本文主要研究内容
作者梁浩勤（2019）在《BVDV、BPV、BPIV探针qRT-PCR检测方法的建立及初步应用》一文中研究指出：随着生产力水平的提升,国家大力发展畜牧业,奶牛、肉牛养殖逐渐呈现规模化、机械化、产业化,许多从前散发性流行的疫病,现都呈现群发的趋势,从而也对病原监测提出了更高的要求。相比以前农户散养方式不同,许多病原由于地方局限性,多呈地方性流行,如今进出口、进出境贸易的频繁加速了这些疫病的传播,加之某些疫病呈隐性感染,成为畜牧业的最大隐患。因此,有效的诊疗手段是当今畜牧贸易检疫重要的一环。本研究应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术,建立针对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV)、牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus,BPIV)等常见病原的快速检测方法。经过比对GenBank中多条BVDV 1型5’-UTR基因、BPV的主要结构蛋白VP2基因以及BPIV的核蛋白N基因的序列,各自设计了一对特异性引物和带有不同荧光基团的探针,并建立了BVDV、BPV和BPIV 3种探针qRT-PCR,同时还建立了BPV和BPIV双重TaqMan qRT-PCR检测方法。分别通过对退火温度、引物浓度、探针浓度等条件的双重优化,结果显示,建立的三种探针qRT-PCR和双重TaqMan qRT-PCR均具有良好的重复性和敏感性。建立的BVDV探针qRT-PCR方法,在检测BVDV特异性时,只能特异性地检测出BVDV,而对同科同属病毒CSFV和同科不同属的JEV、RABV均无法扩增,表明该法能鉴别出同科同属的病毒,特异性强;线性关系好,以标准质粒pMD18-T-BVDV 5’-UTR建立的标准曲线,相关系数达0.999%以上;敏感性高,最低能检测到1.55个拷贝数(copies)/μL的BVDV标准质粒,比普通PCR高100000倍;重复性好,组内和组间变异系数都小于1.7%。建立的BPV和BPIV探针qRT-PCR检测方法,一样具有强特异性、高敏感性和好的重复性。它们在检测其他病原时,探针均未与非特异性模板发生结合;BPV和BPIV法检测限度比普通PCR分别提高了10000倍和100倍;其组内和组间重复性均小于1.65%。用建立的BPV TaqMan荧光定量检测43份腹泻犊牛粪便样品时,结果BPV阳性有4份,阳性率为9.30%。在建立特异性、敏感性和重复性好的基础上,建立多重荧光定量PCR,可以减少试剂、样品的浪费,节约时间成本,提高工作效率。利用本法建立的BPV和BPIV双重荧光定量PCR检测牛常见病原时,仅能特异性检出BPV和BPIV的cDNA,说明该法具有很强的特异性且探针之间互不干扰。该法最低能够检出2.0×10~1 copies/μL pMD18-T-BPV和2.0×10~2 copies/μL pMD18-T-BPIV,组内和组间的重复性试验显示其变异系数均小于1.2%。总之,本研究成功建立了3种探针qRT-PCR检测方法和1个双重荧光定量PCR检测方法,给牛BVDV、BPV、BPIV检测提供技术手段。
Abstract
sui zhao sheng chan li shui ping de di sheng ,guo jia da li fa zhan chu mu ye ,nai niu 、rou niu yang shi zhu jian cheng xian gui mo hua 、ji xie hua 、chan ye hua ,hu duo cong qian san fa xing liu hang de yi bing ,xian dou cheng xian qun fa de qu shi ,cong er ye dui bing yuan jian ce di chu le geng gao de yao qiu 。xiang bi yi qian nong hu san yang fang shi bu tong ,hu duo bing yuan you yu de fang ju xian xing ,duo cheng de fang xing liu hang ,ru jin jin chu kou 、jin chu jing mao yi de pin fan jia su le zhe xie yi bing de chuan bo ,jia zhi mou xie yi bing cheng yin xing gan ran ,cheng wei chu mu ye de zui da yin huan 。yin ci ,you xiao de zhen liao shou duan shi dang jin chu mu mao yi jian yi chong yao de yi huan 。ben yan jiu ying yong shi shi ying guang ding liang PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)ji shu ,jian li zhen dui niu bing du xing fu xie bing du (Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、niu xi xiao bing du (Bovine parvovirus,BPV)、niu fu liu gan bing du (Bovine parainfluenza virus,BPIV)deng chang jian bing yuan de kuai su jian ce fang fa 。jing guo bi dui GenBankzhong duo tiao BVDV 1xing 5’-UTRji yin 、BPVde zhu yao jie gou dan bai VP2ji yin yi ji BPIVde he dan bai Nji yin de xu lie ,ge zi she ji le yi dui te yi xing yin wu he dai you bu tong ying guang ji tuan de tan zhen ,bing jian li le BVDV、BPVhe BPIV 3chong tan zhen qRT-PCR,tong shi hai jian li le BPVhe BPIVshuang chong TaqMan qRT-PCRjian ce fang fa 。fen bie tong guo dui tui huo wen du 、yin wu nong du 、tan zhen nong du deng tiao jian de shuang chong you hua ,jie guo xian shi ,jian li de san chong tan zhen qRT-PCRhe shuang chong TaqMan qRT-PCRjun ju you liang hao de chong fu xing he min gan xing 。jian li de BVDVtan zhen qRT-PCRfang fa ,zai jian ce BVDVte yi xing shi ,zhi neng te yi xing de jian ce chu BVDV,er dui tong ke tong shu bing du CSFVhe tong ke bu tong shu de JEV、RABVjun mo fa kuo zeng ,biao ming gai fa neng jian bie chu tong ke tong shu de bing du ,te yi xing jiang ;xian xing guan ji hao ,yi biao zhun zhi li pMD18-T-BVDV 5’-UTRjian li de biao zhun qu xian ,xiang guan ji shu da 0.999%yi shang ;min gan xing gao ,zui di neng jian ce dao 1.55ge kao bei shu (copies)/μLde BVDVbiao zhun zhi li ,bi pu tong PCRgao 100000bei ;chong fu xing hao ,zu nei he zu jian bian yi ji shu dou xiao yu 1.7%。jian li de BPVhe BPIVtan zhen qRT-PCRjian ce fang fa ,yi yang ju you jiang te yi xing 、gao min gan xing he hao de chong fu xing 。ta men zai jian ce ji ta bing yuan shi ,tan zhen jun wei yu fei te yi xing mo ban fa sheng jie ge ;BPVhe BPIVfa jian ce xian du bi pu tong PCRfen bie di gao le 10000bei he 100bei ;ji zu nei he zu jian chong fu xing jun xiao yu 1.65%。yong jian li de BPV TaqManying guang ding liang jian ce 43fen fu xie du niu fen bian yang pin shi ,jie guo BPVyang xing you 4fen ,yang xing lv wei 9.30%。zai jian li te yi xing 、min gan xing he chong fu xing hao de ji chu shang ,jian li duo chong ying guang ding liang PCR,ke yi jian shao shi ji 、yang pin de lang fei ,jie yao shi jian cheng ben ,di gao gong zuo xiao lv 。li yong ben fa jian li de BPVhe BPIVshuang chong ying guang ding liang PCRjian ce niu chang jian bing yuan shi ,jin neng te yi xing jian chu BPVhe BPIVde cDNA,shui ming gai fa ju you hen jiang de te yi xing ju tan zhen zhi jian hu bu gan rao 。gai fa zui di neng gou jian chu 2.0×10~1 copies/μL pMD18-T-BPVhe 2.0×10~2 copies/μL pMD18-T-BPIV,zu nei he zu jian de chong fu xing shi yan xian shi ji bian yi ji shu jun xiao yu 1.2%。zong zhi ,ben yan jiu cheng gong jian li le 3chong tan zhen qRT-PCRjian ce fang fa he 1ge shuang chong ying guang ding liang PCRjian ce fang fa ,gei niu BVDV、BPV、BPIVjian ce di gong ji shu shou duan 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北民族大学的梁浩勤，发表于刊物西北民族大学2019-07-15论文，是一篇关于牛病毒性腹泻病毒论文,牛细小病毒论文,牛副流感病毒论文,实时荧光定量论文,西北民族大学2019-07-15论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北民族大学2019-07-15论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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