导读:本文包含了硝基还原酶基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:二甲戊灵,微生物降解,Bacillus,subtilis,Y3,代谢途径
硝基还原酶基因论文文献综述
倪海燕[1]（2016）在《二甲戊灵降解菌株分离鉴定、降解途径分析及硝基还原酶基因克隆》一文中研究指出二甲戊灵[N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲苯胺],属于二硝基苯胺类除草剂,是世界上销售量第叁大的除草剂及销售量最大的选择性除草剂,广泛应用于防除旱田和菜田中的一年生禾本科杂草和某些一年生阔叶杂草。但二甲戊灵化学性质稳定,在环境中残留期较长,对水生生物及陆生无脊椎动物高毒,且具有潜在致癌性。因此研究二甲戊灵在环境中的迁移转化等行为,阐明二甲戊灵在环境中的降解过程和机制,对于评估二甲戊灵应用后的环境行为、毒理和生态安全性具有重要意义。研究表明微生物降解代谢是环境中二甲戊灵消解的主要因素,近年来,已分离筛选到多株降解二甲戊灵的细菌和真菌,并鉴定了多个中间降解产物。但二甲戊灵微生物降解的代谢途径全过程及参与其中的酶和基因至今还没有得到阐明。同时,分离筛选高效的二甲戊灵降解菌株可用于研发二甲戊灵残留污染生物修复技术,具有很强的应用价值。此外,除草剂降解/脱毒酶基因在抗除草剂转基因工程领域具有潜在的应用价值,而我国目前还缺乏具有自主知识产权的性能优良的除草剂降解/脱毒酶基因。抗除草剂转基因工程可以极有效地控制农田杂草,其中最为成功的是抗草甘膦转基因作物,已经大量种植。但长期使用草甘膦带来严重的杂草抗性问题,急需发掘其它除草剂降解/脱毒酶基因,为研发新的抗除草剂转基因作物提供基因资源。二甲戊灵是一种广泛使用的杀草谱较广的除草剂,可作为抗除草剂转基因工程的靶标除草剂,因此二甲戊灵降解/脱毒酶基因在构建抗除草剂作物中具有很好的应用前景。本论文利用微生物富集驯化技术从活性污泥中分离到一株高效的二甲戊灵降解菌株Y3,对该菌株进行了分类鉴定,利用高效液相色谱(HPLC)和串联质谱(MS/MS)技术对菌株Y3降解代谢二甲戊灵的产物进行鉴定,发现了 2个新的代谢产物。克隆到二甲戊灵降解关键基因硝基还原酶基因pnr,研究了 PNR的酶学特性。本文从菌株、酶学和基因水平对二甲戊灵的微生物降解机制进行了阐述。研究结果为进一步深入研究二甲戊灵在环境中的降解规律和机制提供理论依据,为研发二甲戊灵残留污染土壤和水体生物修复技术提供高效降解菌株,为抗除草剂转基因作物的构建提供具有我国自主知识产权的性能优良的降解基因。本研究主要研究结果如下:1二甲戊灵降解菌株的分离筛选与鉴定以二甲戊灵为底物,通过富集驯化技术从处理二甲戊灵生产废水的活性污泥中分离纯化得到一株二甲戊灵高效降解菌株,命名为Y3。菌株Y3能以二甲戊灵为唯一碳源和能源生长,在36 h内能降解82%的100 mg/L二甲戊灵,60 h内能降解100%的100 mg/L二甲戊灵。菌株Y3在LB平板上菌落形态呈乳白色,边缘褶皱不规则,菌落表面较干燥,革兰氏染色呈阳性,菌体杆状、好氧、产芽孢和周生鞭毛运动。16SrRNA基因系统发育进化分析表明菌株Y3与Bacillus属的亲缘关系最近,与Bacillus subtilis菌株聚成一个分支。菌株Y3的16S rRNA基因序列与Bacillussubtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T 的 16S rRNA 序列相似性达到 99.9%,与Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB 3610T 的相似性为 99.4%,与Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T的相似性为99.1%。DNA-DNA杂交结果表明菌株Y3和Bacillus subtilis KCTC 13429T杂交率为75.3%,高于70%这一种间的界定阈值。结合菌株Y3的菌落形态特征、生理生化特征、16SrRNA基因系统发育进化分析和DNA-DNA杂交,将菌株Y3鉴定为 Bacillus subtilis。菌株Y3降解二甲戊灵的最适温度为30℃,最适pH为7.5。菌株Y3能降解二硝基苯胺类除草剂其他叁种主要品种仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵,菌株Y3对二甲戊灵、仲丁灵和氨磺灵的降解速率没有显着差异,但对氟乐灵的降解速率显着低于二甲戊灵。此外菌株Y3还能降解二苯醚除草剂乳氟禾草灵和乙羧氟草醚。2菌株Y3降解二甲戊灵的代谢产物鉴定和代谢途径研究采用HPLC-MS/MS方法对菌株Y3降解二甲戊灵的代谢产物进行了鉴定。HPLC检测到3个保留时间分别为8.92 min、4.85 min和4.5 min的产物峰,其[M+H]+分别为m/z252.17、m/z266.15和m/z250.12,经MS/MS分析将这叁个产物分别鉴定为6-氨基二甲戊灵、5-氨基-2-甲基-3-亚硝基-4-(戊烷基-3-氨基)-苯甲酸和8-氨基-2-乙基-5-(羟甲基)-1,2-二氢喹喔啉-6-羧酸。根据代谢产物鉴定结果推测菌株Y3降解二甲戊灵的部分代谢途径为:首先通过硝基还原作用将二甲戊灵转化成6-氨基二甲戊灵,进而又发生硝基还原作用和羧化作用生成5-氨基-2-甲基-3-亚硝基-4-(戊烷基-3氨基)-苯甲酸,随后发生环化和羟基化作用得到8-氨基-2-乙基-5-(羟甲基)-1,2-二氢喹喔啉-6-羧酸。3菌株Y3中二甲戊灵硝基还原酶基因pnr的克隆与鉴定为克隆菌株Y3的二甲戊灵硝基还原酶基因pnr,首先通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析、疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等蛋白纯化技术对菌株Y3的二甲戊灵硝基还原酶进行了纯化。经四步纯化后,二甲戊灵硝基还原酶的比酶活由起始的0.38 U/mg protein提高到了 18.5 U/mg protein,目标蛋白浓缩了 48.7倍。纯化得到的二甲戊灵硝基还原酶经Native-PAGE电泳后割胶,利用MALDI-TOF-MS技术进行蛋白质肽指纹图谱分析,将获得的肽段序列与菌株Y3基因组框架图中注释的蛋白氨基酸序列进行匹配分析,结果找到一个注释为硝基还原酶的 ORF(ORF03879)。将该 ORF 连入 pET29a(+)后导入Escherichia coli BL21(DE3)进行蛋白异源表达,产物通过亲和层析纯化。酶活测定结果表明纯化的表达产物具有二甲戊灵硝基还原酶活性,比酶活为25.1 U/mg protein。UHPLC-MS/MS和1H NMR鉴定结果表明PNR催化了二甲戊灵芳环C-6硝基基团的还原,生成产物6-氨基二甲戊灵,说明该ORF就是pnr。PNR由209个氨基酸组成,编码基因630 bp,蛋白分子量约为23 kDa。对蛋白氨基酸序列进行比对分析,PNR与B.subtilis subsp.strain 168中的一个功能未鉴定报道的NAD(P)H依赖型硝基还原酶YdgI有100%的序列相似性。在催化功能已鉴定并公开报道的硝基还原酶中,PNR与来源于Lactobacillus plantarum WCFS1的硝基苯甲酸硝基还原酶PnbA氨基酸序列相似性最高(仅35%),PNR与来源于Synechocystis sp.的醌还原酶DrgA有31%的氨基酸序列相似性,与Vbrio fischeri的NAD(P)H-flavin氧化还原酶Frase Ⅰ氨基酸序列相似性达到29%,与Pseudomonas putida的NAD(P)H-依赖型的氧化还原酶PnrB的相似性为28%。蛋白氨基酸系列系统发育进化分析表明二甲戊灵硝基还原酶PNR是Ⅰ型硝基还原酶GroupB亚家族B1中的一员。实时荧光定量PCR检测结果表明pnr基因在菌株Y3中为组成型表达。4二甲戊灵硝基还原酶PNR的酶学特性研究PNR的最适反应pH为7.0,最适反应温度为35℃;PNR在pH<5.0或pH>8.8,及温度高于50℃时不稳定。1.0mM的Li+、K+、Co~(2+)、Mn~(2+)和Ni~(2+)对酶活没有显着影响,1.0 mM的Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Fe3+对酶活有一定的促进作用,而1.0 mM的Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Ag+和Zn~(2+)对酶活有一定的抑制作用。100.0mMEDTA对酶活没有明显影响,100.0 mM SDS对酶活有微弱的抑制作用。100.0 mM还原剂DTT能显着促进PNR的活性。PNR仅能催化二甲戊灵的芳环C-6位的硝基还原为氨基,不能催化芳环C-2位硝基的还原。此外,PNR还能连续催化仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的两个芳环硝基基团还原。PNR对二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的Vmax/Km分别为33.63、33.34、33.31 和 31.10。(本文来源于《南京农业大学》期刊2016-06-01）
丁朋举[2]（2013）在《分枝杆菌系统进化及其硝基还原酶基因克隆表达》一文中研究指出分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌是引起人类患结核病的主要病原微生物,目前结核病仍然是我国严重的公共卫生问题。本文旨在通过对结核分枝杆菌(北京谱系)的群体遗传关系及脓肿分枝杆菌中硝基还原酶基因的克隆表达相关研究,希望能够为结核病防控策略的制定及快速准确的鉴定分枝杆菌提供参考依据。本文首先采用24位点VNTR基因分型技术对我国北方五省(黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和宁夏)的234株结核分枝杆菌(北京谱系)进行了分型鉴定,各VNTR位点的等位基因多态性(h)普遍较低(h值范围：0.000-0.744)；个体水平系统发育分析显示各菌株分散存在于N-J树的各个进化分枝,最小生成树中约62.0%(145/234)的菌株被划分到同一“克隆复合群”;群体水平系统发育树显示234株菌与MIRU-VNTRplus数据库(http://www.miru-vntrplus.org)中的结核分枝杆菌(北京谱系)的遗传关系最近(Bootstrap值为100)；通过贝叶斯模型计算了最近共祖年代约为5308年(95%CIs：4263年-6470年)；分子方差分析结果表明吉林与黑龙江、辽宁两省菌株之间,内蒙古与宁夏菌株之间遗传分化系数不存在显着统计学差异(P>0.05)。采用生物信息学方法对脓肿分枝杆菌中被注释为" putative nitroreductase "的基因进行了预测分析,结果显示该基因编码219个氨基酸；对应的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质(不稳定系数为54.52,总平均亲水性为-0.244)；理论分子量和等电点分别为24.38KDa和6.52；蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折迭和无规卷曲为主要构件；氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%,空间结构预测表明该蛋白是硝基还原酶家族成员之一,可能具有还原对硝基苯甲酸的功能。利用大肠杆菌表达系统对"putative nitroreductase"基因进行了体外表达,目的蛋白以包涵体形式存在；采用亲和层析方法对包涵体蛋白进行了纯化,并通过透析复性处理,得到了可溶性的目的蛋白；灰度扫描分析结果显示其纯度为89.6%; Western blot结果显示在约30KDa处得到了显色带,且特异性较好；BCA蛋白定量法测得其浓度为0.59μg/μL;酶的比活力为32.2U/mg。应用Plackett-Burman设计考察了影响目的蛋白表达量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、IPTG、诱导温度、诱导时间、卡那霉素浓度和pH值8个因素,从中筛选出了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间叁个主要影响因素；通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域并找出了响应面优化的中心点；运用Box-Behnken设计及响应面分析法确定了重要因素的最佳水平,即IPTG浓度：0.67mM、诱导温度：40℃、诱导时间：6.8h,Y的最大估计值为59.4%。对模型预测的准确性进行了验证,实验结果接近优化预测值。(本文来源于《河南工业大学》期刊2013-04-01）
丁朋举,惠明,姜广路,戴广明,赵立平[3]（2013）在《脓肿分枝杆菌硝基还原酶基因的克隆表达及生物信息学分析(英文)》一文中研究指出目的克隆表达脓肿分枝杆菌中的硝基还原酶(nitroreductase,Nrd)基因,并对其对应的蛋白质进行生物信息学分析。方法利用PCR技术从脓肿分枝杆菌中扩增Nrd的全基因序列,采用原核表达系统进行体外表达。采用生物信息学方法对Nrd蛋白的理化性质、结构和功能等重要参数进行了预测和分析,对其叁级结构进行了同源建模。结果从脓肿分枝杆菌中扩增出660bp的目的片段,体外表达获得了大小约为30kDa的带有His标签的重组蛋白。生物信息学分析显示Nrd蛋白有219个氨基酸组成,理论分子量和等电点分别为24.38kDa和6.52,是一种不稳定的亲水性蛋白质(不稳定系数为54.52,总平均亲水性为-0.244);二级结构以α-螺旋、β-折迭和无规卷曲为主要构件;该蛋白的氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%,以3gr3蛋白A链为模板构建了Nrd蛋白的叁维结构分子模型。结论成功表达并纯化了脓肿分枝杆菌中的Nrd蛋白。预测结果显示该蛋白是硝基还原酶家族成员之一,这提示Nrd蛋白在脓肿分枝杆菌中可能执行还原对硝基苯甲酸的功能。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2013年02期）
任海涛,徐樨巍,李爱华[4]（2012）在《幽门螺杆菌感染患儿血细胞毒素相关性基因A、空泡毒素蛋白、尿毒酶、热休克蛋白60和硝基还原酶的分布及其诊断价值》一文中研究指出目的探讨基因芯片检测幽门螺杆菌(Hp)感染患儿血细胞毒素相关基因A(CagA)、空泡毒素蛋白(VacA)、尿毒酶(Ure)、热休克蛋白60(Hsp60)和硝基还原酶(RdxA)等毒力因子分布情况及胃镜下组织学表现。方法选取2007年10月-2008年5月在本院住院,具有腹痛、呕吐、呕血、黑便等消化系统症状,经2种及2种以上方法确诊为Hp感染的患儿30例。经胃镜诊断分为胃炎组(n=23)和消化性溃疡组(n=7),观察相应的CagA、VacA、Ure、Hsp60和RdxA等毒力因子抗体在不同疾病的分布情况;同时观察其胃镜下胃组织学表现,评估Hp毒力因子抗体与胃镜下表现及相关疾病的关系。比较CagA在胃炎组和消化性溃疡组的分布情况,应用SPSS 17.0软件进行统计学处理。结果 30例Hp感染患儿的致病毒力因子分布情况:CagA阳性29例(占96.7%)、Ure阳性14例(占46.7%)、RdxA阳性7例(占23.3%)、Hsp60 3例(占10.0%)和VacA阳性1例(占3.3%)。消化性溃疡组CagA阳性率(100%)高于胃炎组CagA阳性率(95.7%),但差异无统计学意义(χ2=1.000,P>0.05)。胃镜下胃炎组表现为黏膜充血、水肿、点片状出血斑、颗粒样变性、花斑样变性,消化性溃疡组表现为溃疡、黏膜充血水肿、出血样变,有时伴有食管胃底静脉曲张。抗CagA阳性患儿对应黏膜改变最为广泛。结论 Hp感染与CagA、VacA、Ure、Hsp60和RdxA等毒力因子相关,与CagA关系最为密切,VacA与疾病的严重程度相关。CagA阳性能够增加细胞毒素的活性,但其结果并不能预示疾病发展为胃炎或者消化性溃疡。(本文来源于《实用儿科临床杂志》期刊2012年13期）
胡华[5]（2011）在《Pandoraea sp.BD-33硝基苯硝基还原酶基因的克隆、表达及其酶性质研究》一文中研究指出硝基还原酶是一种对辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)以及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性的还原酶,本论文研究的硝基苯硝基还原酶(nitrobenzene nitroreductase, NN-BD-33)就是其中一种,它参与硝基苯的代谢,催化降解硝基苯成羟基苯胺,同时辅酶NADPH被氧化为NADP+。在常见的硝基苯硝基还原酶当中,NN-BD-33具有低Km值、基本无逆反应、较宽的热稳定性等优点,这些特性决定其在含硝基苯工业废水治理领域具有较高的应用价值和广阔的应用前景。本论文从已报道的硝基苯硝基还原酶同源序列入手,以实验室保藏的若干细菌为靶标,通过分子生物学方法从Pandoraea sp. BD-33菌株中克隆到硝基苯硝基还原酶基因,构建硝基苯硝基还原酶基因重组表达质粒,通过诱导表达和亲和层析纯化,获得重组硝基苯硝基还原酶,进而研究了该硝基苯硝基还原酶的性质。论文的主要研究成果如下：1)从Pandoraea sp. BD-33菌株中克隆到硝基苯硝基还原酶全长基因并测序,得到792 bp的片段,该基因编码263个氨基酸残基序列。2)将硝基苯硝基还原酶基因克隆后与表达质粒pET-28a(+)连接,成功构建硝基苯硝基还原酶重组质粒pET-28a-NB,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导后高效表达。3)对重组硝基苯硝基还原酶进行Ni-NTA亲和层析纯化,获得了高纯度的酶液。纯化后的硝基苯硝基还原酶在SDS-PAGE中显示为单一的条带。通过与标准蛋白的比较计算,测定重组酶的分子量为29.24 kDa。4)系统研究了重组硝基苯硝基还原酶的各项性质,包括最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性和稳态动力学研究。结果发现：重组酶的最适反应温度为40℃,在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中不同温度处理30min后,测定残余酶活力,结果发现重组酶在45℃以下稳定；重组酶的最适pH值为7.5,在不同pH条件下25℃处理1h后测定残余酶活,结果发现该酶在pH 7.5处最稳定；重组酶对硝基苯的Km和Kcat分别是1.154±0.495μM和2.626±0.034 S-1,对NADPH的Km和Kcat分别是833.78±89.5μM和21.066±1.528 S-1。这些研究为环境污染治理提供了可靠的数据支撑,为进一步深入研究该硝基苯硝基还原酶的催化机理及酶蛋白叁维结构研究奠定基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2011-01-01）
滕隔玲,杨业鹏,李载权,周梅,李五岭[6]（2009）在《硝基还原酶/CB1954自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞杀伤效应的实验研究》一文中研究指出目的:体外观察大肠杆菌硝基还原酶/[5-(1-氮丙啶)-2,4-二硝基苯甲酰胺](以下简称NTR/CB1954)自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞的杀伤效应,探索一种新的宫颈癌基因治疗方法。方法:利用PCR技术从Escherichia coli K12的基因组中扩增出编码NTR的基因nfsB,酶切后,连接到真核表达载体pcDNA3上,获得重组载体pcDNA3-nfsB,lipofectamineTM2000脂质体转染法将pcDNA3-nfsB转染Hela细胞,筛选稳定表达细胞株,应用RT-PCR以及SDS-PAGE检测NTR在Hela细胞中的表达,MTT法检测NTR/CB1954对Hela细胞活力的影响,流式细胞术检测亚二倍体细胞率改变,PI/Hoechest33258双染荧光显微镜下观察Hela细胞凋亡率。结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3-nfsB,获得稳定表达NTR的Hela细胞株,在mRNA水平以及蛋白水平检测到NTR在Hela细胞中的表达,NTR/CB1954自杀基因系统明显影响Hela细胞的活力,增加了Hela细胞的凋亡率。结论:NTR/CB1954自杀基因系统对Hela细胞在体外通过凋亡产生明显的杀伤效应。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2009年08期）
聂新民,周鸣,唐珂,张必成,向娟娟[7]（2003）在《一个与化学因素致鼻咽癌相关的硝基还原酶基因的克隆与鉴定(英文)》一文中研究指出在运用cDNAmicroarray分析鼻咽癌细胞系CNE1与正常鼻咽上皮细胞差异表达基因的基础上 ,发现ESTW 95 442在细胞系CNE1中存在明显表达下调 .随后采用生物信息学的方法克隆出了该EST所代表的硝基还原酶基因NOR1(GenBank登录号为AF4 6 2 348) .Northern印迹分析表明 ,该基因在脑、心脏、肺等正常组织中均有 2个转录产物 (1.6kb ,1.2kb) .RT PCR分析显示 ,NOR1基因在鼻咽癌活检组织中也存在表达下调 .但酶活性测定实验表明 ,它在鼻咽癌细胞系CNE1中的活性比正常鼻咽上皮细胞高 .通过基因转染实验发现NOR1基因具有与细菌硝基还原酶NTR相似的功能 ,能够将单功能烷基化试剂 2 硝基苯氮丙啶类化合物CB195 4的第 4位硝基还原成亚硝基从而生成细胞毒性物质 .研究结果表明 ,NOR1基因可能通过它的亚硝化作用及高活性而参与化学性因素致鼻咽癌的过程(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2003年04期）
熊炜,曾朝阳,肖炳燚,熊芳,聂新民[8]（2003）在《一个新硝基还原酶基因NOR1编码区单核苷酸多态及与鼻咽癌的关联分析》一文中研究指出NOR1基因是中南大学湘雅医学院肿瘤研究所克隆的一个鼻咽癌表达下调新基因 ,生物信息学预测NOR1基因含有硝基还原酶结构域 ,该基因可能参与亚硝胺类化学致癌物在体内的代谢过程 ,从而与鼻咽癌的发生密切相关 .通过采用病例 对照的研究方法 ,利用测序技术对 144名鼻咽癌患者和匹配的 144名正常人NOR1基因编码区单核苷酸多态 (codingregionsinglenucleotidepolymorphisms ,cSNPs)进行基因分型 ,关联分析结果显示所检测到的两个cSNPs之间存在连锁不平衡 ,且均与鼻咽癌发病相关 ,两个cSNPs及它们所组成的单倍型相对危险度分别为 1 3 6、 1 64和 1 3 7.两个cSNPs的多态性改变均使NOR1基因编码蛋白一级结构发生了变化 ,这种改变可能影响NOR1基因编码蛋白的结构和功能 .研究进一步支持了NOR1基因与鼻咽癌的发生发展可能存在密切的关系(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2003年03期）
聂新民,肖炳,李小玲,张必成,李伟芳[9]（2003）在《新克隆的硝基还原酶基因NOR_1的表达及其产物的纯化》一文中研究指出背景与目的:NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤/易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白。方法:抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT-PCR扩增NOR1基因全长,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后插入同样经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-thiogalactoside,IPTG)诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Westernblot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。结果:酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Westernblot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白。结论:成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础。(本文来源于《癌症》期刊2003年02期）
硝基还原酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌是引起人类患结核病的主要病原微生物,目前结核病仍然是我国严重的公共卫生问题。本文旨在通过对结核分枝杆菌(北京谱系)的群体遗传关系及脓肿分枝杆菌中硝基还原酶基因的克隆表达相关研究,希望能够为结核病防控策略的制定及快速准确的鉴定分枝杆菌提供参考依据。本文首先采用24位点VNTR基因分型技术对我国北方五省(黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和宁夏)的234株结核分枝杆菌(北京谱系)进行了分型鉴定,各VNTR位点的等位基因多态性(h)普遍较低(h值范围：0.000-0.744)；个体水平系统发育分析显示各菌株分散存在于N-J树的各个进化分枝,最小生成树中约62.0%(145/234)的菌株被划分到同一“克隆复合群”;群体水平系统发育树显示234株菌与MIRU-VNTRplus数据库(http://www.miru-vntrplus.org)中的结核分枝杆菌(北京谱系)的遗传关系最近(Bootstrap值为100)；通过贝叶斯模型计算了最近共祖年代约为5308年(95%CIs：4263年-6470年)；分子方差分析结果表明吉林与黑龙江、辽宁两省菌株之间,内蒙古与宁夏菌株之间遗传分化系数不存在显着统计学差异(P>0.05)。采用生物信息学方法对脓肿分枝杆菌中被注释为" putative nitroreductase "的基因进行了预测分析,结果显示该基因编码219个氨基酸；对应的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质(不稳定系数为54.52,总平均亲水性为-0.244)；理论分子量和等电点分别为24.38KDa和6.52；蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折迭和无规卷曲为主要构件；氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%,空间结构预测表明该蛋白是硝基还原酶家族成员之一,可能具有还原对硝基苯甲酸的功能。利用大肠杆菌表达系统对"putative nitroreductase"基因进行了体外表达,目的蛋白以包涵体形式存在；采用亲和层析方法对包涵体蛋白进行了纯化,并通过透析复性处理,得到了可溶性的目的蛋白；灰度扫描分析结果显示其纯度为89.6%; Western blot结果显示在约30KDa处得到了显色带,且特异性较好；BCA蛋白定量法测得其浓度为0.59μg/μL;酶的比活力为32.2U/mg。应用Plackett-Burman设计考察了影响目的蛋白表达量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、IPTG、诱导温度、诱导时间、卡那霉素浓度和pH值8个因素,从中筛选出了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间叁个主要影响因素；通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域并找出了响应面优化的中心点；运用Box-Behnken设计及响应面分析法确定了重要因素的最佳水平,即IPTG浓度：0.67mM、诱导温度：40℃、诱导时间：6.8h,Y的最大估计值为59.4%。对模型预测的准确性进行了验证,实验结果接近优化预测值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
硝基还原酶基因论文参考文献
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