本文主要研究内容
作者戚海惠（2019）在《基于VP0蛋白检测1型和3型DHAV抗体的间接ELISA的建立及应用》一文中研究指出：鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis virus,DHV)引起的雏鸭的一种急性、致死性疾病,由于其发病迅速且死亡率高,给养鸭业造成了巨大的经济损失。我国鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且比较常见的感染形式为两种型混合感染,因此急需一种操作简单、快速、成本低廉,且检出抗体全面的的检测方法。本研究首先以实验室保存的携带1型和3型VP0/VP3/VP1的重组质粒pMD18T-DHAV-1-1/2和pMD18T-DHAV3-1/2为模板,通过PCR扩增得到DHAV-1/3-VP0、DHAV-1/3-VP3和DHAV-1/3-VP1目的基因,将其克隆至pET-30a(+)和pET-32a(+)原核表达载体中,进行蛋白的原核表达,获得了Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP0、Rosetta-pET32a-DHAV1/3-VP1和Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP3重组蛋白。以纯化后的重组蛋白为抗原,利用Western Blot分别与同型和异型的鸭血清抗体进行免疫反应性分析,结果表明,重组VP0/VP1蛋白与同型和异型的鸭血清抗体均可发生反应,而重组VP3蛋白仅可与同型的鸭血清抗体反应。分别以纯化的6段重组蛋白作为包被抗原,利用ELISA方法检测重组蛋白与同型和异型血清抗体的免疫反应性,结果发现1型和3型重组VP0/VP3/VP1蛋白均可同时与同型和异型的血清抗体发生反应,重组VP0和VP3蛋白与同型抗体反应的强度大于与异型抗体反应的强度,重组VP1蛋白与同型和异型反应的强度相近。Western Blot和ELISA分析重组蛋白免疫反应性结果表明:重组VP0和VP1蛋白适合作DHAV血清抗体检测的群特异性抗原。综上,以纯化的1型重组VP0蛋白作为包被抗原,建立了一种可同时检测DAHV(1型和3型)血清抗体的ELISA方法。通过对方法进行优化,最佳的反应条件为:以0.25μg/mL 1型DHAV VP0重组蛋白37℃孵育2 h后4℃包被过夜;5%脱脂乳37℃封闭90 min;被检血清1:100倍稀释,37℃孵育1 h;HRP标记的山羊抗鸭IgG进行1:400倍稀释,37℃孵育1 h;TMB显色液避光显色15 min。通过对118份阴性鸭血清进行检测,最终确定阴阳性临界值为0.307;特异性试验结果显示,所建立的间接ELISA只与DHAV(1型和3型)阳性血清呈阳性反应,与鸭源小鹅瘟抗体、鸭病毒性肠炎抗体、禽流感H9N2亚型抗体、鸭坦布苏抗体等均无交叉反应;敏感性试验结果显示,所建立的间接ELISA最低检出量为1:320;该方法的板内和板间的变异系数均小于10%;应用本研究建立的VP0-ELISA检测方法与鸭甲肝病毒抗体(DHAV-Ab)定性ELISA检测试剂盒同时检测一批临床血清样本,两种检测方法符合率高达95.7%。说明本方法可初步应用于鸭甲型病毒肝炎抗体的检测,为今后DHAV感染的检测及二价疫苗免疫效果的评价提供技术支持,实现鸭病毒性肝炎的快速血清学诊断,进而促进养鸭业的健康发展。
Abstract
ya bing du xing gan yan (Duck Viral Hepatitis,DVH)shi you ya gan yan bing du (Duck Hepatitis virus,DHV)yin qi de chu ya de yi chong ji xing 、zhi si xing ji bing ,you yu ji fa bing xun su ju si wang lv gao ,gei yang ya ye zao cheng le ju da de jing ji sun shi 。wo guo ya bing du xing gan yan zhu yao shi you DHAV-1he DHAV-3yin qi de ,ju bi jiao chang jian de gan ran xing shi wei liang chong xing hun ge gan ran ,yin ci ji xu yi chong cao zuo jian chan 、kuai su 、cheng ben di lian ,ju jian chu kang ti quan mian de de jian ce fang fa 。ben yan jiu shou xian yi shi yan shi bao cun de xie dai 1xing he 3xing VP0/VP3/VP1de chong zu zhi li pMD18T-DHAV-1-1/2he pMD18T-DHAV3-1/2wei mo ban ,tong guo PCRkuo zeng de dao DHAV-1/3-VP0、DHAV-1/3-VP3he DHAV-1/3-VP1mu de ji yin ,jiang ji ke long zhi pET-30a(+)he pET-32a(+)yuan he biao da zai ti zhong ,jin hang dan bai de yuan he biao da ,huo de le Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP0、Rosetta-pET32a-DHAV1/3-VP1he Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP3chong zu dan bai 。yi chun hua hou de chong zu dan bai wei kang yuan ,li yong Western Blotfen bie yu tong xing he yi xing de ya xie qing kang ti jin hang mian yi fan ying xing fen xi ,jie guo biao ming ,chong zu VP0/VP1dan bai yu tong xing he yi xing de ya xie qing kang ti jun ke fa sheng fan ying ,er chong zu VP3dan bai jin ke yu tong xing de ya xie qing kang ti fan ying 。fen bie yi chun hua de 6duan chong zu dan bai zuo wei bao bei kang yuan ,li yong ELISAfang fa jian ce chong zu dan bai yu tong xing he yi xing xie qing kang ti de mian yi fan ying xing ,jie guo fa xian 1xing he 3xing chong zu VP0/VP3/VP1dan bai jun ke tong shi yu tong xing he yi xing de xie qing kang ti fa sheng fan ying ,chong zu VP0he VP3dan bai yu tong xing kang ti fan ying de jiang du da yu yu yi xing kang ti fan ying de jiang du ,chong zu VP1dan bai yu tong xing he yi xing fan ying de jiang du xiang jin 。Western Blothe ELISAfen xi chong zu dan bai mian yi fan ying xing jie guo biao ming :chong zu VP0he VP1dan bai kuo ge zuo DHAVxie qing kang ti jian ce de qun te yi xing kang yuan 。zeng shang ,yi chun hua de 1xing chong zu VP0dan bai zuo wei bao bei kang yuan ,jian li le yi chong ke tong shi jian ce DAHV(1xing he 3xing )xie qing kang ti de ELISAfang fa 。tong guo dui fang fa jin hang you hua ,zui jia de fan ying tiao jian wei :yi 0.25μg/mL 1xing DHAV VP0chong zu dan bai 37℃fu yo 2 hhou 4℃bao bei guo ye ;5%tuo zhi ru 37℃feng bi 90 min;bei jian xie qing 1:100bei xi shi ,37℃fu yo 1 h;HRPbiao ji de shan yang kang ya IgGjin hang 1:400bei xi shi ,37℃fu yo 1 h;TMBxian se ye bi guang xian se 15 min。tong guo dui 118fen yin xing ya xie qing jin hang jian ce ,zui zhong que ding yin yang xing lin jie zhi wei 0.307;te yi xing shi yan jie guo xian shi ,suo jian li de jian jie ELISAzhi yu DHAV(1xing he 3xing )yang xing xie qing cheng yang xing fan ying ,yu ya yuan xiao e wen kang ti 、ya bing du xing chang yan kang ti 、qin liu gan H9N2ya xing kang ti 、ya tan bu su kang ti deng jun mo jiao cha fan ying ;min gan xing shi yan jie guo xian shi ,suo jian li de jian jie ELISAzui di jian chu liang wei 1:320;gai fang fa de ban nei he ban jian de bian yi ji shu jun xiao yu 10%;ying yong ben yan jiu jian li de VP0-ELISAjian ce fang fa yu ya jia gan bing du kang ti (DHAV-Ab)ding xing ELISAjian ce shi ji he tong shi jian ce yi pi lin chuang xie qing yang ben ,liang chong jian ce fang fa fu ge lv gao da 95.7%。shui ming ben fang fa ke chu bu ying yong yu ya jia xing bing du gan yan kang ti de jian ce ,wei jin hou DHAVgan ran de jian ce ji er jia yi miao mian yi xiao guo de ping jia di gong ji shu zhi chi ,shi xian ya bing du xing gan yan de kuai su xie qing xue zhen duan ,jin er cu jin yang ya ye de jian kang fa zhan 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自东北农业大学的戚海惠，发表于刊物东北农业大学2019-08-27论文，是一篇关于结构蛋白论文,间接论文,检测论文,东北农业大学2019-08-27论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自东北农业大学2019-08-27论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：结构蛋白论文; 间接论文; 检测论文; 东北农业大学2019-08-27论文;