT-PEP,阻遏Nogo-A、MAG、OMgp与Pir B的作用,从而促进缺血再灌注后神经功能恢复,为临床上促进缺血性脑损伤后神经功能恢复和缺血性脑卒中的治疗提供了新的策略;首次探讨并阐明TAT-PEP促进脑缺血再灌注损伤后轴突再生,突触可塑性恢复,皮质脊髓束重塑以及减轻神经元凋亡的作用及相关机制,为TAT-PEP可能的临床应用提供了理论依据和实验基础。第一部分Pir B在SD大鼠大脑皮层半暗带内的时空表达及干涉Pir B表达对氧糖剥夺后皮层神经元损伤的改善作用目的:1.明确SD大鼠MCAO模型大脑皮层半暗带内Pir B的时空表达情况。2.干涉Pir B表达对氧糖剥夺后神经元轴突生长的作用。3.干涉Pir B表达对氧糖剥夺后神经元存活和凋亡的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为8组,每组10只,分为正常对照组(Normal组,没有任何处理),假手术组(Sham组,只分离血管但不留置线栓)和模型组(MCAO组,根据实验的时间点分为1 d post-MCAO组,3 d post-MCAO组,7 d post-MCAO组,14 d post-MCAO组,21 d post-MCAO组,28 d post-MCAO组)。由于MCAO模型造膜成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用的动物样本量为6只,即每组n=6,随机抽取。Western Blot检测MCAO后不同时间点大脑皮层半暗带内Pir B蛋白表达。其中,Normal组和Sham组在MCAO后1 d时取材,其余各组分别在MCAO后第1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,28 d时取材。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为2组,每组10只,根据1实验的结果,分为假手术组(Sham组,只分离血管但不留置线栓)和模型组(MCAO组)。由于MCAO模型造膜成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用的动物样本量为6只,即每组n=6,随机抽取。于再灌注后第28 d时应用免疫荧光组织化学双标记染色方法检测大脑皮层半暗带内Pir B蛋白的表达和定位。3.pirb基因干涉靶点筛选与慢病毒包装由上海英为信生物科技有限公司完成。SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,Western blot分别检测神经元Pir B表达和GFP表达。4.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,免疫荧光细胞化学染色检测神经元轴突长度。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+control RNAi组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d鉴定后,行OGD,复氧复糖后转染GPH-PIRB-294慢病毒,在OGD复氧复糖72 h时,MTT检测神经元神经元活力,TUNEL染色检测神经元凋亡情况。结果:1.再灌注后第1 d时,Normal组和Sham组的Pir B表达没有统计学差异(p>0.05)。与Sham组相比,1 d post-MCAO组,3 d post-MCAO组,7 d post-MCAO组,14 d post-MCAO组,21 d post-MCAO组,28 d post-MCAO组大脑皮层半暗带内Pir B蛋白表达明显增加(p<0.05)。双重荧光免疫组织化学染色进一步显示,与Sham组相比,再灌注后28 d时实验动物大脑皮层半暗带内Pir B表达显着增加(p<0.05),且与Neu N呈现明显的双标记,提示在缺血再灌注后28 d时实验动物大脑皮层半暗带内神经元Pir B表达显着增加。2.Western blot结果显示,与Normal组相比,OGD后第72 h时,OGD组和OGD+control RNAi组神经元Pir B表达明显增加(p<0.05)。与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组神经元Pir B表达明显减少(p<0.05)。3.免疫荧光细胞化学染色结果显示,与Normal组相比,OGD后第72 h时,OGD组和OGD+control RNAi组神经元最长突起即轴突的平均长度明显变短(p<0.05)。与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组神经元神经元轴突长度明显变长(p<0.05)。4.在OGD后72 h时,应用MTT比色法检测神经元细胞活力,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显着降低(P<0.05),与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组的MTT相对比色值增加(P<0.05)。与OGD组相比,OGD+control RNAi组的MTT相对比色值没有统计学意义(P>0.05)。在OGD后72 h时,OGD组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+pirb RNAi组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显减少(P<0.05),与OGD组相比,OGD+control RNAi组的TUNEL阳性神经元的细胞数目没有统计学意义(P>0.05)。结论:通过制备SD大鼠MCAO模型,发现在MCAO后28 d内大脑皮层半暗中PirB表达都明显升高;通过干涉神经元Pir B表达的慢病毒系统,发现抑制OGD后神经元Pir B表达,可以有效促进轴突生长,增强神经元活力,减轻神经元凋亡。该部分结果不仅阐明了Pir B在SD大鼠MCAO模型大脑半暗带内的表达变化趋势,还证实了Pir B在神经元OGD后的作用及功能,为脑缺血再灌注损伤的机制研究提供了新的理论基础和实验依据,为其防治策略的研究提供了新的思路和新的靶点。第二部分可溶性融合蛋白TAT-PEP的制备、表达、纯化及生物学活性的鉴定目的:1.可溶性融合蛋白TAT-PEP的制备、表达、纯化。2.可溶性融合蛋白TAT-PEP生物学活性的鉴定。方法:1.可溶性融合蛋白TAT-PEP制备由南京金斯瑞科技有限公司完成。用GE公司蛋白纯化系统纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western blot检测纯化后的TAT-PEP。SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),原代培养的皮层神经元随机分为5组,即Normal组,TAT-m PEP(100μg/L)组,TAT-PEP(50μg/L)组,TAT-PEP(100μg/L)组,TAT-PEP(200μg/L)。原代培养的皮层神经元给予蛋白处理后3 d时,MTT检测神经元活力;LDH释放实验检测神经元存活。2.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。将Nogo-A(AP-Nogo-66,R&D,300 ng/spot);MAG(MAG-Fc,R&D,150 ng/spot);OMgp(AP-OMgp,R&D,300 ng/spot)以50μg/well分别包被于96孔板中,4℃孵育24 h,按浓度梯度分别加入0,0.005,0.01,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32μmol/L TAT-PEP或者TAT-m PEP,并设PBS对照,37℃孵育4 h,随后加入兔抗(His)6多克隆抗体及羊抗兔Ig G二抗,ELISA法检测吸光度(OD)值。3.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。将Nogo-A(AP-Nogo-66),MAG(MAG-Fc),OMgp(AP-OMgp)(50 ng/well)分别或混合(MAIs)包被24孔板的玻片中,在4℃条件下孵育24 h。之后按50μg/L,100μg/L,200μg/L分别加入TAT-PEP或TAT-m PEP(500μl),37℃孵育2 h,接种皮层神经元,培养至第7 d时免疫荧光细胞化学染色检测神经元最长突起的平均长度。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g。造模成功的大鼠随机分为4组,每组4只,即0 mg/kg TAT-PEP组,0.05 mg/kg TAT-PEP组,0.5 mg/kg TAT-PEP组和1.0 mg/kg TAT-PEP组。根据前期研究及预实验结果,在MCAO后立刻给予0 mg/kg(为蛋白稀释液即叁蒸水),0.05 mg/kg,0.5 mg/kg和1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,并于注射后24 h时行免疫荧光组织化学染色检测TAT-PEP在皮层半暗带的分布及蛋白量。5.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g。造模成功的大鼠随机分为7组,每组4只,即TAT-PEP腹腔注射后0 h组,0.5 h组,2 h组,12 h组,24 h组,48 h组和72 h组。在再灌注后立刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射(根据上述免疫荧光组织化学染色结果),并于注射后0 h,0.5 h,2 h,12 h,24 h,48 h和72 h后Western Blot检测TAT-PEP在皮层半暗带的蛋白量。结果:1.考马斯亮蓝染色及Western blot结果显示,TAT-PEP的分子量约为90KDa,与预期相符合。2.各组MTT实验相对OD值没有统计学差异(P>0.05),LDH释放量相对值也没有统计学差异(P>0.05)。3.ELISA结果显示,与TAT-m PEP组相比,不同浓度TAT-PEP与Nogo-A(Nogo66)反应后,其OD值呈现明显的剂量效应关系,说明TAT-PEP与Nogo-A(Nogo66)分子有很好的结合能力。还发现不同浓度TAT-PEP与商品化的MAG,OMgp反应后,其OD值也呈现明显的剂量效应关系。4.与Normal组相比,Nogo-A(Nogo66)组神经元最长突起的平均长度明显缩短(P<0.05),而TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度与Nogo-A(Nogo66)组相比明显变长(P<0.05),TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与Nogo-A(Nogo66)组相比没有统计学意义(P>0.05)。实验进一步观察到,与Normal组相比,MAG组神经元最长突起的平均长度明显缩短(P<0.05),而TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度与MAG组相比明显变长(P<0.05),TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与MAG组相比没有统计学意义(P>0.05)。OMgp组别也观察到类似的现象。5.MAIs(Nogo66+MAG+OMgp)组与Normal组相比,神经元最长突起的平均长度明显缩短,TAT-m PEP组神经元最长突起的平均长度与MAIs组相比没有统计学意义(P>0.05)。与MAIs组相比,50μg/L的TAT-PEP处理组后,神经元最长突起的平均长度明显变长(P<0.05),100μg/L的TAT-PEP组与50μg/L的TAT-PEP组相比,神经元最长突起的平均长度明显变长(P<0.05),而200μg/L的TAT-PEP组与100μg/L的TAT-PEP组相比神经元最长突起的平均长度没有统计学意义(P>0.05)。6.免疫荧光组织化学染色结果显示,0 mg/kg TAT-PEP组未检测到(His)6阳性反应物,0.05 mg/kg TAT-PEP组仅检测到少量的(His)6阳性反应物,0.5 mg/kg TAT-PEP组和1.0 mg/kg TAT-PEP组检测到大量的(His)6阳性反应物,1.0 mg/kg TAT-PEP组的(His)6阳性反应物要多于0.5 mg/kg TAT-PEP组(P<0.05)。7.Western blot结果显示,蛋白注射后12 h时,皮层内TAT-PEP水平达峰值,24h时明显减少,随着时间的推移其量逐渐下降。结论:本部分实验通过成功制备含有TAT结构,(His)6和Pir B胞外段结构的可溶性融合蛋白TAT-PEP,证实其能够与Nogo-A(Nogo66)、MAG、OMgp结合并逆转他们的抑制效应。该实验还表明TAT-PEP腹腔注射后,TAT结构能够使TAT-PEP融合蛋白有效通过血脑屏障,并且分布于皮层半暗带内。同时,该实验也明确了蛋白的给药时间,即每日腹腔注射浓度为1.0 mg/kg的TAT-PEP,为下一步TAT-PEP的功能研究奠定了基础。第叁部分TAT-PEP对SD大鼠MCAO后脑梗死容积和神经功能的影响目的:1.研究TAT-PEP对局灶性脑缺血损伤后脑梗死容积的作用。2.研究TAT-PEP对局灶性脑缺血损伤后神经功能恢复的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行Garcia评分和TTC染色实验。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行神经功能缺损评分和磁共振成像实验。3.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行错步分析实验、转轴实验。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。各组实验动物在相应时间点分别进行肢体放置实验和运动诱发电位实验。结果:1.MCAO后24 h的Garcia评分结果显示,与Sham组相比,MCAO组神经功能评分显着降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组神经功能评分没有显着差异(P>0.05)。MCAO后48 h和72 h的Garcia评分结果显示,与Sham组相比,MCAO组神经功能评分显着降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组神经功能评分显着提高(P<0.05)。TTC染色结果显示,MCAO后72 h时,与Sham组相比,MCAO组实验动物出现明显的脑梗死。与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组实验动物脑梗死容积明显变小(P<0.05)。2.MCAO后3 d,7 d和28 d的T2WI图像显示,MCAO组脑缺血侧有明显的高密度影区,而MCAO+TAT-PEP组脑缺血侧的高密度影区较MCAO组有所减少(P<0.05)。MCAO后7 d,14 d,21 d和28 d时各组的m NSS评分结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的m NSS评分显着增加(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组各时间点的m NSS评分显着降低(P<0.05)。3.错步分析结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的错步次数显着增加(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在7 d,14 d,21 d和28 d的错步次数显着降低(P<0.05),而第在2 d时与MCAO组相比没有统计学差异(P>0.05)。转轴实验结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的在转轴上停留的时间显着减少(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在7 d,14 d,21 d和28 d的在转轴上停留的时间显着增加(P<0.05),而第在2 d时与MCAO组相比没有统计学差异(P>0.05)。肢体放置结果显示,与Sham相比,MCAO组各时间点的肢体放置评分明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组在MCAO后7 d,14 d,21 d和28 d时肢体放置评分明显增加(P<0.05),在MCAO后2 h时没有明显差别(P>0.05)。4.运动诱发电位(MEP)结果显示,在MCAO后28 d时,与Sham相比,MCAO组左前肢体MEP的振幅明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组左前肢体MEP的振幅明显增加(P<0.05);与Sham相比,MCAO组左后肢体MEP的振幅明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,MCAO+TAT-PEP组左后肢体MEP的振幅明显增加(P<0.05)。结论:本部分实验主要通过核磁共振成像技术和多种神经行为学方法,明确了TAT-PEP可以显着促进实验动物MCAO后感觉和运动功能的恢复,为TAT-PEP的可能的临床应用奠定了实验基础,也为下一步的机制研究提供了丰富线索。第四部分TAT-PEP对脑缺血再灌注损伤后轴突再生、皮质脊髓束和突触可塑性重塑的作用及机制研究目的:1.研究TAT-PEP对MCAO后皮质脊髓束重塑的作用。2.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内轴突再生的作用。3.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内突触可塑性的作用。4.研究TAT-PEP对OGD后神经元轴突生长和生长锥瓦解的作用。5.阐明TAT-PEP上述作用的分子机制。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注14 d时进行BDA皮层定位注射,在再灌注后21 d时,观察注射区的BDA被神经元摄取情况。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注14 d时进行BDA皮层定位注射,在再灌注后28 d时,观察皮质脊髓束重塑情况。3.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,观察大脑皮层半暗带内NF200,MAP2,SYN表达情况。4.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,Western blot观察大脑皮层半暗带组织内POSH,Rho A,GAP43,GAPDH表达情况。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元接种24 h后,行OGD。OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,24 h后利用活细胞工作站观察神经元轴突生长和分支点数量情况。6.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,3 d后利用明场显微镜观察神经元最长神经突起的平均长度和最长神经突起的分支点点数量。7.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,3 d后利用GAP43抗体行免疫荧光细胞化学染色观察生长锥情况。8.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d)。原代培养的皮层神经元随机分为4组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP组和OGD+pirb RNAi组。原代培养的皮层神经元至第7 d时,行OGD,OGD复氧复糖后即刻给予TAT-PEP(100μg/L)处理,之后第3 d时应用Western blot检测TAT-PEP对神经元POSH,Rho A,GAP43表达的作用。结果:1.在MCAO后14 d时,神经轴突示踪剂由未损伤的皮层处注入。在MCAO后21 d时,注射区的BDA被神经元及轴突摄取,注射区内大脑皮层的神经元锥体细胞及其轴突呈现广泛的BDA阳性荧光显影,且存在大量Neu N与BDA双标记的神经元,说明示踪剂注射成功。在MCAO后28 d时,被摄取的BDA沿着皮质脊髓束长距离顺行传输到颈膨大处。MCAO+TAT-PEP组中,检测皮质脊髓束在同侧灰质中的BDA阳性纤维密度明显高于MCAO组(P<0.05),其新生轴突横穿中线到达对侧的数量也明显多于MCAO组(P<0.05)。2.在MCAO后28 d时的NF200与Neu N免疫荧光双标记实验显示,MCAO组半暗带内NF200表达低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内NF200表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。3.在MCAO后28 d时MAP2免疫荧光单标记实验显示,MCAO组半暗带内MAP2表达低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内MAP2表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。4.在MCAO后28 d时的SYN与Neu N免疫荧光双标记实验显示,SYN表达于神经元胞体周围,MCAO组半暗带内SYN表达明显低于Sham组(P<0.05),MCAO+TAT-PEP组中半暗带内SYN表达则明显高于MCAO组(P<0.05)。5.MCAO后28 d时MCAO组POSH和Rho A的表达显着高于Sham组(P<0.05),而GAP43的表达显着低于Sham组(P<0.05)。与此相反,MCAO+TAT-PEP组POSH和Rho A的表达显着低于MCAO组(P<0.05),而GAP43的表达显着高于MCAO组(P<0.05)。6.活细胞工作站观察TAT-PEP对神经元轴突生长和分支形成的作用。结果显示,OGD+TAP-PEP组神经元最长突起在单位时间内的生长情况明显优于OGD组(P<0.05),同时该组神经元最长突起上的分支点数量明显多于OGD组(P<0.05)。7.在OGD后3 d时,明场显微镜观察结果显示,OGD组神经元最长突起的平均长度显着短于Normal组(P<0.05),而OGD+TAT-PEP组神经元最长突起的平均长度则显着长于OGD组(P<0.05),研究进一步发现OGD组神经元最长突起的分支点数量显着少于Normal组(P<0.05),而OGD+TAT-PEP组神经元最长突起的分支点数量则显着多于OGD组(P<0.05)。8.在OGD后3 d时,Normal组神经元生长锥崩溃瓦解水平仅为20%,而OGD组生长锥崩溃瓦解水平则可达到60%,显着高于Normal组(P<0.05),OGD+TAP-PEP组生长锥崩溃瓦解水平为38%,显着低于OGD组(P<0.05)。9.OGD后3 d时Western blot结果显示,OGD组POSH和Rho A的表达显着高于Normal组(P<0.05),而GAP43的表达显着低于Normal组。与此相反,OGD+TAT-PEP组和OGD+pirb RNAi组POSH和Rho A的表达显着低于OGD组,而GAP43的表达显着高于OGD组(P<0.05)。而OGD+TAT-PEP组与OGD+pirb RNAi组中神经元POSH、Rho A和GAP43的表达没有显着差异(P>0.05)。结论:本部分实验通过在体MCAO模型和离体OGD模型,利用顺行神经示踪技术、免疫荧光组织化学染色方法,活细胞工作站及神经电生理等多种方法,发现并证实TAT-PEP可以通过干预Pir B下游的POSH/ROCK/GAP43信号通路,促进MCAO后大脑皮层半暗带内轴突再生和突触可塑性恢复,促进皮质脊髓束的重塑,从而发挥改善神经功能特别是感觉和运动功能的作用。该部分研究不仅阐明了TAT-PEP发挥神经保护作用的部分机制,还间接揭示了Pir B在脑缺血再灌注损伤中的作用和机制,为缺血性脑中风的治疗提供了新的作用靶点,为TAT-PEP可能的临床应用提供了理论依据和实验基础。第五部分TAT-PEP对脑缺血再灌注损伤后皮层半暗带内神经元变性和凋亡的作用及机制研究目的:1.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内神经元存活及凋亡的作用。2.研究TAT-PEP对MCAO后半暗带内神经元超微结构的作用。3.研究TAT-PEP对OGD后神经元存活及凋亡的作用,并探讨相关机制。方法:1.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,分别进行Nissl,FJC及免疫荧光组织化学染色。2.健康雄性SD大鼠,体重为280 g-320 g,随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,进行TUNEL染色。3.实验动物随机分为3组,每组10只。由于MCAO模型造模成功率约为70%,所以在实验中进行相关检测时各组实际使用动物样本量为6只。3组分别为Sham组,MCAO组,MCAO+TAT-PEP组。MCAO+TAT-PEP组在再灌注即刻给予1.0 mg/kg的TAT-PEP腹腔注射,之后每日注射该浓度的TAT-PEP。在再灌注后28 d时,制备超薄切片,在电镜下观察神经元超微结构。4.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为6组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP(50μg/L)组,OGD+TAT-PEP(100μg/L)组,OGD+TAT-PEP(200μg/L)组,OGD+TAT-m PEP(100μg/L)组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP或TAT-m PEP处理。MTT及LDH释放实验检测不同浓度TAT-PEP对OGD后24 h时神经元存活的作用。5.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为4×3组(n=6):即Normal组,OGD组,OGD+TAT-PEP(100μg/L)组和OGD+TAT-m PEP(100μg/L)组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP或TAT-m PEP处理。MTT及LDH释放实验检测TAT-PEP对OGD后6 h,24 h,72 h时神经元存活的作用。6.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP(100μg/L)处理。TUNEL染色检测TAT-PEP对OGD后72 h时神经元凋亡的影响。7.SD大鼠孕鼠(E 16.5-18.5 d),进行皮层神经元原代培养,随机分为3组(n=6):即Normal组,OGD组和OGD+TAT-PEP组。OGD复氧复糖后即可给予TAT-PEP(100μg/L)处理。Western blot检测TAT-PEP对OGD后72 h时神经元凋亡相关蛋白表达的影响。结果:1.MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内神经元存活数量显着减少(P<0.05),而TAT-PEP治疗后能够显着增加神经元存活的数量(P<0.05)。Neu N免疫荧光组化染色结果进一步显示,MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内Neu N阳性神经元数量显着减少(P<0.05),而TAT-PEP治疗后能够显着增加Neu N阳性神经元的数量(P<0.05)。2.与Sham组相比,MCAO组半暗带内FJC阳性神经元数量显着增多(P<0.05),而TAT-PEP治疗后FJC阳性神经元的数量明显减少(P<0.05)。TUNEL染色结果进一步显示,MCAO后3 d时,与Sham组相比,MCAO组半暗带内TUNEL阳性神经元数量显着增多(P<0.05),而TAT-PEP治疗后TUNEL阳性神经元的数量明显减少(P<0.05)。3.MCAO后3 d时结果发现,与Sham组相比,神经元超微结构明显变化。具体体现在,神经元细胞核明显固缩,染色质降解,边集,核膜皱缩、破裂。细胞质中粗面内质网呈囊性变、脱颗粒,特别是线粒体明显肿大,呈囊泡状改变,发生嵴断裂和基粒脱失的改变。而TAT-PEP治疗后可以显着改善神经元超微结构,特别是线粒体的结构。4.在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组MTT的相对比色值显着降低(P<0.05),50μg/L,100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理后可以显着提高MTT的相对比色值(P<0.05),而OGD+TAT-m PEP组的MTT的相对比色值与OGD组相比没有统计学意义(P>0.05)。结果进一步显示,与50μg/L的TAT-PEP处理组相比,100μg/L的TAT-PEP处理后可以提高MTT的相对比色值(P<0.05),而100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理组之间的MTT相对比色值没有统计学意义(P>0.05)。该结果说明TAT-PEP可以有效增强OGD后神经元活力,并且这种作用具有剂量依赖性。5.在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组LDH释放量的相对值显着升高(P<0.05),50μg/L,100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理后可以显着降低LDH释放量的相对值(P<0.05),而OGD+TAT-m PEP组的LDH释放量的相对值与OGD组相比没有统计学意义(P>0.05)。结果进一步显示,与50μg/L的TAT-PEP处理组相比,100μg/L的TAT-PEP处理后可以降低LDH释放量的相对值(P<0.05),而100μg/L和200μg/L的TAT-PEP处理组之间的LDH释放量的相对值没有统计学意义(P>0.05)。该结果说明TAT-PEP可以有效减轻OGD后神经元损伤程度,并且这种作用具有剂量依赖性。6.在OGD后6 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值降低(P<0.05),LDH释放量相对值增加(P<0.05)。在OGD后24 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显着降低(P<0.05),LDH释放量相对值显着增加(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组的MTT相对比色值增加(P<0.05)和LDH释放量相对值降低(P<0.05)。在OGD后72 h时,与Normal组相比,OGD组MTT相对比色值显着降低(P<0.05),LDH释放量相对值显着增加(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组的MTT相对比色值增加(P<0.05)和LDH释放量相对值降低(P<0.05)。7.在OGD后72 h时,OGD组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组TUNEL阳性神经元的细胞数目明显减少(P<0.05)。8.在OGD后72 h时,OGD组凋亡蛋白Bax表达明显多于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组凋亡蛋白Bax表达明显减少(P<0.05)。同时,OGD组抗凋亡蛋白Bcl2表达明显少于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组抗凋亡蛋白Bcl2表达明显增加(P<0.05)。研究还发现OGD组活化的Caspase3水平明显高于Normal组(P<0.05),与OGD组相比,OGD+TAT-PEP组活化的Caspase3水平明显降低(P<0.05)。结论:本部分实验通过利用在体大鼠MCAO模型和离体OGD模型及多种神经科学研究方法,发现TAT-PEP能够减轻皮层半暗带内神经元变性和凋亡,改善其超微结构,发挥神经保护作用。TAT-PEP能够加强OGD后皮层神经元的存活,减少LDH的释放,减轻神经元凋亡和损伤,相关机制可能与其干扰Nogo-A等与Pir B结合,影响下游信号通路,从而抑制Bax表达,促进Bcl-2表达,抑制线粒体通透性转换孔开放和Caspase3的激活有关。该实验阐明了Pir B在缺血再灌注损伤致神经元凋亡的新机制,为缺血再灌注损伤的临床治疗提供了新的干预靶点和有效策略,为TAT-PEP的神经保护作用及机制研究提供了理论依据和实验基础。(本文来源于《第四军医大学》期刊2016-05-01）
李敏[7]（2016）在《可溶性PD-1/CD137L融合蛋白的构建及功能验证》一文中研究指出癌症是威胁人类健康和生命的重大疾病,免疫治疗由于其在临床上治疗效果显着而受到广泛关注。T细胞活化是免疫应答的中心程序,它的活化首先是来自T细胞受体的第一活化信号,其次需要CD28、CD137等共刺激分子传导第二活化信号。为避免T细胞过度活化导致自身免疫反应,活化的T细胞进化出一套具有负反馈抑制的分子,被称为免疫监测点受体。如:程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)。这些分子不仅对维持机体免疫平衡十分重要,在肿瘤免疫逃逸中也发挥重要作用。目前针对免疫检测点已在一些癌症进入临床试验阶段,阻断免疫抑制通路虽然能有效地逆转肿瘤组织中T细胞的免疫功能,并在黑色素瘤等癌症的临床治疗中展现出令人兴奋的应用前景,但该治疗仅部分患者有效,存在一定的局限性。我们设想如果一方面通过CD137/CD137L通路激活T细胞,同时又阻断PD-1/PD-L1抑制性通路,可能会大大提高T细胞抗肿瘤的活性。本课题拟构建可溶性的PD-1/CD137L融合蛋白,封闭免疫通路的同时,能有效的活化免疫激活通路,达到更有效的激活T细胞抗肿瘤活性。我们成功构建了可以分泌可溶性PD-1/CD137L融合蛋白的逆转录病毒载体和A549稳转细胞株,表达产物具有与其配体结合的功能,并可以促进T细胞的免疫活化,促进T细胞杀伤肿瘤作用。(本文来源于《南京大学》期刊2016-05-01）
郝旭[8]（2016）在《富含精氨酸短肽融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达》一文中研究指出大肠杆菌因其遗传图谱明确,培养费用低等优点而被广泛应用于外源蛋白的表达,但其所表达的蛋白经常形成无活性的包涵体。而包涵体具有很高的密度,呈非水溶性,只能溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。然后还需要缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折迭结构,这种变性再复性的过程并不能确保目的蛋白生物学活性的恢复。在我们实验室构建的几种PCV衣壳蛋白在大肠杆菌中均呈现了较高水平的可溶性表达。对蛋白结构分析发现其N端富含大量的精氨酸,推测这可能是导致其可溶性表达的原因。所以我们尝试将猪圆环病毒PCV2b的衣壳蛋白N端富含精氨酸的短肽(简称N41)作为蛋白抗原融合肽与表位重组蛋白进行融合表达,观察其在大肠杆菌中的表达形式。首先,我们通过PCR钓取N41编码基因,并将其与口蹄疫病毒的VP1蛋白的表位重组蛋白PO编码基因进行重组,构建p ET28a-N41-PO质粒,并在大肠杆菌表达系统中诱导表达。结果发现N41-PO在大肠杆菌中呈部分可溶性表达。通过镍亲和层析分离纯化得到目的蛋白N41-PO后将其与水包油乳化剂1:1混合免疫ICR小鼠,采用间接ELISA检测其血清中的抗体发现N41-PO免疫小鼠血清能够识别灭活口蹄疫病毒。初步说明N41短肽可以增强外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,并且表达的融合蛋白具有较好的活性。为了进一步验证N41促进外源蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达的作用,我们构建了N41融合蛋白可溶性表达系统,将实验室中两种已经确定包涵体表达的New VP1和VP1OK93分别与N41进行融合表达,结果发现N41-VP1和N41-VP1 OK93均在大肠杆菌表达系统中实现了部分可溶性表达,且因未经历包涵体变性复性的纯化过程,外源蛋白可具有更好的免疫活性。以上结果说明N41确实可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,且表达的融合蛋白具有更好的免疫活性。但是分析N41融合蛋白在大肠杆菌中的表达量可知,几种蛋白在大肠杆菌中的表达量均不超过20%,并且N41-PO的表达量比PO降低了约50%。FMDV缅甸98株自2010年以来开始在亚洲多个国家开始大流行,被联合国粮农组织称为是近50年来最严重的一次,严重危害到我国养猪业的健康发展。为了能够获得针对FMDV缅甸98株的活性较好、安全性较高的疫苗,我们通过PCR获取了FMDV缅甸98株VP1蛋白的表位肽基因,利用N41融合蛋白可溶性表达系统构建了表位肽疫苗N41-H1。N41-H1在大肠杆菌中呈完全可溶性表达,纯化后免疫ICR小鼠,检测其免疫活性。结果显示N41-H1免疫小鼠血清对灭活口蹄疫病毒的识别作用较弱。为了增强构建的表位肽疫苗的免疫原性,我们将H1基因3次串联重复后,亚克隆至N41融合蛋白可溶性表达质粒中,构建新的表位肽疫苗N41-H3。免疫小鼠后检测其血清中抗体水平发现N41-H3免疫的小鼠血清可以更好地识别灭活口蹄疫病毒。综上所述,富含精氨酸短肽N41能够促进外源蛋白在大肠杆菌实现可溶性表达,并且表达的外源蛋白具有较好的活性,但是N41融合蛋白在大肠杆菌中的表达量偏低,还需要进一步完善。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-04-01）
刘佳林[9]（2016）在《重组融合蛋白在E.coli中可溶性表达及抗原活性研究》一文中研究指出本文在前期工作基础上,针对一种由口蹄疫病毒衣壳蛋白B表位和T表位组成的表位肽在大肠杆菌(E.coli)中以包涵体形式表达的问题。采用铁蛋白和热休克蛋白65(HSP65)及其变构体作为分子伴侣,与表位肽相融合,观察融合蛋白在E.coli中的表达形式,确定能可溶性表达的重组融合蛋白,在此过程中,对重组融合蛋白的抗原活性进行研究。本文的研究结果对重组蛋白在E.coli可溶性表达的设计思路有一定参考价值。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-04-01）
黄夏冰,康巧珍,傅国,汲振余,刘鑫[10]（2015）在《GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签》一文中研究指出利用基因工程的方法,以实验室保存的p MAL-C2X-NAP质粒为模板,PCR扩增NAP基因,构建重组质粒p GEX-NAP.重组质粒通过酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),再经IPTG低温诱导获得可溶性GST-NAP融合蛋白,最后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂进行纯化,Prescission蛋白酶进行柱上切割去除GST标签.结果表明,p GEX-NAP重组质粒构建正确,在大肠杆菌中经IPTG低温诱导表达,可获得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST标签后,经Western Blot验证NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗体特异识别.(本文来源于《郑州大学学报(理学版)》期刊2015年04期）
可溶性融合蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:PD-1(programmed cell death-1)和TIM-3(T-cell immunoglibulin and musin-3)是两类负性调节T细胞免疫功能的免疫检查点,肿瘤细胞通过表达相应配体抑制T细胞免疫功能而产生免疫逃逸,阻断其受体-配体相互作用可解除免疫抑制从而清除肿瘤细胞,但在单一的免疫检查点抑制治疗中,肿瘤细胞可通过活化其他免疫抑制通路产生耐药性。研究目的:制备一种重组的可溶性PD-1/TIM-3融合蛋白,使与肿瘤细胞表面的两类相应受体相结合,以用于进一步对T细胞免疫抑制解除和对肿瘤细胞自身作用的研究。材料和方法:设计并合成含有人源可溶性PD-1、TIM-3、分泌肽、铰链区及6xHis标签的表达序列,将该片段克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl并进行重组慢病毒的包装,并感染HEK293T细胞,根据细胞荧光及Western blot结果筛选高表达重组融合蛋白的稳定转染细胞,利用细胞免疫荧光检测重组融合蛋白与肿瘤细胞表面相应配体PD-L1、PD-L2、Galactin-9的结合能力,并以冻干、透析、Ni-NTA琼脂糖凝胶对细胞培养上清中的sPIT3进行纯化,通过SDS-PAGE鉴定所纯化蛋白。结果:通过分子克隆及重组慢病毒的包装与感染,成功获得了高表达重组融合蛋白的稳定转染HEK293T细胞株;通过RT-PCR筛选了高表达Galactin-9的SW620结肠癌细胞,同时中等水平表达PD-L1、PD-L2、Galactin-9的MDA-MB-231乳腺癌细胞,以及低表达PD-L1、PD-L2、Galactin-9的PC-3前列腺癌细胞,在细胞免疫荧光中检测到的荧光强度与各肿瘤细胞表面配体的表达水平相符,叁种细胞达到同等荧光强度时的曝光时间分别为4.1s,6.0s,11.4s。结论:重组sP1T3融合蛋白可特异性地与表达PD-1和TIM-3对应配体的肿瘤细胞结合,为进一步探究其作用与机制建立了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
可溶性融合蛋白论文参考文献
[1].于雷,陶磊,毕华,李响,饶春明.RP-HPLC法测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸的含量[J].中国医药导报.2019
[2].陈晶,吴俊,曹江.可有效结合肿瘤细胞的重组可溶性PD-1/TIM-3融合蛋白[C].浙江省免疫学会第六次会员代表大会暨第十一次学术大会论文汇编.2018
[3].于雷,陶磊,李响,郭莹,饶春明.液质联用技术分析可溶性CD95-Fc融合蛋白N-糖组成[J].中国新药杂志.2018
[4].付大伟,陈启蒙,徐伟.融合蛋白Trx-T4DL可溶性表达、纯化与其生物活性应用[J].食品工业科技.2018
[5].贾长增.促进curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达研究[D].暨南大学.2017
[6].邓斌.新型可溶性融合蛋白TAT-PEP对SD大鼠缺血性脑损伤的保护作用及相关机制研究[D].第四军医大学.2016
[7].李敏.可溶性PD-1/CD137L融合蛋白的构建及功能验证[D].南京大学.2016
[8].郝旭.富含精氨酸短肽融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达[D].吉林大学.2016
[9].刘佳林.重组融合蛋白在E.coli中可溶性表达及抗原活性研究[D].吉林大学.2016
[10].黄夏冰,康巧珍,傅国,汲振余,刘鑫.GST-NAP融合蛋白可溶性表达及柱上切割GST标签[J].郑州大学学报(理学版).2015
标签：可溶性CD95-Fc; 异天冬氨酸; 脱酰胺修饰; 反相高效液相色谱;