杨森(综述)居军(审校)
（兰州大学第一临床医学院730000）
【关键词】血清标志物标记免疫分析实验室检测技术和方法
【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）08-0149-02
免疫分析技术是指利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法，根据抗原抗体反应性质可分为竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析，根据免疫分析中是否引入标记物可分为非标记性免疫分析和标记性免疫分析。其中标记免疫分析技术是将多种标记示踪技术的高灵敏性和医学免疫学抗原抗体反应的高特异性相结合的分析技术，利用先进的免疫分析技术与生物活性物质的结合，以了解人体内的某些生理活动或者体内某一活性物质的异常表现，辅助疾病的鉴定、早期诊断及预防以及治疗过程中的监控。本文以标记性免疫技术为中心，阐述目前临床检验科常用的针对血清标本的几种检测方法，包括酶联免疫吸附试验、放射性免疫分析法、化学发光免疫分析法和生物芯片技术等。现将技术介绍如下：
1.方法介绍
1.1酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)
该技术是将抗体（抗原）包被在固相表面后，加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），与固相上形成抗原抗体复合物，洗去游离的酶标抗体（抗原）及未结合抗原（抗体），最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。
1.2放射免疫技术（radioimmunoassaytechnology）
该技术是抗原抗体结合反应的高特异性与放射性核素标记的高灵敏性的结合。分两种类型：放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）和免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。
RIA为竞争性免疫分析，标记抗原和待测抗原与抗体竞争性结合，计算标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原放射性活度的比值，其值与待测抗原的含量呈负相关。IRMA为非竞争性免疫分析，是将待测抗原与标记抗体进行非竞争性结合反应，再加入固相抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体，测定上清液中待测抗原抗体复合物的放射性活度。因为抗体易于提纯和进行碘化标记，并且IRMA使用过量的的标记抗体和固相抗体，因此IRMA的精密度相对高于RIA法[1]。
1.3发光免疫分析技术（chemiluminescenceimmunoassaytechnology）
该方法因其具有高敏感性和特异性而在临床检测中广泛应用[2]。其类型包括：化学发光免疫分析（CLIA）、化学发光酶免疫分析（CLEIA）、微粒子化学发光免疫分析（CMIA）、电化学发光免疫分析（ECLIA）。
CLIA是将化学或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测标本中的抗原或抗体。CLEIA属于酶免疫测定，最后一步酶反应所用底物为发光剂，产生发光效应，测定发光强度信号，分析被测抗原或抗体的含量。CMIA是以磁性微珠作为载体包被抗体，在磁场的作用下可迅速捕捉到被测抗原，与后加入的发光物质标记第二抗体形成双抗体夹心免疫复合物，测定免疫结合物中发光物质的发光强度以判断标本中的抗原的含量。ECLIA为电化学发光与免疫测定相结合的一种技术，利用电极表面的电化学发光反应检测标本。
1.4生物芯片技术（biochiptechnology）
源于EdwinSouthern提出的核酸杂交理论[3]。在芯片表面构建微型生物化学分析系统，对组织细胞中的蛋白质、DNA或者其他生物组分进行检测[4]。该技术可分为主动式和被动式芯片，其中被动式芯片即各种微阵列芯片，包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片。根据芯片的载体性质，蛋白质芯片又可分为固相和液相蛋白芯片。
固相蛋白芯片技术是将多种单克隆抗体固定与同一芯片，利用抗原抗体特异性结合的原理，达到对多种待检物定量检测的目的。液相蛋白芯片技术是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应以及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和荧光信号来达到定性和定量的目的。
2.方法学间的比较
2.1感染免疫相关标志物
有研究采用ECLIA和RIA两种方法复检ELISA阳性标本，发现ECLIA和RIA的结果较一致，均低于ELISA的阳性检测率[5]。使用原倍血清比较ELISA、CMIA、ECLIA三种方法检测单个HBcAb，其阳性率较一致。1:30倍稀释后其阳性检出率以ELISA法为最低，约37%左右，其他两种方法阳性检出率较接近[6]。虽然稀释后检测具有临床诊断意义，但稀释法可存在假阴性[7]。可先用ELISA法作为筛查，有可疑阳性标本再采用CMIA法复检[8]。
2.2肿瘤相关标志物
有研究分别用CLEIA、ELISA和IRMA三种方法检测血清CA125，对比发现在诊断卵巢癌方面，CLEIA法敏感性和特异性相对较高，相比后两种有明显的方法学优势[9]。蛋白芯片技术与RIA法比较，发现除AFP的敏感性较一致外，对CEA、CA199、CA242的检测，固相蛋白芯片技术的敏感性较高[10]。对于蛋白芯片与ECLIA法的比较，有研究对已确诊的肿瘤患者选用CA199、CA125、CA153、CA242、NSE、CEA、β-HCG、AFP、F-PSA、PSA、HGH和铁蛋白共12项指标进行两种方法学的对比，发现在正常组中两种方法的检测结果并无差异，肿瘤组中CA199、CA153和AFP的检测有差别，ECLIA法的检测结果较高，其余指标结果较一致[11]。通过收集各种肿瘤的血清标本，对液态芯片技术、ELISA和ECLIA做一比较，发现液态芯片技术敏感性比ELISA法较高，与ECLIA法较一致，并且对脂血、溶血和高胆红素标本抗干扰能力强[12]。有学者认为由于技术本身的限制及存在的假阳性率，利用生物芯片肿瘤标志物筛查技术值得商榷[13]。
2.3内分泌疾病相关标志物
采用CLIA、ECLIA、CLEIA三种方法对血清胰岛素和C-肽进行检测，其中CLIA与CLEIA之间差异较大，CLIA与ECLIA结果较一致[14]。对甲状腺疾病病人血清中TSH、FT3和FT4的测定，ECLIA法、TRFIA法、RIA法这三种方法所得结果相关性良好，ECLIA所具备的方法学优势更适用于临床辅助诊断、评估甲状腺疾病[15]。有相关文献使用ECLIA法和RIA法，对比检测血清绒毛膜促性腺激素方面的优越性，ELICA法的准确性和特异性都明显优于RIA法，更加符合现代化医院临床工作的需求[16]。
3.结语与展望
在临床快速诊断检测中，放免技术存在自动化程性低，有放射性污染等缺点，但此方法检测成本低，价格低廉，患者经济负担轻，适合于中小型规模的医院。化学发光技术检测环境相对封闭，标本和试剂对实验区及人员的污染几率小，即时检测灵活。液相与固相芯片均是在蛋白质水平上反应所测因子的变化，不同在于液相芯片的反应环境完全在液态中进行，有利于保持生物分子的空间构象和活性。
综上所述，各种检测方法在临床辅助诊断疾病、治疗和预后的过程中各有优缺点。标记免疫技术的发展离不开标记物的不断研发与合理应用。单克隆抗体技术的发展也保证了标记免疫分析技术的检验质量以及拓宽了其应用平台。各种检测技术的不断发展和完善在疾病检测方面可互相补足，对早发现、早治疗，降低病死率，提高患者生存率，改善患者的生活质量提供帮助。
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