导读:本文包含了几丁质代谢酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:飞蝗,胚胎表皮发育,预若虫表皮,几丁质合成酶1
几丁质代谢酶论文文献综述
董卿[1]（2019）在《飞蝗预若虫表皮发育及其几丁质代谢分子机制研究》一文中研究指出飞蝗(Locusta migratoria)是重要的农业害虫,其胚胎期有多次表皮生成和降解,包括浆膜表皮形成与降解、胚胎第一层表皮形成与降解、胚胎第二层表皮形成与降解和胚胎第叁层表皮形成。其中胚胎第二层表皮包裹飞蝗预若虫,称为预若虫表皮,其合成和降解受阻引起飞蝗孵化受阻,是早期飞蝗防治的重要阶段。本研究将通过对飞蝗预若虫表皮超微结构的动态观察,明确预若虫表皮结构及其形成和降解规律;通过研究飞蝗几丁质合成酶LmCHS1和几丁质酶LmCht5-2在预若虫阶段的表达特性、表达定位和功能研究,解析其参与预若虫表皮几丁质代谢的作用机制,为卵期害虫防治提供新的靶标分子。1、飞蝗预若虫表皮超微结构及几丁质发育变化通过对30℃条件下9-14 d飞蝗胚胎超微结构的动态观察发现,预若虫表皮分为上表皮(Epicuticle)和原表皮(Procuticle);于第10 d时(E10H0)开始生成,出现上表皮;E11H0时形成完整的含有原表皮和上表皮的表皮结构。降解步骤为:E12H0-E12H12上表皮和原表皮发生分离;E12H12-E13H0发生皮层溶离;E13H0-E14H0原表皮降解。荧光染料Fluorescent Brightener 28染色观察发现,预若虫表皮几丁质在E11时沉积最厚,与超微结构观察一致。E12时,预若虫表皮降解,几丁质变薄,并开始远离胚胎,E13-E14时,预若虫表皮几丁质逐渐降解。2.LmCHS1参与预若虫表皮几丁质合成RT-qPCR检测显示LmCHS1基因在E9时表达升高,在E11时达到最高峰。免疫组化发现,LmCHS1蛋白在表皮细胞质中表达;在E11时表达量最高,且可分泌至表皮层中。显微注射dsLmCHS1至E7飞蝗胚胎,发现RNAi可显着降低预若虫期LmCHS1的表达(约88%);造成飞蝗孵化受阻,致死率为50.6%。HE染色观察显示,dsLmCHS1组预若虫表皮形成受阻。免疫组化显示dsLmCHS1显着抑制LmCHS1蛋白表达并降低预若虫表皮几丁质的含量。超微结构观察显示,dsLmCHS1组原表皮形成受阻,几丁质片层结构消失。因此得出,LmCHS1对预若虫表皮几丁质合成和原表皮形成具有重要作用,是飞蝗卵期防治的重要靶标。3.LmCht5-2参与预若虫表皮几丁质降解几丁质酶5是参与昆虫表皮降解的重要酶类。飞蝗几丁质酶5包含2个基因,LmCht5-1和LmCht5-2。前期研究发现沉默LmCht5-1引起预若虫表皮原表皮降解受阻,孵化致死。本研究拟在此基础上,解析LmCht5-2参与飞蝗预若虫表皮降解的作用机制。RT-qPCR检测显示LmCht5-2基因E11时表达显着性提高,且在E12时仍维持相对较高的表达量。免疫组化发现,LmCht5-2蛋白在E12-E13具有较高表达量,可在表皮细胞和表皮层观察到红色荧光信号。通过显微注射技术对E9飞蝗胚胎注射dsLmCht5-2,发现RNAi可显着降低预若虫期LmCht5-2的表达(约87.5%);并造成飞蝗孵化受阻,致死率为80%。超微结构观察显示,干扰LmCht5-2影响飞蝗预若虫表皮上表皮/原表皮分离和原表皮降解。综上所述,飞蝗预若虫表皮分为原表皮和上表皮两部分,LmCHS1和LmCht5-2分别参与预若虫表皮几丁质的形成和降解,是早期害虫防治重要的分子靶标,本研究结果将为害虫卵期防治分子靶标的研发和基于调控卵的蜕皮发育进行害虫控制提供思路。(本文来源于《山西大学》期刊2019-06-01）
张露,朱世城,郑好,沈祺达,王世贵[2]（2017）在《褐飞虱海藻糖酶基因在表皮几丁质代谢中的调控作用》一文中研究指出【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA,反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测该基因的表达情况,确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照;最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化,分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显着下降,其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显着下降,同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制,但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降,dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果,整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显;dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显,Validamycin能够显着降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达,且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升,dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升;Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显着下降,dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显着上升;dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降,Cht2和Cht4表达显着上升;dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显着上升;dsTRE1s注射后,Cht1和Cht5表达显着下降,而Cht9表达显着上升;Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显着或者极显着下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成,结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。(本文来源于《中国农业科学》期刊2017年06期）
宋天琪[3]（2016）在《飞蝗表皮Tweedle家族基因的功能及几丁质代谢的调控机制》一文中研究指出昆虫表皮是抵御外界复杂环境的第一道屏障。为适应环境的变化、满足个体的成长需求,在昆虫不同的发育阶段,必须定期蜕去旧表皮并合成新表皮。昆虫表皮主要由蛋白质和几丁质构成,并通过一系列复杂的生化反应形成精细结构。本研究以我国重要农业害虫飞蝗为研究对象,通过对表皮蛋白中的Tweedle蛋白和参与几丁质代谢途径中重要的miRNA进行研究,探讨Tweedle蛋白在表皮形成和代谢中的作用以及miRNA参与几丁质代谢途径的转录后调控功能的机理。1)Tweedle蛋白是表皮蛋白家族重要成员之一,其特点是具有4个特异性保守区,能与几丁质结合。在果蝇中,当Tweedle D发生突变时,幼虫表皮合成受损,无法维持正常体型,表明Tweedle家族在表皮的合成途径中起重要作用。本研究通过搜索飞蝗转录组数据库,获得表皮蛋白基因LmTwdl1及LmTwdl2的序列,并证实这两个基因属于Tweedle家族。通过Real-Time PCR分析了 Tweedle基因表达谱,结果表明,飞蝗Tweedle基因在表皮与前肠中表达量非常高,其他组织中基本不表达;同时,表皮不同发育阶段表达变化显示,Tweedle基因在5龄前期及中期低表达,后期表达量迅速升高。原位杂交实验表明,LmTWl1转录物定位于体壁上皮细胞胞质中。为研究飞蝗Tweedle基因的生物学功能,我们进行了 RNA干扰实验。结果发现RNA干扰LmTwdl1后,飞蝗出现蜕皮异常并大量死亡。H&E染色与几丁质染色结果显示,飞蝗表皮与对照相比无显着差异,而电镜结果显示,RNAi后飞蝗新表皮中的上表皮厚度变薄,原表皮几丁质排布出现紊乱。以上结果表明LmTwdl1在飞蝗的蜕皮发育中起关键作用。研究结果将有助于进一步加深对Tweedle基因功能的理解。2)几丁质代谢是表皮合成的关键步骤。几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)与几丁质酶(chitinase,CHT)是几丁质代谢途径中的两种关键酶;miR-71与miR-263通过抑制靶基因LmCHS1及LmCHT10的表达,参与几丁质的合成与降解,并调节蜕皮发育。通过注射miRNA激动剂,分析miRNA过表达对靶基因表达量的影响,并通过原位杂交实验证明miRNA与其对应靶基因在表皮细胞中共定位,同时发现miRNA过表达或RNA干扰靶基因后,飞蝗均出现表皮蜕皮异常现象。结果表明,miRNA参与几丁质代谢途径的转录后调控。以上研究结果有助于我们进一步探索依赖LmCHS1及LmCHT10的几丁质代谢途径的机制,阐明了蜕皮发育在飞蝗生活史中的重要意义,同时也为蝗灾控制提供了一种新的思路。(本文来源于《山西大学》期刊2016-06-01）
杨萌萌[4]（2016）在《海藻糖酶及其抑制剂（Validamvcin）对褐飞虱海藻糖和几丁质代谢的调控研究》一文中研究指出海藻糖酶(Trehalase, TRE)是一种能够将海藻糖分解为两分子葡萄糖的酶,包括可溶性海藻糖酶(soluble trehalase,简称TRE1)和膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase,简称TRE2)两种类型。海藻糖酶抑制剂能够通过与海藻糖酶活性位点上的氨基酸相互结合形成复合物,竞争性地抑制海藻糖酶的活性从而影响昆虫体内的相关代谢途径。本文以褐飞虱(Nilaparvata lugens)为研究对象,选用效果较好的海藻糖酶抑制剂-Validamycin,研究海藻糖酶及其抑制剂在褐飞虱海藻糖和几丁质代谢中的调控功能。主要研究内容及结果如下：首先,利用RNAi技术研究了褐飞虱TRE基因对几丁质合成和降解通路中相关基因的调控作用,同时以注射dsGFP、dsTPS1和dsTPS2作为对照组。研究结果发现：单独TRE被抑制以及TRE同时被抑制48 h和72 h均会导致部分几丁质酶基因、几丁质合成酶基因CHS1及其两个不同可变转录子(CHS1a和CHS1b)和几丁质合成通路中其它关键基因的表达显着下降,同时TRE1-1、TRE1-2和TRE2调控的基因存在差异性。这些结果表明,TRE能够调控褐飞虱几丁质代谢途径中关键基因的表达,并且3个不同TRE在褐飞虱几丁质代谢调控作用也存在功能差异。此外,TPS1和TPS2被RNAi 48 h后CHS1、CHS1a、 CHS1b以及12个几丁质酶及复合体的表达显着下降；TPS1和TPS2被RNAi 72h后GFAT、GNNPNA、UAP、CHS1b以及7个或8个几丁质酶及复合体的表达也显着降低。结果表明褐飞虱体内海藻糖合成途径被干扰后,同样会抑制几丁质代谢途径中相关基因的表达。其次,我们对Validamycin注射浓度进行了初步筛选,根据筛选结果设置了0.1、0.5、1、5、10 μg/μL五个比较合理的浓度,通过对5龄褐飞虱若虫进行显微注射来抑制海藻糖酶活性,同时以注射过量的无菌水、过量的海藻糖和过量的葡萄糖作为对照,并于注射后48 h对抑制效果进行评价。结果表明,褐飞虱注射不同浓度的Validamycin 48 h后都表现出一定的死亡率和畸形率。褐飞虱死亡率和畸形率随着Validamycin注射浓度的增加而增加,在Validamycin注射浓度为10 μg/μL时死亡率和畸形率最高,分别为56.67%和37.78%。褐飞虱注射不同浓度Validamycin 48 h后,畸形形态主要有叁种,分别为：蜕皮困难、翅型异常以及蜕皮困难且翅型异常。每种畸形表现的程度不同,其中蜕皮困难以及蜕皮困难且翅型异常所占的比例较大。再次,探究Validamycin注射48 h后对褐飞虱海藻糖代谢途径的影响。相关研究结果如下：可溶性和膜结合型海藻糖酶活性均显着降低,表明Validamycin能够有效地抑制褐飞虱海藻糖酶活性。海藻糖含量均显着升高,而葡萄糖和糖原的含量显着降低。研究结果还显示高于0.1 μg/μL的Validamycin注射褐飞虱后都能够有效地抑制海藻糖酶活性,而随着注射Validamycin浓度的增加,褐飞虱死亡率增加,表明较高浓度的Validamycin能够更加有效的控制害虫。最后,研究发现Validamycin能够直接通过调控几丁质代谢途径而导致褐飞虱的发育畸形及死亡。研究结果显示：褐飞虱注射Validamycin 48 h后,几丁质合成通路中的HK、G6PI、GFAT、GNPNA、PGM, UAP、CHS1(包括它的可变外显子基因,CHS1a和CHS1b)和7个几丁质酶的表达均显着低于对照组；几丁质的相对含量均显着下降,且几丁质相对含量随着Validamycin注射浓度的增加而减少。这些结果表明Validamycin主要通过抑制褐飞虱两种海藻糖酶活性进而调控其几丁质合成及降解,并导致其畸形和死亡。此外,在褐飞虱注射过量海藻糖和过量葡萄糖的对照组中,结果发现注射48 h同样出现一定的死亡率和畸形率。几丁质代谢通路中HK、GFAT、GNPNA、PGM、UAP、CHS以及9个或4个几丁质酶显着下调且几丁质含量也显着低于无菌水对照组,表明过量海藻糖和过量葡萄糖能够影响褐飞虱几丁质代谢。综上所述,海藻糖酶及其抑制剂(Validamycin)能够通过调控海藻糖代谢以及几丁质代谢通路中关键基因的表达,从而使褐飞虱几丁质含量降低,并导致蜕皮失败和翅型异常等畸形甚至死亡。(本文来源于《杭州师范大学》期刊2016-06-01）
余海中[5]（2015）在《稻纵卷叶螟转录组及几丁质代谢途径和抗药性基因鉴定》一文中研究指出稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一种重要的水稻害虫,由于迁徙特性而难以控制,每年在长江中下游地区大量爆发。目前控制稻纵卷叶螟最主要的方法是依靠化学杀虫剂,对环境和人类的生命安全产生重要影响,并且害虫的抗药性与日俱增。几丁质作为一种线型高聚物主要存在于真菌细胞壁、昆虫表皮和围食膜中,在昆虫抵御外界微生物入侵中起着关键作用。希望通过破坏昆虫几丁质代谢途径,有利于开发杀虫剂作用的靶点,为进一步防治稻纵卷叶螟奠定基础。迄今为止,稻纵卷叶螟在几丁质代谢与昆虫抗药性方面的报道很少。由于稻纵卷叶螟全基因组测序尚未完成,转录组测序成为挖掘新基因,研究基因功能的重要方法。尤其在缺乏基因组信息的情况下,可以在转录水平获得特定组织、器官和个体的基因信息,极大推动了稻纵卷叶螟分子生物学的研究。本研究通过对稻纵卷叶螟四龄幼虫转录组测序获得大量reads,经过序列组装与拼接得到Unigene;在基因注释的基础上鉴定几丁质代谢相关的酶以及代谢途径,筛选抗药性相关的基因,为杀虫剂新靶标的开发以及药剂代谢机理的研究奠定基础;充分研究转录组数据,发掘功能性SSR,以期获得可供遗传研究的分子标记。研究结果如下:1.利用高通量测序技术Illumina HiSeq~(TM) 2000对稻纵卷叶螟四龄幼虫进行转录组测序,获得了29,367,797 reads,经过Trinity软件组装得到相应的Contig、Transcript数量,分别为3,381,765和106,407;运用paired-end joining和gap-filling技术拼接得到63,174个Unigene,平均碱基数为753 bp。将63,174个Unigene提交至NCBI Nr数据库进行BLASTx比对,设置阈值E为10~(-5),其中注释到COG、GO、KEGG、Swiss-prot、Nr的数量分别为8,669、18,176、10,043、24,246和31,810个,总共有32,035个Unigene得到成功注释。2.对Nr数据库进行BLASTx分析,设置阈值E为10~(-5),鉴定出16个与几丁质代谢相关的酶,包括:CHSA、CHSB、PGM、UNAP、NAGK、CHT1、CHT2、CHT3、CHT5、CHT7、Hex、CDA1、CDA2、CDA4、CDA5和CDA6,相应序列已经在Gene Bank登录,再结合转录组测序得到的KEGG pathway,以及参考相关的文献,绘制出稻纵卷叶螟几丁质代谢通路图。采用qRT-PCR验证和检测叁个主要酶类基因:CmCHS1、CmCDA1和CmCHT1在中肠、表皮、幼虫和成虫中的表达量。结果表明:CmCHS1在表皮中高表达,成虫的表达量高于幼虫;CmCHT1在表皮中高表达,幼虫表达量显着高于成虫;CmCDA1在中肠中表达,成虫的表达量高于幼虫。3.对Nr数据库BLASTx分析,设置阈值E为10~(-5),鉴定出378个分属于15大类的昆虫抗药性相关的基因,包括细胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、γ-氨基丁酸、乙酰胆碱受体、钠离子通道、乙酰胆碱酯酶、水通道蛋白、过氧化氢酶、钙离子通道、氯离子通道、谷胱甘肽过氧化物酶、耐甲氧普灵、超氧化物歧化酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂。4.利用转录组获得的数据,挖掘稻纵卷叶螟SSR分子标记,共挖掘到SSR标记位点10,394个,其中单碱基5050个,双碱基1826个,叁碱基3408个,四碱基101个,6个五碱基和3个六碱基。综合以上结果,本研究通过对稻纵卷叶螟四龄幼虫转录组测序,鉴定出16种几丁质代谢相关的酶,分析几丁质代谢途径;鉴定出378个昆虫抗药性相关的基因;挖掘10,394个SSR分子标记,这些结果为稻纵卷叶螟的分子水平研究及害虫控制奠定基础。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2015-06-01）
张建珍[6]（2014）在《昆虫几丁质代谢与植物保护》一文中研究指出几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的重要组成成分,昆虫蜕皮和生长发育依赖于几丁质合成和降解的精细调控。几丁质代谢酶参与昆虫表皮和围食膜几丁质的形成,在昆虫蜕皮发育等生命活动中具有重要的生理功能,利用几丁质代谢酶的调控作用研发分子靶标,在植物保护领域具有潜在的应用价值。RNA干扰(RNAi)技术作为反向遗传学研究的有效工具,在昆虫基因功能研究方面发挥了重要作用,同时在害虫控制方面展示出广阔的应用前景~([1-4])。RNAi技术的发展也推动了昆虫几丁质代谢关键基因生物学功能的解析(本文来源于《中国农业科学》期刊2014年07期）
徐波[7]（2012）在《叁角帆蚌几丁质代谢酶基因的克隆表达和功能分析》一文中研究指出叁角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最重要的淡水育珠母蚌。本实验克隆了叁角帆蚌几丁质酶-3和甲壳素脱乙酰酶两个几丁质代谢酶基因，并通过组织特异性表达、破壳诱导表达和原核表达推测两个基因的可能生理功能；采用两种方法，磁珠富集法和5锚定PCR法构建背瘤丽蚌微卫星文库开发的SSR标记，并将开发的部分引物用于叁角帆蚌进行扩增以检查引物的扩增效果及通用性。主要研究结果如下：1．叁角帆蚌2个几丁质代谢基因cDNA全序列的克隆及分子特征叁角帆蚌几丁质酶-3（Chi-3）基因的cDNA序列全长2523bp，包括196bp的5′端非翻译区（UTR），1962bp的开放阅读框，可编码653个氨基酸残基，365bp的3′端非翻译区(UTR)。和其它已知几丁质酶相似，Chi-3含有一个信号肽和3个保守结构域：1个GH18糖水解结构域和2个几丁质结合区CBM14。BLAST分析后表明该基因的氨基酸序列与其它已知生物的同种基因氨基酸序列相似度为21.3–34.4%，而与其它五个物种的相似度略高，为27.2–34.7%。进化树显示叁角帆蚌几丁质酶-3与太平洋牡蛎的几丁质酶-3聚成一支，说明叁角帆蚌几丁质酶-3属于双壳类几丁质酶-3家族。叁角帆蚌甲克素脱乙酰酶（Cda）基因的cDNA全长2654bp，包括347bp的5′端非翻译区(UTR)，1938bp的开放阅读框，可编码645个氨基酸残基,369bp的3′端非翻译区(UTR)。分子进化树显示叁角帆蚌甲壳素脱乙酰酶与棉铃虫、蓓带夜蛾、甘蓝夜蛾聚为在第四组。这个组的甲壳素脱乙酰酶基因仅含有一个信号肽序列和一个多聚糖脱乙酰结构域。2．叁角帆蚌2个几丁质代谢基因表达分析及功能研究叁角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因组织特异性表达。以β-actin基因为内参，结果显示几丁质酶-3基因在除血液以外的其它7个组织均有表达，其中在外套膜、肝、胃、肾中表达相对较高，而在肠、鳃、斧足中表达量相对较低；甲壳素脱乙酰酶基因在8个组织均有表达，其中在外套膜、胃、斧足中表达相对较高，而在血液、肝、肾、肠、鳃、中表达量相对较低。叁角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因破壳诱导表达。叁角帆蚌外套膜中几丁质酶-3基因的表达量在破壳后的12小时显着增加（p>0.05），而随后逐渐降低到正常水平；甲壳素脱乙酰酶基因的表达量在破壳后无显着增加（p>0.05）。叁角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因原核表达。叁角帆蚌几丁质酶-3基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L，24℃为最佳诱导表达条件，SDS-PAGE电泳检测图谱显示，1-4h重组蛋白的表达量呈明显上升的趋势，4-8h重组蛋白表达量增速减缓。本实验选用pGEX-5X-1载体，其表达产物为融合蛋白，含有一个26KD的GST标签和大小为约10KD的几丁质酶-3结构域，融合蛋白大小为36KD；甲克素脱乙酰酶基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L，37℃为最佳诱导表达条件，SDS-PAGE电泳检测图谱显示，1-8h重组蛋白的表达量呈上升的趋势。其表达产物融合蛋白含有一个26KD的GST标签和大小为约7KD的甲壳素脱乙酰酶酶结构域，融合蛋白大小为33KD，本研究结果可以为后续实验酶活性测定奠定基础。3．背瘤丽蚌30对多态性微卫星标记的开发及其叁角帆蚌的通用性研究从磁珠富集法获得的微卫星序列阳性克隆率为69.2%，重复次数超过10的占总数的70.2%，从设计的28对引物中筛选得到多态性引物11对，开发效率为39.3%。这11对引物用于养殖群体的遗传多样性的分析，结果显示等位基因数范围在4-13之间，观测杂合度、期望杂合度范围分别在0.2051-0.7381、0.5656-0.8393之间。而5'锚定PCR法获得的微卫星序列阳性克隆率为97.8%，重复次数超过10的占总数的24.7%，从设计的56对引物中筛选得到多态性引物19对，开发效率为30.4%。这19对引物用于养殖群体的遗传多样性的分析，结果显示等位基因数范围在3-10之间，观测杂合度、期望杂合度范围分别在0.2083-0.8944、0.4305-0.8961之间。实验过程和结果表明磁珠富集法所获微卫星序列质量高，开发微卫星标记效率较高；而5锚定PCR法实验操作更简便，所获得的引物遗传多样性指数更高。两种方法开发的引物均可用于背瘤丽蚌和近缘种的野生种质资源遗传多样性的研究。选用两种方法所开发的18对微卫星引物用于我国非常重要的淡水育种蚌-叁角帆蚌的遗传多样性研究。其中10对在叁角帆蚌群体中具有较高的多态性，说明所开发的微卫星引物质量较好，可用于淡水蚌的遗传多样性研究。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2012-03-01）
梁晓飞[8]（2010）在《小麦条锈菌几丁质代谢相关基因的特征分析与真菌中聚多糖去乙酰化酶基因的序列分析》一文中研究指出几丁质是真菌细胞壁的重要结构成分,其正常合成代谢对植物病原真菌维持完整的细胞结构和致病性十分重要;研究表明锈菌中几丁质去乙酰化酶(Chitin Deacetylase, CDA)可能与病原菌逃避寄主识别和防御反应激发有关。基因组检索发现一些真菌中存在较多数目的CDA类似蛋白PDAs(Polysaccharide Deacetylase proteins),其序列特征与CDA类似,目前尚不清楚这些PDAs与CDAs的对应关系,尚无对这些PDAs的系统进化分析。为了解几丁质代谢相关基因在小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)分化侵染过程中的作用以及真菌中PDAs的基本特征,本研究对小麦条锈菌中的一个II类几丁质合成酶(Chitin synthase, Chs)基因PstChs II和几个PDA基因PstPDAs进行了克隆和表达分析,对其中PstPDA1和PstPDA2两个基因进行了原核表达和纯化,对真菌6个物种中90个PDAs进行了初步序列分析。主要结果如下:1. PstChs II和PstPDAs基因编码蛋白均具有对应蛋白的特征motifs与结构域。PstChs II基因在夏孢子萌发过程中上调表达,推测与芽管延伸过程中细胞壁几丁质的合成相关;不同PstPDA基因表达特征差别较大,可能在不同分化时期发挥功能;PstPDA1基因存在3种转录本,为内含子可变剪切和小麦条锈菌夏孢子双核特性所致;获得了PstPDA1、PstPDA2基因的原核表达蛋白。2.根据蛋白序列和基因内含子剪切位点特征校正了真菌基因组中注释的90个PDAs中22个成员,将初始18个不含信号肽序列中的11个重新注释为分泌蛋白。3.初步分析了真菌PDAs的进化特征。物种特异基因复制造成了小麦杆锈菌(Puccinia graminis)、灰盖鬼伞(Coprinus cinera)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)物种中PDAs基因家族的扩张,在3个物种中鉴定到13个物种特异基因复制群;灰盖鬼伞(C. cinereus)、稻根霉菌(R. oryzae)复制群成员在PDAs保守motifs关键氨基酸位点存在多样性。系统进化分析将真菌中PDAs分为3个亚家族;亚家族III成员motifs均不完整;亚家族I一些成员包含PDA结构域外其它结构域,担子菌亚门PDAs在“DXXDW”motif色氨酸位点保守性较差;亚家族II无子囊菌亚门真菌成员。4.基于PDA基因基因位点序列的比较,在小麦杆锈菌(P. graminis)中鉴定到两组序列保守的supercontigs。其中supercontig34和supercontig100存在至少80 kb的共线性区域,该区域内存在DNA片段的重复和插入。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2010-05-01）
朴冬花[9]（2008）在《小地老虎几丁质代谢酶基因的克隆及分子特性研究》一文中研究指出目前已分离出一些昆虫几丁质酶,并且已将昆虫几丁质酶基因导入到植物中以增强植物的抗虫性,及将几丁质酶嵌入到昆虫病原体内,增强昆虫病原体对害虫的为害。本文从小地老虎体内分离和表达了几丁质代谢相关酶基因,详细了解其分子特性对研究和开发几丁质代谢相关酶为基础的杀虫剂是十分必要的。从预蛹期小地老虎体内分离出两条几丁质酶基因cDNA序列,一条是全长基因序列,另一条是包含5’端的基因片段。全长的小地老虎几丁质酶基因cDNA序列长度为2823bp,包括1677个碱基的开放读码框,编码558个氨基酸,分子量为62.5 kDa。5’端的几丁质酶基因cDNA序列片段长度为1082bp,编码360个氨基酸。由全长几丁质酶基因推导的氨基酸序列包含两个保守区域,一个是N-端的高度保守的几丁质催化区,另一个是C-端包括六个半胱氨酸的几丁质结合区。在催化区和几丁质结合区中间有一个被称为Linker的富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸的区域(PEST富集区)。预测其成熟期蛋白的N-端还含有一个疏水性的信号肽。从已发现昆虫几丁质酶基因推导的氨基酸序列中的N-位和O-位糖基化的位点的确定,对于研究昆虫蛋白的分泌和维持其稳定性是必要的。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在小地老虎几丁质酶氨基酸序列中有2个N-位糖基化位点和20个O-位糖基化位点。从预蛹期小地老虎体内分离出两条包含3’端的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。其中一条的长度为2267bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.6kDa。另一条的长度为2278bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.5kDa。两条β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推导的氨基酸序列都包含两个保守区,一个是N-端的水解催化区,另一个是C-端的水解结合区。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在两条小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列中都有3个N-位糖基化位点和1个O-位糖基化位点。从取食期小地老虎体内分离出一条几丁质合成酶基因cDNA序列,长度为975bp,包括792个碱基的开放读码框,编码264个氨基酸,分子量为30.0kDa。利用BLAST搜寻出许多与小地老虎几丁质酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为80%,与棉铃虫同源性为85%,与美国白蛾同源性为83%,与斜纹夜蛾同源性为89%。序列比对表明小地老虎几丁质酶基因与其他鳞翅目昆虫的几丁质酶基因显示高同源性(75%以上)。利用BLAST搜寻出与小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应片段推导的氨基酸序列同源性为73%,与草地贪夜蛾同源性为37%,与玉米螟同源性为74.4%。利用BLAST搜寻出与小地老虎几丁质合成酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为79%,与甘蓝夜蛾同源性为92%,与甜菜夜蛾同源性为89.4%。克隆出的小地老虎几丁质代谢相关酶基因的cDNA序列已分别登录在GenBank上,登录号分别为:几丁质酶基因EU035316,EU622802;β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因EU622803,EU622804;几丁质合成酶基因EU601174。利用RT-PCR方法对小地老虎体内不同时期的几丁质代谢酶基因的时空表达进行了研究。结果表明,幼虫蜕皮和预蛹期有几丁质酶和β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的mRNA表达,而在幼虫取食期只有几丁质合成酶的mRNA表达。(本文来源于《东北农业大学》期刊2008-04-10）
刘波[10]（2007）在《超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3几丁质代谢途径及相关嗜热酶系的研究》一文中研究指出几丁质是自然界第二大类有机物质，其降解是自然界中营养物质循环利用的重要过程。通过对极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii OT3基因组序列分析，该古菌可能存在一条新颖的几丁质降解途径。通过鉴定该古菌中与几丁质代谢相关的保守ORF簇编码蛋白的生化性质，不但能够鉴定该古菌特有的几丁质代谢途径以及相关蛋白(嗜热酶)协同作用降解几丁质的机理，而且能够在详细研究各种嗜热酶催化特性、热稳定机制、催化机制的基础上，开发在生物工程领域具有应用价值的极端酶类。本论文研究主要有以下几个部分：1．极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii几丁质代谢途径的研究采用PCR方法从Pyrococcus horikoshii OT3基因组中克隆出PH0511(外切氨基葡萄糖苷酶)、PH0499(几丁二脱乙酰酶)、PH0495(甘油酸激酶)基因，插入到pET15b表达质粒中，再进行E．coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL表达，并通过亲和层析及离子交换层析对重组蛋白进行纯化。利用分子筛、薄层层析、荧光扫描和放射性磷标记等技术对嗜热酶的催化特性以及生化性质进行了详细的研究。通过对几丁质代谢相关嗜热酶类性质鉴定，推测在极端嗜热球古菌P．horikoshii OT3中存在着特有的几丁质代谢途径。其主要特征是几丁二脱乙酰酶Dac_(ph) (PH0499)能够将几丁寡糖(GlcNAc_n)或几丁二糖(GlcNAc_2)先脱去乙酰基，生成非还原性末端部分脱乙酰化的几丁寡糖或GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的水解作用下生成GlcNAc_(n-1)与GlcN，随后Dac_(ph)将GlcNAc_(n-1)再脱去乙酰基，并在外切氨基葡萄糖苷酶的上述配合作用下，从而最终将几丁寡糖降解为产物氨基葡萄糖。虽然P．horikoshii缺少典型的几丁质酶，但在外切氨基葡萄糖苷酶和脱乙酰酶以及体内其他糖苷水解酶(如甘露糖苷酶，PH0501)的共同作用下，能够将其海底生活环境中的几丁类杂多糖降解为氨基葡萄糖，从而进入下一步代谢途径。甘油酸激酶的作用可能是参与糖酵解过程中古菌特有的非磷酸化的ED途径。2．极端嗜热球古菌Pyrococcus horikoshii 0T3几丁质代谢相关嗜热酶的表达及性质研究2．1外切氨基糖苷酶P．horikoshii外切氨基糖苷酶(BglA_(ph)，ORF PH0511)以一稳定的二聚体形式存在，还原剂及热变性对其在SDS-PAGE过程中的聚体结构没有明显影响。该酶的最适生长温度与最适pH分别为90℃与pH 6.0。该酶具有明显的热稳定性，其在90℃时的半衰期为9h，是迄今报道的热稳定性最高的氨基葡萄糖苷酶。该酶能够从壳聚糖、壳寡糖或部分脱乙酰化的几丁寡糖的非还原性末端脱去一个氨基葡萄糖残基(GlcN)，生成氨基葡萄糖与少一个残基的几丁类多糖。该酶对乙醇、二丁醇、DMSO、SDS、尿素和重金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Sr~(2+)和Ni~(2+)等具有抵抗作用。通过本研究提出的一种新的氨基葡萄糖苷酶的测定方法，对预测的该酶的催化氨基酸残基进行点突变蛋白的动力学分析，显示该酶的催化机理可能不属于典型的糖苷水解酶35家族催化机制。缺失突变分析结果显示，其C-末端约100个氨基酸对于维持该酶的热稳定性具有重要的作用。2．2甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)分子筛结果显示，P．horikoshii甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸，GK_(ph)，ORF PH0495)为100 kDa，SDS-PAGE分析其蛋白质分子量为47 kDa，说明该酶主要以二聚体形式存在。该酶的最适生长温度与最适pH分别为45℃与pH 7.0，在100℃时，该酶能保持最大活力的50％以上。该酶具有极其显着的热稳定性，在70℃、80℃及90℃热处理12小时后，酶活力没有明显的下降。利用一种研究提出的一种新的甘油酸激酶放射性磷酸标记检测方法以及传统的光谱吸收结合辅酶的检测方法，证明该酶能够利用ATP、GTP、CTP、UTP、ADP和Ppi作为磷酸供体，以二价余属离子Mg~(2+)，Mn~(2+)，Co~(2+)，Ni~(2+)为辅助因子，催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸。该酶具有独特的磷酸供体底物特异性且最大活性磷酸供体为焦磷酸。单价金属离子能够明显地促进该酶的活性。还原剂对酶活力有一定促进作用。通过序列分析及结构比对，该酶属于甘油酸激酶叁分法分类中的第一家族。2．3几丁二糖脱乙酰酶通过PCR技术得到P．horikoshii几丁二糖脱乙酰酶基因(ORF PH0499)，将其克隆到重组质粒pET15b中，转化大肠杆菌后表达获得可溶的P．horikoshii几丁二糖脱乙酰酶(Dac_(ph))。该酶的最适生长温度与最适pH分别为90℃与pH 7.0。研究证明该酶能够脱去N-乙酰氨基葡萄糖、几丁二糖的一个乙酰基，并与氨基葡萄糖苷酶(BglA_(ph))共同作用水解几丁二糖生成氨基葡萄糖，因此被命名为一种几丁二糖脱乙酰酶。2．4几丁质内切酶和外切酶通过对P．furiosus中的几丁质内切与外切酶催化结构域进行研究，几丁质内切酶能够随机的水解几丁质或几丁寡糖内部的糖苷键，而外切酶(催化结构域)水解几丁质或几丁寡糖非还原性末端的第二个糖苷键。3．几丁质代谢相关嗜热酶的应用研究通过对几丁质代谢相关的嗜热酶的性质研究，探讨了其在生物催化与生物降解领域的应用。几丁质内切酶与外切酶在食品领域对于天然几丁质类物质的降解、生产几丁寡糖等方面具有广阔的应用前景。外切氨基葡萄糖苷酶对于制备氨基葡萄糖(优化盐酸水解方法)、分析非还原性末端带有氨基葡萄糖的壳聚糖、部分脱乙酰化的几丁寡糖、肽聚糖等几丁类糖链的结构具有一定的应用价值。外切氨基葡萄糖苷酶与几丁二糖脱乙酰酶配合，可以有目的的降解与转化几丁寡糖。甘油酸激酶则可以利用D-甘油酸来制备2-磷酸甘油酸。(本文来源于《山东大学》期刊2007-05-02）
几丁质代谢酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA,反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测该基因的表达情况,确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照;最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化,分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显着下降,其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显着下降,同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制,但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降,dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果,整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显;dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显,Validamycin能够显着降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达,且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升,dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升;Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显着下降,dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显着上升;dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降,Cht2和Cht4表达显着上升;dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显着上升;dsTRE1s注射后,Cht1和Cht5表达显着下降,而Cht9表达显着上升;Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显着或者极显着下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成,结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
几丁质代谢酶论文参考文献
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