导读:本文包含了肿瘤翻译调控蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:脊尾白虾,TCTP,细胞自噬,卵黄蛋白
肿瘤翻译调控蛋白论文文献综述
马骊,葛倩倩,许杨,彭素晓,李健[1]（2018）在《脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP克隆及自噬调控相关基因在卵巢发育期的表达》一文中研究指出为深入了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育和卵黄蛋白原发生的分子机制,本研究克隆得到脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP,并结合自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在卵巢发育期的表达水平,阐释脊尾白虾卵黄蛋白原合成过程中的分子调控特征。研究显示,脊尾白虾TCTP基因c DNA全长为732 bp,编码168个氨基酸,具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信号通路相关的磷酸化位点。同时发现,甲壳动物TCTP普遍缺乏在其他动植物中高度保守的C末端的cys残基。进化分析显示,脊尾白虾TCTP与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲缘关系最近。4种自噬调控基因在脊尾白虾卵巢发育期的表达结果显示,肝胰腺TCTP基因从增殖期到产后恢复期呈递减趋势;肝胰腺Hif-1α、Beclin1和Bcl-2基因表达趋势相似,即从增殖期到小生长期高表达,大生长期极显着下降,表达量最低(P<0.01),这与外源性卵黄蛋白原的合成趋势大致相反。这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同调节外源性卵黄蛋白原的合成。卵巢TCTP基因在小生长期表达量最高;卵巢Hif-1α基因从增殖期到产后恢复期持续升高,这与内源性卵黄蛋白原表达趋势相似;卵巢Beclin1基因在大生长期表达量最高,与脊尾白虾卵巢Ec R表达趋势相似,与卵巢Bcl-2基因表达趋势相反,这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同促进内源性卵黄蛋白的合成。本研究表明,自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在脊尾白虾卵巢发育时期相互协调共同作用,可能通过自噬作用调节脊尾白虾卵黄蛋白原的合成和卵巢发育。(本文来源于《渔业科学进展》期刊2018年04期）
耿凤豪[2]（2017）在《肿瘤翻译控制蛋白TCTP调控自噬在改变胶质瘤细胞放疗敏感性中的作用研究》一文中研究指出胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在我国的发病率占原发脑肿瘤的31.1%,其中,胶质母细胞瘤(GBM,Glioblastoma Mutiforme)恶性程度最高,大约占胶质瘤的30%。GBM常呈侵袭性生长,与正常脑组织界限不明确,手术效果不佳并具有放疗抗性,尽管目前临床GBM的标准治疗方案是“手术+放疗+替莫唑胺(TMZ,Temozolomide)辅助化疗”,但整体预后不良,据统计,我国GBM患者的中位生存期仅为14.4个月。近年来,放疗技术发展迅速,但GBM放疗抵抗依然是临床治疗中面临的难题。研究表明,受照胶质瘤细胞的死亡主要通过自噬途径发生而不是凋亡,因此,围绕自噬开展针对GBM细胞的有效靶点及放疗敏感性研究是当今放射医学领域的热点问题。肿瘤翻译控制蛋白(TCTP,Translationally controlled tumor protein)是一种高度保守的亲水性小分子蛋白,广泛存在于真核组织细胞中,具有参与转录和翻译、调节细胞周期、抗凋亡、促进肿瘤形成和DNA损伤修复等多种重要功能,此外,TCTP的异常高表达与胶质瘤的临床病理分级及预后密切相关。尽管尚无直接证据表明TCTP参与调控肿瘤细胞的自噬,但已有研究证实,与TCTP直接相关的多个DNA损伤修复关键蛋白、应激反应和抗凋亡分子通路均在自噬调控中发挥重要作用,例如,缺氧和糖尿病状态下,TCTP可以通过AMPK通路或作为鸟苷酸转化因子调控mTORC1活性,而mTORC1复合物是自噬起始阶段最关键的复合物;从分子结构上分析,TCTP的N末端具有与Bcl-2家族蛋白BH3结构域结合的能力,而自噬起始阶段关键蛋白Beclin 1已被证实为一种新的BH3-only蛋白,因此,TCTP在结构上既具有同Beclin 1直接结合的可能,也具有影响Bcl-x L和Beclin 1结合的可能。本研究旨在阐明TCTP在受照GBM细胞自噬发生中的作用及其对细胞放疗敏感性的影响,通过围绕TCTP-mTORC1和TCTP-Beclin 1开展相关分子机制研究,为寻找针对GBM细胞辐射抵抗的关键靶分子提供理论和实验依据。研究采用AVO染色、自噬特异性染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染、透射电镜和蛋白质印记(WB,Western blot)等方法对受照胶质瘤细胞自噬流的变化进行动态监测;采用药物抑制或基因干扰的方法研究TCTP在受照GBM细胞自噬发生中的作用及相关分子机制;采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力;采用MTT、克隆形成和裸鼠成瘤实验等综合评估TCTP调控自噬对GBM细胞辐射敏感性的影响。研究主要发现:1.受照GBM细胞的自噬发生规律:与正常对照组相比,2Gy分割照射(≥5次)可引起胶质瘤细胞内p-mTORC1水平升高和自噬抑制;单次6Gy X射线辐照后1-3天,细胞内TCTP蛋白表达显着增多,照后4-7天,TCTP表达量逐渐降低,辐照后5到7天,Autophagy Assay Kit染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染实验和透射电镜结果显示,细胞内的自噬体和自噬溶酶体结构显着增多,Western Blot结果表明,自噬标记蛋白Beclin 1和LC3B的表达增加,提示受照胶质瘤细胞的自噬性死亡主要发生在辐照后5-7天。2.TCTP在受照GBM细胞自噬激活中的作用:筛选出针对GBM细胞有效抑制TCTP表达的药物:甲硫哒嗪和双氢青蒿素。实验显示,利用药物抑制受照GBM细胞的TCTP表达,辐照后48h,自噬标记物LC3B-II/I比例显着升高、p62表达降低,荧光染色和透射电镜结果进一步证实细胞内自噬发生;采用基因干扰技术(小干扰RNA或构建稳转低表达胶质瘤细胞系)抑制TCTP表达,结果与之一致,提示TCTP在受照胶质瘤细胞自噬的发生中发挥抑制作用。3.TCTP参与调控Beclin 1复合物功能和ATM-AMPK-mTOR信号通路:蛋白质共沉淀(Co IP,Co-Immunoprecipitation)和荧光共定位实验均证实,GBM细胞受到辐照后,TCTP与Beclin 1的共定位表达显着增强,同时,过表达TCTP可抑制Beclin 1与Vps34结合,相反,低表达TCTP可以促进二者的结合;WB结果显示,抑制TCTP表达,受照GBM细胞在辐照后48h即出现ATM-AMPK通路激活、mTOR抑制,从而激活自噬,提示TCTP可以通过ATM-AMPK通路调控自噬的发生。4.激活自噬或抑制TCTP均可有效提高GBM细胞的辐射敏感性:使用雷帕霉素激活受照GBM细胞自噬发生,细胞的划痕愈合能力明显降低,MTT增殖曲线下移;稳转低表达TCTP的GBM细胞受到辐照后,MTT实验表明细胞生存能力显着降低,Transwell实验显示细胞的迁移能力降低,双氢青蒿素在抑制TCTP激活自噬的同时可抑制受照胶质瘤细胞增殖和迁移。5.在体实验证实抑制TCTP可提高GBM的放疗敏感性:裸鼠移植瘤实验表明,腹腔注射双氢青蒿素可有效抑制脑肿瘤组织中的TCTP表达、降低受照荷瘤小鼠的移植瘤质量,同时伴随自噬标记物LC3B-II/I的比例显着增加。6.TCTP影响胶质瘤患者的预后:通过检索TCGA数据库,分析GBM患者临床和基因组数据发现,TCTP基因TPT1突变(缺失性为主)可显着延长GBM患者的中位生存期和无病生存期,同时,TPT1突变脑组织中的TP53/PTEN蛋白平均表达水平增加,伴随EGFR蛋白表达降低;接受标准放疗患者中,TCTP mRNA高表达者中位生存期明显缩短。研究结论:1.TCTP参与抑制受照GBM细胞的自噬发生。一方面,TCTP通过与Beclin 1相互作用而影响Beclin 1-Vps34复合物功能,另一方面,辐照后48h,TCTP可抑制ATM-AMPK信号通路,进而激活mTOR并抑制自噬发生。2.离体条件下,激活自噬或通过抑制TCTP激活自噬,均可提高GBM细胞的辐射敏感性;3.甲硫哒嗪和双氢青蒿素可有效抑制GBM细胞TCTP的表达,其中,双氢青蒿素可提高移植瘤裸鼠的放疗敏感性并激活GBM细胞自噬,提示TCTP参与调控受照GBM细胞的自噬并影响其辐射敏感性。4.TCTP影响胶质瘤患者放疗效果和预后;(本文来源于《第四军医大学》期刊2017-05-01）
雷朋,何庆玲,贺芳,吴琼英,潘刚[3]（2015）在《桑树翻译调控肿瘤蛋白(TCTP)基因的克隆及其在温度胁迫下的表达变化》一文中研究指出翻译调控肿瘤蛋白(TCTP)是一类广泛存在于真核生物中且具有多种重要生物学功能的蛋白质家族。利用RT-PCR和RACE技术从广东桑(Morus atropurpurea)品种中桑5801号植株的根部克隆了一种TCTP蛋白的编码基因,命名为Ma-TCTP(Gen Bank登录号:KP228013)。Ma-TCTP基因c DNA全长841 bp,包括507 bp的ORF以及101 bp的5'-UTR和233 bp的3'-UTR,ORF编码168个氨基酸,蛋白质分子质量为18.736 2 k D,等电点为4.53。实时荧光定量PCR检测Ma-TCTP基因在桑树的根部、茎部和叶片中均有表达,其中在根部组织中的表达量最高,茎中次之,叶片中最低。在低温(4℃)和高温(35℃)胁迫下,Ma-TCTP基因在桑树根部、茎部和叶片组织的表达量均大幅上升,其中在叶片中的表达量升高最为明显,推测Ma-TCTP基因可能参与桑树对温度逆境胁迫的生理应激响应过程。(本文来源于《蚕业科学》期刊2015年03期）
曹戟[4]（2013）在《活性氧簇（ROS）介导的蛋白翻译后修饰调控肿瘤细胞死亡的作用及其机制研究》一文中研究指出研究目的：恶性肿瘤是严重威胁我国人民生命的重大疾病之一。作为恶性肿瘤治疗中的重要组成——化疗一直受到广泛的重视,而化疗药物也一直是药物研发的热点和重点。常用的抗肿瘤药物往往可以直接或间接地通过活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)来起到杀伤肿瘤细胞的作用,而一些病人对这些抗肿瘤药物的耐受也往往是由于一些抗氧化蛋白在肿瘤细胞内高表达所引起。ROS是一类含有氧的活性分子的总称,在生理条件下,ROS通常是有氧呼吸及有氧代谢的天然副产物,在细胞信号转导以及维持细胞稳恒中扮演着重要的角色；而在某些环境刺激下ROS会激烈产生,进而引起细胞内蛋白、细胞器以及DNA等相关生物结构的破坏。虽然激烈产生的ROS可以诱导细胞死亡,但是生理条件下的ROS却是十分重要的信号分子,可以调控细胞内的许多信号通路。最新研究表明ROS可以通过氧化修饰蛋白质,进而引发相关的生物学改变,但其中的分子机制尚未阐明。因此研究活性氧在诱导肿瘤细胞死亡过程中的机制,不仅有助于发现新的生命现象,更有机会发现其中可被人为干预的关键节点,从中发现潜在的抗肿瘤药物靶点,为研发新型抗肿瘤药物提供新思路。4-HPR (N-4-hydroxyphenyl retinode,Fenretinide,4-羟苯基维胺脂)是合成的维甲酸衍生物,被公认是一种通过ROS发挥抗肿瘤活性的抗肿瘤药物。许多研究表明4-HPR具有肿瘤治疗作用,且在临床Ⅰ、Ⅱ期研究中发现4-HPR对多种肿瘤显示出了较好的抗肿瘤活性。鉴于ROS是4-HPR诱导肿瘤细胞死亡的重要原因,故我们拟以4-HPR作为分子探针,紧紧围绕蛋白质翻译后修饰这一环节开展系列研究,进一步探索ROS诱导的蛋白质翻译后修饰与抗肿瘤药物活性之间的联系。本课题的开展不仅有望阐明ROS诱导的蛋白质修饰调控抗肿瘤药物活性的分子机制,从中发现潜在的抗肿瘤药物药效学生物标记物,为氧化应激型抗肿瘤药物的临床应用提供指导,更有机会发现全新的抗肿瘤药物靶点,催生新型抗肿瘤治疗药物的研发。研究方法：1)研究抗肿瘤药物诱导的ROS对Akt蛋白翻译后修饰及其在诱导凋亡中的作用：细胞经Annexin V-PI染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡；细胞经JC-1染色后采用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位变化；应用Western blotting检测PARP, caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt(Ser473和Thr308)、GSK3β、p-GSK3β、.HSP90和PP2Ac等蛋白水平变化;应用免疫荧光法检测细胞内Akt蛋白与HSP90或PP2Ac蛋白的共定位变化；采用免疫沉淀法检测Akt蛋白与HSP90或PP2Ac蛋白的结合水平；采用汞溴红染色法检测细胞内二硫键生成水平；采用DCFDA染色结合流式细胞术检测细胞内ROS水平；采用自由巯基修饰剂NEM结合Western blotting检测细胞内Akt蛋白的氧化还原状态；采用ELISA法检测不同氧化状态Akt蛋白与HSP90蛋白的结合能力；采用改良的自由巯基修饰结合Western blotting检测细胞内Akt蛋白分子内二硫键的形成；应用NAC、GSH、DTT和catalase等多种抗氧化,检测对4-HPR诱导细胞凋亡的影响以及对Akt蛋白的影响；采用小鼠体内血糖变化实验,检测4-HPR体内对Akt蛋白的抑制作用。2)研究抗肿瘤药物诱导的ROS DJ-1蛋白的氧化态修饰及其在肿瘤自噬向凋亡转化过程中的作用：细胞经Annexin V-PI染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡；细胞经JC-1染色后采用流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位变化；应用Western blotting检测PARP、LC-3、DJ-1、ASK1、JNK、p-JNK、p38、p-p38、IRE1、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP等蛋白水平变化；应用免疫荧光法检测细胞内DJ-1蛋白与ASK1蛋白的共定位变化；采用免疫沉淀法检测ASK1蛋白与DJ-1或Trx等其他蛋白的结合水平；采用DCFDA染色结合流式细胞术检测细胞内ROS水平；采用AO染色法、MDC染色法和GFP-LC3B转让法结合荧光显微镜检测细胞自噬泡的形成；应用电子显微镜观察细胞内自噬泡的形成以及凋亡的发生情况；建立裸小鼠移植瘤模型,周于评价不同剂量4-HPR对不同细胞之间的抗肿瘤作用；采用TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡的发生；采用蛋白电泳结合蛋白质谱的方法鉴定与ASK1蛋白相互作用的蛋白；采用二维电泳法检测DJ-1蛋白的不同氧化状态；应用交联试剂DSS检测4-HPR作用后对细胞内DJ-1蛋白二聚化的影响；应用NAC、GSH等多种抗氧化,检测对4-HPR诱导细胞凋亡的影响以及对DJ-1蛋白的影响；采用SiRNA和ShRNA技术检测沉默DJ-1蛋白后对4-HPR诱导细胞凋亡的影响；应用Probe-1探针结合荧光显微镜检测细胞内氧化还原状态的变化；依据Ellman实验原理,检测细胞内GSH含量以及蛋白中自由巯基的含量；采用定点突变的方法建立突变型DJ-1质粒,随后考察过表达突变型DJ-1蛋白对4-HPR诱导细胞凋亡的影响。研究结果：第一部分：ROS调控AM蛋白分子内二硫键形成及其在抗肿瘤药物诱导白血病细胞凋亡中的作用研究.1)Akt蛋白的去磷酸化参与4-HPR诱导的白血病细胞凋亡4-HPR可呈时间及浓度依赖性地诱导白血病细胞凋亡,该过程伴随着线粒体膜电位变化以及线粒体通路相关蛋白的变化,提示线粒体通路介导的凋亡在4-HPR诱导NB4细胞死亡中发挥着重要的作用。进一步的研究发现,4-HPR诱导NB4细胞凋亡过程中可显着下调Akt蛋白丝氨酸473位点的磷酸化水平,但应用相应的信号通路抑制剂LY294002和激动剂Insulin后,发现这一过程并不依赖于PI3K。2)4-HPR诱导的ROS调控Akt蛋白磷酸化及其在细胞凋亡中的作用抗氧化剂NAC、GSH和DTT可完全抑制由4-HPR诱导产生的ROS也可降低其诱导NB4细胞凋亡的比例。进而发现抗氧化剂NAC、GSH以及DTT可显着甚至完全逆转4-HPR诱导NB4细胞内磷酸化Akt蛋白的下调。提示ROS在4-HPR诱导NB4细胞内磷酸化Akt蛋白下调中具有重要的作用。3)4-HPR诱导的ROS积蓄可调控Akt蛋白形成分子内二硫键采用改良的汞溴红染色法发现4-HPR可显着增加NB4细胞内蛋白质二硫键含量,这一现象可被抗氧化剂NAC所逆转。通过分析Akt蛋白的结构域以及晶体结构,发现位于激酶区的296和310位点半胱氨酸可能是ROS潜在的修饰位点。进一步应用自由巯基修饰剂NEM检测Akt蛋白的氧化还原状态,结果显示4-HPR作用后Akt蛋白被氧化,且在半胱氨酸296和半胱氨酸310位点之间形成了分子内二硫键。4)4-HPR调控Akt蛋白分子内二硫键的形成与Akt蛋白去磷酸化的关系4-HPR作用NB4细胞不同时间点后HSP90和PP2Ac蛋白表达无显着变化,但Akt蛋白与HSP90的相互作用明显减弱,与去磷酸酶蛋白PP2Ac的相互作用显着增强。免疫荧光也确证了Akt蛋白与HSP90蛋白、PP2Ac蛋白之间的相互作用。抗氧化剂NAC可显着逆转由4-HPR介导的Akt蛋白与HSP90、PP2Ac相互作用,提示这一过程与4-HPR诱导的ROS关系密切。双氧水作用于纯化的部分Akt1蛋白,随后检测与HSP90蛋白的相互作用,可发现氧化的Akt1蛋白与HSP90蛋白之间的相互作用明显减弱。上述结果充分说明Akt蛋白的氧化形式可以影响与HSP90蛋白的相互作用,进而影响其磷酸化水平。第二部分：ROS调控DJ-1蛋白氧化态在抗肿瘤诱导肿瘤细胞自噬／凋亡间转化中的作用研究1)ROS蓄积可介导肿瘤细胞自噬/凋亡转化研究发现随着4-HPR作用浓度的增加可诱导四株肿瘤细胞自噬向凋亡转化。采用了AO染色法、MDC染色法、过表达GFP-LC3和透射电镜等方法确证经5和10μM4-HPR作用的肿瘤细胞内可明显形成自噬囊泡,说明4-HPR诱导肿瘤细胞的自噬／凋亡转化是浓度“阈值”依赖性。通过裸小鼠荷人Hela移植瘤模型,进一步明确了4-HPR在体内同样可诱导肿瘤细胞自噬／凋亡间转化,且同样呈现剂量“阈值”的依赖性。进一步研究发现,不同浓度4-HPR均显着上调Hela细胞内ROS水平,但会引起细胞内不同程度的氧化还原状态。应用了NAC以及GSH两种自由巯基类抗氧化剂,结果显示2mMNAC或GSH在显着抑制10μM4-HPR诱导细胞凋亡的同时,不影响该浓度对自噬的诱导,但该浓度下的NAC却可以抑制4-HPR诱导的细胞自噬；而当细胞作用4mM NAC或GSH后可进一步抑制10μM4-HPR诱导的细胞自噬。这些结果均说明ROS上调是引起肿瘤细胞自噬／凋亡转化的原因。随后考察了不同浓度4-HPR作用下细胞内内源性GSH的含量以及细胞内蛋白质中自由巯基的含量。结果显示,5和10μM4-HPR作用后均可显着降低细胞内内源性GSH的含量和细胞内蛋白质中自由巯基的含量,且呈现时间依赖性关系,而10μM4-HPR较5μM4-HPR作用6小时后蛋白质中自由巯基含量显着降低。2)JNK1和p38信号通路分别介导ROS诱发的细胞自噬和凋亡研究发现5和10μM4-HPR作用可显着上调JNK1蛋白的磷酸化水平,提示JNK1在两个浓度下均可激活；但p38蛋白的磷酸化水平仅在10μM4-HPR作用后发生明显上调。提示JNK1和p38信号通路可能分别调控了4-HPR诱导的自噬和凋亡。应用SiRNA以及小分子抑制剂分别抑制JNK1和p38蛋白的表达和活性,结果显示,沉默或抑制细胞内JNK1蛋白后,可显着抑制自噬,而凋亡则被进一步加强,说明JNK1的沉默可显着抑制4-HPR诱导的细胞自噬,促进细胞凋亡；而沉默或抑制细胞内p38蛋白后,并不影响自噬,但可抑制凋亡的出现,提示p38参与了4-HPR诱导的细胞凋亡。沉默ASK-1不仅可抑制5和10μM4-HPR引起的JNK1蛋白激活,也可抑制10μM4-HPR引起的p38蛋白激活,提示4-HPR激活细胞内JNK和p38信号通路依赖于ASK1蛋白。3)ROS蓄积可影响DJ-1/ASK1蛋白复合物稳定性免疫沉淀结合SDS聚丙烯凝胶电泳分离实验发现,若干个蛋白在不同程度ROS的蓄积中呈现出与ASK1动态的相互作用。通过蛋白质谱的进一步鉴定,发现了5个蛋白中PARK7的得分最高。进一步采用免疫沉淀结合Western Blotting技术进行检测,结果显示DJ-1蛋白(即PARK7)与ASK1蛋白的相互作用呈现出了先聚合后解离的作用模式。为确证这一有趣的现象,我们应用DJ-1蛋白抗体进行反向免疫共沉淀,结果同样显示随着Fenretinde浓度的增加,DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用呈现出了先聚合后解离的方式。免疫荧光数据则更进一步地确证DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用存在先聚合后解离的变化。我们应用了不同浓度的抗氧化剂NAC,发现NAC可显着调控DJ-1蛋白与ASK1蛋白的相互作用,提示当ASK1与DJ-1蛋白形成蛋白复合物时可介导细胞自噬的发生,而当DJ-1/ASK1蛋白复合物进一步解离时会启动细胞的凋亡程序。4)ROS调控的DJ-1蛋白氧化态在肿瘤细胞自噬／凋亡转化中的作用随着ROS浓度的增加,DJ-1蛋白等电点逐渐降低,提示其氧化态水平进一步提高。此外Western Blotting结果显示,不同浓度4-HPR作用后对DJ-1蛋白的总蛋白并无显着变化,但10μM4-HPR作用下可显着抑制其二聚化形式的存在,提示此时DJ-1蛋白的活性受到抑制。我们应用DJ-1蛋白氧化态的稳定剂Compound23,发现其可以影响DJ-1蛋白与ASK1蛋白之间的相互作用,且此时ASK1下游的p38激活作用也被抑制,提示Compound23稳定DJ-1氧化态后,可通过维持与ASK1的相互作用抑制其下游p38的激活,但对JNK1的激活并不影响。我们的结果还进一步显示Compound23作用后可显着抑制10μM4-HPR诱导的细胞凋亡,但对细胞的自噬作用并不显着。通过构建两个突变型DJ-1蛋白,结合流式细胞术发现DJ-1蛋白106位点的氧化态受到4-HPR介导的ROS调控,从而影响其与ASK1蛋白的相互作用,最终决定是否启动p38信号通路激活凋亡。5)DJ-1蛋白的表达在肿瘤细胞对4-HPR敏感性中的作用由于我们发现肿瘤细胞对4-HPR的IC5o值与DJ-1蛋白的相对表达情况两者之间存在很好的线性相关性(R=0.815),因此我们应用SiRNA技术沉默细胞内DJ-1蛋白的表达,随后检测对4-HPR诱导自噬和凋亡的影响以及对JNKl和p38信号通路的影响。结果显示,沉默细胞内DJ-1蛋白后,可促进4-HPR诱导的细胞凋亡比例。进一步地,我们采用ShRNA技术构建了稳定低表达DJ-1蛋白的细胞,随后应用裸小鼠荷人肿瘤模型评价沉默DJ-1蛋白对4-HPR诱导自噬和凋亡的影响。结果同样发现沉默DJ-1蛋白可在体内外通过激活p38信号通路,增加细胞对4-HPR诱导凋亡的敏感性。6)内质网应激在4-HPR诱导的ROS诱发细胞自噬中的作用针对ROS导的细胞自噬,我们检测了不同浓度4-HPR作用细胞后对细胞内质网应激的影响,结果显示,ROS蓄积后可使XBP-1出现切割片段,提示此时IRE-1-XBP-1轴被激活；而仅在10μM4-HPR作用细胞后才使得eIF2α磷酸化水平及其下游ATF4、CHOP蛋白表达增加,提示仅高浓度ROS才激活eIF2α-ATF4轴。应用SiRNA技术敲低胞内IRE-1蛋白表达,随后给予不同浓度4-HPR,检测JNK1蛋白的激活情况,结果显示,沉默细胞内IRE-1蛋白表达后,可显着抑制ROS蓄积诱导的JNK1蛋白的激活,但对p38蛋白激活并无作用。此外,应用免疫沉淀结合Western Blotting技术检测不同浓度的4-HPR作用下细胞内ASK1、 TRAF2和IRE-1的相互作用情况。结果显示,在5和10μM4-HPR作用细胞后可使ASK1、TRAF2和IRE-1的相互作用得到显着加强,且两个剂量浓度变化相当。上述这些结果表明,ROS蓄积诱导的细胞自噬与内质网应激通路IRE-1-XBP-1密切相关。研究结论：本论文以可蓄积ROS的抗肿瘤药物4-HPR为小分子探针,将Akt蛋白和DJ-1蛋白作为突破口,较为系统的探讨了活性氧介导的蛋白翻译后修饰对肿瘤细胞活性的影响及其分子机制。(1)首次证实Akt蛋白的去磷酸化参与了抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡,而ROS的积聚也可以对Akt蛋白进行氧化修饰,且在分子内形成二硫键；该分子内二硫键的形成会减弱Akt蛋白与HSP90蛋白的相互作用,但可增加与PP2Ac蛋白的相互作用,并最终影响其磷酸化。(2)首次发现DJ-1蛋白可以作为ROS感受器,感受肿瘤细胞内不同程度氧化应激状态：当细胞处于温和的氧化状态时(低水平ROS), DJ-1蛋白被轻度氧化,此时可与ASK1蛋白相互作用抑制p38信号通路的激活,维持JNK信号通路的激活,导致细胞自噬的发生；当细胞处于过度的氧化应激时(高水平ROS), DJ-1蛋白被高度氧化,DJ-1蛋白与ASK1蛋白解离,启动p38和JNK信号通路,使得细胞自噬向凋亡转化。本课题的开展不仅阐明了ROS介导的蛋白质翻译后修饰如何调控肿瘤细胞死亡的分子机制,而且发现了可进行干预的关键节点蛋白,这些结果为寻找氧化应激型抗肿瘤药物的药效学生物标记物、临床合用方案以及研发新型抗肿瘤药物提供了理论和实验基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2013-10-01）
张莉林,曹慧娟,厉晓东,林福呈,冯晓晓[5]（2013）在《稻瘟病菌翻译调节肿瘤蛋白(MoTCTP)参与真菌生长和产孢的调控(英文)》一文中研究指出翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)是一种在多细胞生物中高度表达的多功能蛋白,在动植物的很多生理过程中具有重要的作用:如细胞生长、分化和基因表达等。该文报道了稻瘟病菌MoTCTP基因(人TCTP的同源蛋白基因)在菌丝、孢子和附着胞等不同发育阶段的表达,在细胞内的分布以及在稻瘟病菌发育过程中的作用。MoTCTP蛋白分布于细胞质、线粒体外膜表面以及液泡周围的细胞质中。敲除MoTCTP基因后,稻瘟病菌的生长减慢、产孢减少、孢子萌发延迟,但对氧化压力的抗性增加。定量PCR分析了12个细胞分裂周期蛋白和3个产孢相关蛋白在MoTCTP敲除突变体中的表达量变化,发现6个细胞分裂周期蛋白和3个产孢相关蛋白的表达量下降、3个细胞分裂周期蛋白的表达量上升。这些结果说明,MoTCTP基因在稻瘟病菌发育和抗胁迫过程中具有重要的功能,并且这些功能可能与细胞周期蛋白的表达调控有关。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2013年08期）
陈智嘉,谷励,王景龙,许小敏,陈思嘉[6]（2012）在《翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化》一文中研究指出目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2012年09期）
陈科,程汉华,周荣家[7]（2012）在《翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)与细胞生长调控》一文中研究指出翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一个在物种间高度保守、广谱表达和多功能的蛋白质,具有调节细胞骨架的动态变化和调节细胞的生长与增殖的作用;能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录;调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应和保护细胞免受多种应激的损伤等。本文综述了TCTP的结构、表达调控、生物学功能等研究进展。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2012年01期）
李嗣杰,贾泓瑶,吴迪,范志民[8]（2011）在《肿瘤翻译调控蛋白在人乳腺癌组织中的表达及临床意义》一文中研究指出目的探讨人肿瘤翻译控制蛋白(TCTP)在浸润性乳腺癌组织中的表达情况并分析TCTP表达与临床病理特征的关系。方法采用链霉素-生物素过氧化物酶免疫组织化学法检测94例浸润性乳腺癌及正常乳腺组织中TCTP蛋白的表达水平。结果浸润性乳腺癌组织中TCTP蛋白的阳性表达率显着高于癌旁正常乳腺组(P<0.001),TCTP的表达水平与乳腺癌肿瘤直径、临床分期、组织分级以及淋巴结转移情况密切相关(P<0.05),而与乳腺癌患者年龄、不同组织学类型之间的关系无统计学意义(P>0.05)。乳腺癌肿瘤直径愈大、临床分期愈高,乳腺癌组织中TCTP的表达阳性率也愈高;且有淋巴结转移者的TCTP阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P=0.003)。生存期分析显示,TCTP表达阳性的患者生存时间(52.0±3.7)月明显短于阴性表达的患者(88.6±3.6)月,(P<0.001)。结论 TCTP的异常表达参与了乳腺癌的演进过程,并且是乳腺癌患者预后不良的一个独立指标。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2011年09期）
马强[9]（2009）在《肿瘤翻译调控蛋白（TCTP）对结肠癌细胞LoVo的生物学特性影响及安全型慢病毒载体构建探索》一文中研究指出大肠癌是世界范围内四大最常见恶性肿瘤之一,结直肠癌在西方国家占肿瘤死亡的第二位,全世界结直肠癌发病率以每年2%的速度上升,近年来我国的大肠癌的发病率呈上升趋势,且以每年4%的幅度递增,递增速度为世界水平的2倍。并且绝大多数的大肠癌患者死亡原因是由于转移,其中肝转移是结直肠癌主要的死亡原因之一,当结直肠癌确诊时,已经有20%—40%病例发生了肝转移,而治愈性根治术后再发的肝转移率为50%结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%-71%,由于大肠癌的浸润转移是一个十分复杂、多步骤的过程,虽然有些大肠癌浸润转移的分子机制已有所阐明,但尚存在许多不确定的因素。尽管研究报道有百余种基因参与调控大肠癌的转移过程,这些基因为阐明转移的分子机制提供了重要的线索,但它们仍远远不能解释转移过程的复杂性和多样性。目前,大肠癌的治疗以手术为主,辅以局部或全身放、化疗,但未能明显提高大肠癌的5年生存率,随着分子生物学及基因工程的发展,基因治疗已成为研究重点。尽管有大量有关大肠癌基因治疗的深入研究,并已在临床取得一定疗效。但要真正达到大规模运用于临床治疗,还存在以下主要问题:①目前基因治疗的安全性没有很好解决,如对导入基因的控制、外缘基因及基因载体本身整合到宿主染色体带来的一系列问题等;②用于大肠癌理想载体的选择应具有安全性、高效性、靶向性、大容量性和可控性等特点,目前还难以找到可运用到理想的临床要求载体;③缺乏足够的基因治疗靶序列,大肠癌的发生是一种多基因水平调控的失控所致,单独基因治疗效果差。由此进一步深入研究大肠癌的发病机制,寻找确定更多更有效的治疗靶基因,制备安全高效的基因治疗载体是大肠癌基因治疗中迫切需要解决的问题。本文第一部分着重研究肿瘤翻译调控蛋白(TCTP)对高转移性结肠癌细胞株的细胞生物学影响以及相关信号传导通路的研究。第二部分着重研究新型基因治疗用慢病毒载体生产体系的改进和优化。第一部分通过构建靶向TCTP基因的shRNA质粒表达载体,下调TCTP在LoVo细胞中的表达。通过CCK-8实验检测LoVo细胞的增殖速度,粘附实验检测LoVo细胞对ECM的粘附能力,趋化实验和划痕实验检测LoVo细胞的运动能力,侵袭实验检测LoVo细胞对于ECM的分解穿透能力,EMSA以及荧光素酶实验检测TCTP下调后对于NF-κB活性的影响。通过成瘤实验检测TCTP下调对于LoVo细胞成瘤能力的影响,转移模型实验检测LoVo细胞体内肝转移能力的影响,通过2-D电泳和质谱分析鉴定与TCTP相关蛋白,并初步评价TCTP在正常人以及病人血清中的含量。构建shRNA质粒表达载体,质粒酶切以及测序鉴定表明质粒构建成功。下调TCTP在LoVo细胞中的表达,经荧光显微镜观察各组LoVo细胞均出现绿色报告荧光,RT-PCR,western blotting,qRT-PCR分析鉴定TCTP的表达下调分别达到82%、89%、73%。TCTP下调能够体外减慢LoVo细胞的增殖速度,shRNA-TCTP,shRNA-TCTP,LoVo parental组分别铺96孔板,每孔细胞数2000个。每株细胞5个复孔,铺7块板,连续测量7天。从第4天开始,shRNA-TCTP组生长速度明显慢于shncRNA-TCTP组和NC组,经过统计学分析后,shRNA—TCTP组在测量第1(F=1.773,P＞0.05)、2(F=0.048,P＞0.05)、3(F=7.865,P＞0.05)天时,shRNA-TCTP,shncRNA-TCTP,LoVo parental组叁组细胞增殖曲线无显着性差异。第4(F=14.711,P＜0.001),5(F=64.453,P＜0.001),6(F=19.198,P＜0.001),7(F=56.696,P＜0.001)天时shRNA-TCTP增殖状态均较shncRNA-TCTP组或者LoVo parental减弱,有显着性差异。shRNA-TCTP组细胞增殖抑制率分别达到22.0%,32.8%,18.2%,15.1%(第4天—第7天数据分别进行方差分析后并进行两两比较,P＜0.05,经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP组增殖状态均较shncRNA-TCTP或者LoVo parental减弱,并且有显着性差异,P＜0.001,shncRNA-TCTP LoVo与LoVo parental无显着性差异,P＞0.05)。TCTP下调减弱LoVo细胞对ECM的粘附性,分别以基底膜主要成份Collagen I、FN、LN、VN为粘附介质进行LoVo shRNA-TCTP,shncRNA-TCTP细胞和LoVo parental的基底膜粘附实验,下调TCTP表达可分别抑制LoVo细胞对四种不同介质的粘附能力(LN F=42.80,P＜0.001;VN F=65.165,P＜0.001;FNF=319.345,P＜0.001;Collagen I F=161.39,P＜0.001以上四组检验中,经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP组粘附能力均比shncRNA-TCTP或者LoVo parental组减弱,有显着性意义,P＜0.001,),但以LN为最明显,抑制率达59.6%,FN、VN、Collagen I分别为52.4%、51.2%、52.7%。TCTP缺失性功能实验从反方面证明TCTP对于大肠癌细胞的基底膜粘附性有重要影响。TCTP下调减弱LoVo细胞对ECM的趋化运动性,待测细胞各组,每组设4个孔。取细胞对数生长期,用无血清RPMI1640培养过夜。Matrigel溶液均10μg/mL(1×PBS配制),每下室300μL,置37℃铺板1h。结果显示,shRNA-TCTPLoVo穿膜细胞数少于shncRNA-TCTP组和parental组,结果有统计学差异(方差分析后并进行两两比较。F=562.042,P＜0.001经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP组穿膜细胞数均少于shncRNA-TCTP穿膜细胞数或者LoVoparental穿膜细胞数,差异有显着性意义,P＜0.001,shncRNA-TCTP LoVo穿膜细胞数与LoVo parental穿膜细胞数无显着性差异,P＞0.05)。划痕实验结果显示,TCTP表达下调明显延长LoVo细胞在matrigel胶上的愈合率。shRNA-TCTP在铺板12小时,24小时,36小时后的愈合率分别41.0±2.76%,65.3±2.2%,84.4±8.46%。明显低于同时间shncRNA-TCTP组的各个时间点愈合率62.7±2.2%,88.3±2.97%,98.4±2.17%以及LoVo parental组的各个时间点愈合率64.3±2.61%,88.5±4.19%,96.1±3.43%。经统计学分析在铺板12小时,24小时,36小时时测得的愈合率shRNA-TCTP均低于shncRNA-TCTP组和LoVo parental组,差异有显着性意义(12小时,F=79.573,P＜0.001;24小时,F=48.125,P＜0.001;36小时,F=5.737,P＜0.001,经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP组均与shncRNA-TCTP或者LoVo parental均有明显差异,P＜0.001,shncRNA-TCTP LoVo组与LoVo parental组差异无显着性意义,P＞0.05)。TCTP下调降低LoVo细胞对ECM的侵袭能力。粘附能力是肿瘤细胞发挥侵袭能力的基础,肿瘤细胞必须首先与细胞外基质发生粘附,然后才能通过肿瘤细胞本身或诱导宿主细胞分泌蛋白水解酶降解基质。为明确TCTP对大肠癌细胞侵袭能力的影响,在Transwell板的基础上,用Matrigel胶模仿基底膜构建侵袭性检测系统。实验结果从缺失性功能实验方面证明,抑制TCTP表达可以显着抑制LoVo细胞的侵袭能力(方差分析后并进行两两比较。F=71.512,P＜0.001经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP组侵袭能力均比shncRNA-TCTP或者LoVoparental组侵袭能力减弱,差异有显着性意义,P＜0.001,shncRNA-TCTP组侵袭能力与LoVo parental侵袭能力差异无显着性意义,P＞0.05)。TCTP表达下调明显抑制LoVo细胞成瘤能力,在裸鼠背部分别接种5×10~6的shRNA-TCTP LoVo,shncRNA-TCTP LoVo,LoVo parental细胞。叁周后使用水合氯醛溶液麻醉小鼠后,将其断颈处死,取下瘤体,称重并经计算后得到shRNA-TCTP LoVo,shncRNA-TCTP LoVo,LoVo parental形成瘤体的平均重量分别为0.72±0.12g,2.44±0.21g,2.53±0.15g,统计结果表明shRNA-TCTP LoVo细胞形成瘤体重量与均轻于shncRNA-TCTP LoVo形成瘤体重量和LoVo细胞形成瘤体重量,差异有显着性意义(方差分析后并进行两两比较。F=161.3,P＜0.001经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP LoVo细胞形成瘤体重量与均轻于shncRNA-TCTP LoVo形成瘤体重量和LoVo细胞形成瘤体重量,差异有显着性意义,P＜0.001,shncRNA-TCTPLoVo与LoVoparental无显着性差异,P＞0.05),然后迅速切成合适大小经4%多聚甲醛固定。并进行HE染色,HE染色,光镜下见癌细胞呈团块状分布,无腺腔样结构,胞浆丰富,核大不规则,核仁明显,可见多核瘤巨细胞,核分裂像易见,符合LoVo细胞形成的低分化腺癌的结构特征。TCTP表达下调明显抑制LoVo细胞转移能力,小鼠接种初期活跃如常,体形无改变。3周后小鼠明显消瘦,腹部渐膨隆,行动渐迟缓,精神差,摄食量减少。于第叁周末处死小鼠,解剖发现脾脏的接种部位均可见直径为0.3～0.5cm的灰白色结节,大小相对均一。腹腔内均有血性腹水,量不等。HE染色。虽然敲除TCTP表达未能阻止转移发生,但是LoVo shRNA-TCTP组肝脏表面结节数少于shncRNA-TCTP组肝脏表面结节数以及LoVo组肝脏表面结节数,差异有显着性意义(方差分析后并进行两两比较。F=277.736,P＜0.001经Bonferroni检验后,LoVo shRNA-TCTP组肝脏表面结节数少于shncRNA-TCTP组肝脏表面结节数以及LoVo组肝脏表面结节数,差异有显着性意义,P＜0.001,shncRNA-TCTP LoVo组与LoVo parental组肝脏表面结节数差异无显着性意义,P＞0.05)。.通过EMSA以及荧光素酶实验结果发现,TCTP表达下调抑制体内NF-κB的活性,核内p65含量降低。NF-κB是一类几乎存在于所有细胞内,能与多种基因的启动子或增强子NF-κB结合位点发生特异性结合并启动基因转录的一组转录调节因子。NF-κB是由亚单位P50和P65组成的异源二聚体,P50与DNA直接结合,P65具有转录活性。静息状态下,NF-κB和抑制性蛋白IκB-A结合滞留于细胞质中,在一定刺激作用下IKBα解离,NF-κB释放进入细胞核激活靶基因。质粒pNFκB-luc与海肾荧光素酶质粒载体分别共转然shRNA-TCTPLoVo,shncRNA-TCTP LoVo和LoVo parental细胞中,24h后,使用promega专用仪器检测萤火虫荧光素酶活性。其中海肾荧光素酶作为内参校正。由图可以观察到在shRNA-TCTP LoVo细胞中的NF-κB结合活性较shncRNA-TCTP和LoVo parental细胞中低,差异有显着性意义(方差分析后并进行两两比较。F=277.736,P＜0.001经Bonferroni检验后,shRNA-TCTP LoVo细胞中的NF-κB结合活性较shncRNA-TCTP和LoVo parental细胞中低,差异有显着性意义,P＜0.001,shncRNA-TCTP LoVo与LoVo parental中NF-κB活性差异无显着性意义),正常LoVo或者shncRNA-TCTP中的NF-κB活性约为shRNA-TCTP中的6倍。由EMSA图分析,shRNA-TCTP组中NF-κB结合活性明显降低。经比较蛋白组学研究发现,TCTP表达下调引起细胞内27种蛋白质表达变化。其中24种蛋白表达水平上调,3种蛋白表达水平下调。并初步评价TCTP在正常人以及病人血清中的含量。这些蛋白大致分为泛素化系统组分(PSMA1,PSMA3,PSMA6,PSMC5,PSMD8,PSMD9,PSME3),肿瘤转移直接相关基因(HMGB1),细胞骨架相关蛋白(STMN1),离子通道相关蛋白(LASP1)等。随机选取40个正常人和40个大肠癌病人,符合条件按方法中陈述。采用ELISA方法分别测定病人血清和正常人血清中抗TCTP抗体的含量。分别采用TRIFA竞争方法测定血清中TCTP的表达水平。由表1-4可以看到大肠癌病人血清中TCTP(t=40.894,P＜0.001)以及antiTCTP(t=-15.933,P＜0.001)抗体含量均与正常人值有显着性差异较高。其中有19例病人可以进行随访观察,并可以取得治疗半年左右的血清。对大肠癌病人治疗前后血清中TCTP以及antiTCTP的含量作配对t检验。发现大肠癌病人经手术,放疗,化疗治愈后,其中16对配对血清中的TCTP抗体以及抗原均有所下调(TCTP,t=26.964,P＜0.001;antiT℃TP,t=-63.327,P＜0.001)。3对配对血清中TCTP抗体以及抗原含量未有显着性变化,其中1例诊断为复发。第二部分构建主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG。通过脂质体将这叁个质粒共转染至BHK_(21)细胞,再用含有T_7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,在生产细胞中,痘苗病毒转录翻译系统指导T_7RNA聚合酶的转录和翻译,然后T_7RNA聚合酶指导慢病毒载体cDNA的转录,痘苗病毒RNA聚合酶指导包装蛋白p24等以及包膜蛋白水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)的转录翻译,最后由VSV-G包装慢病毒载体RNA以及功能蛋白形成慢病毒颗粒,经细胞分泌释放到培养上清中,收集培养上清经0.22μm滤膜过滤得到慢病毒载体。RT-PCR及测序比对结果提示培养上清中含有慢病毒载体的基因组RNA。当叁质粒与辅助痘苗病毒共转染生产细胞BHK_(21),48h后,共聚焦显微镜下观察到生产细胞表达p24蛋白,并且其主要分布于胞质中,而在细胞核中基本不表达,这提示质粒pGAGPOL构建成功;普通倒置荧光显微镜下观察到生产细胞表达GFP,提示质粒pVECRNA构建成功,以上结果也提示生产系统正常工作。将培养上清感染BHK_(21)细胞和293T细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察到BHK_(21)细胞和293T细胞均表达GFP,这提示利用本系统制备慢病毒载体颗粒的可行性。为了提高系统产量,本研究对培养慢病毒载体所用的细胞系、质粒用量、重组痘苗病毒和细胞数比例(MOI)叁个对慢病毒载体生产起关键作用的条件进行优化。每个因素取叁个作用水平。所有结果在SPSS13.0软件中整理,按照3*3*3析因方差分析方法分析实验数据(计量资料用(?)±s表示,P＜0.05表示差异有显着性意义)。实验结果表明细胞系、质粒用量以及MOI对载体产量有交互作用(F=7.728,P＜0.001)。不同种生产细胞株之间慢病毒载体的产量有显着的统计学差异(F=1789.772、P＜0.001)。以BHK_(21)细胞的产量最高,载体拷贝数为(7036.78±3504.974)×10~8c/ml,大于Vero细胞产量(1670.89±968.55)×10~8c/ml及HepG_2产量(416.41±186.99)×10~8c/ml。不同的MOI对病毒载体产量有显着统计学差异(F=311.543、P＜0.001)。其中病毒载体拷贝数在MOI为1时病毒载体拷贝数最高。不同的质粒用量对病毒载体产量有显着性统计学差异(F=137.268、P＜0.001),病毒载体拷贝数在质粒用量为10μg条件下最高。通过不同细胞株产量之间的比较,发现以BH_(21)为生产细胞时的系统产量远大于以HepG_2和Vero细胞为生产细胞时的系统产量。因此以BHK_(21)为生产细胞,对质粒用量和MOI进行3*3析因分析(计量资料用(?)±s表示,P＜0.05表示差异有显着性意义)。通过结果可以得知:不同的质粒用量和MOI存在交互作用(F=9.980、p＜0.001)。不同的质粒用量对病毒载体产量有显着性差异(F=92.997、P＜0.001)。其中病毒载体拷贝数在质粒用量为10μg时病毒载体拷贝数最高。采用Tamhane法(方差不齐)进行两两比较,发现质粒用量为5μg时的系统产量与质粒用量为10μg(P=0.031)和15μg(P=0.021)时系统产量均有显着性差异;质粒用量为10μg时的系统产量与质粒用量为15μg(P=0.987)时系统产量无显着性差异。不同的MOI对病毒载体产量有显着性差异(F=174.778、P＜0.001),病毒拷贝数MOI为1条件下产量最高。采用Tamhane法(方差不齐)进行两两比较,得到MOI为0.1和1时,系统产量没有显着性差异(P=0.801),MOI为5时,系统产量与MOI为0.1(P=0.01)和1(P=0.01)时的系统产量均有显着性差异。最后得出BHK_(21)为生产细胞,37℃,5%CO_2培养条件下,质粒用量为pVECRNA 10μg、pGAGPOL 10μg、pVSVG 2μg时,病毒载体拷贝数最高,达到(11707.67±802.263)×10~8c/ml。在病毒载体拷贝数最优条件下GFP方法测得载体滴度达到(1.3±0.18)×10~8tu/ml。总之,我们初步验证了TCTP下调对LoVo细胞生物学特性的影响,初步证实TCTP的下调能够抑制LoVo细胞体内体外增殖能力以及转移能力,提示TCTP有可能作为结肠癌基因治疗靶标,并且我们利用新的生产体系成功制备出慢病毒载体,为之后慢病毒载体生产体系的进一步完善以及临床基因治疗提供客观依据。(本文来源于《南方医科大学》期刊2009-05-15）
肿瘤翻译调控蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在我国的发病率占原发脑肿瘤的31.1%,其中,胶质母细胞瘤(GBM,Glioblastoma Mutiforme)恶性程度最高,大约占胶质瘤的30%。GBM常呈侵袭性生长,与正常脑组织界限不明确,手术效果不佳并具有放疗抗性,尽管目前临床GBM的标准治疗方案是“手术+放疗+替莫唑胺(TMZ,Temozolomide)辅助化疗”,但整体预后不良,据统计,我国GBM患者的中位生存期仅为14.4个月。近年来,放疗技术发展迅速,但GBM放疗抵抗依然是临床治疗中面临的难题。研究表明,受照胶质瘤细胞的死亡主要通过自噬途径发生而不是凋亡,因此,围绕自噬开展针对GBM细胞的有效靶点及放疗敏感性研究是当今放射医学领域的热点问题。肿瘤翻译控制蛋白(TCTP,Translationally controlled tumor protein)是一种高度保守的亲水性小分子蛋白,广泛存在于真核组织细胞中,具有参与转录和翻译、调节细胞周期、抗凋亡、促进肿瘤形成和DNA损伤修复等多种重要功能,此外,TCTP的异常高表达与胶质瘤的临床病理分级及预后密切相关。尽管尚无直接证据表明TCTP参与调控肿瘤细胞的自噬,但已有研究证实,与TCTP直接相关的多个DNA损伤修复关键蛋白、应激反应和抗凋亡分子通路均在自噬调控中发挥重要作用,例如,缺氧和糖尿病状态下,TCTP可以通过AMPK通路或作为鸟苷酸转化因子调控mTORC1活性,而mTORC1复合物是自噬起始阶段最关键的复合物;从分子结构上分析,TCTP的N末端具有与Bcl-2家族蛋白BH3结构域结合的能力,而自噬起始阶段关键蛋白Beclin 1已被证实为一种新的BH3-only蛋白,因此,TCTP在结构上既具有同Beclin 1直接结合的可能,也具有影响Bcl-x L和Beclin 1结合的可能。本研究旨在阐明TCTP在受照GBM细胞自噬发生中的作用及其对细胞放疗敏感性的影响,通过围绕TCTP-mTORC1和TCTP-Beclin 1开展相关分子机制研究,为寻找针对GBM细胞辐射抵抗的关键靶分子提供理论和实验依据。研究采用AVO染色、自噬特异性染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染、透射电镜和蛋白质印记(WB,Western blot)等方法对受照胶质瘤细胞自噬流的变化进行动态监测;采用药物抑制或基因干扰的方法研究TCTP在受照GBM细胞自噬发生中的作用及相关分子机制;采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力;采用MTT、克隆形成和裸鼠成瘤实验等综合评估TCTP调控自噬对GBM细胞辐射敏感性的影响。研究主要发现:1.受照GBM细胞的自噬发生规律:与正常对照组相比,2Gy分割照射(≥5次)可引起胶质瘤细胞内p-mTORC1水平升高和自噬抑制;单次6Gy X射线辐照后1-3天,细胞内TCTP蛋白表达显着增多,照后4-7天,TCTP表达量逐渐降低,辐照后5到7天,Autophagy Assay Kit染色、mRFP-GFP-LC3腺病毒感染实验和透射电镜结果显示,细胞内的自噬体和自噬溶酶体结构显着增多,Western Blot结果表明,自噬标记蛋白Beclin 1和LC3B的表达增加,提示受照胶质瘤细胞的自噬性死亡主要发生在辐照后5-7天。2.TCTP在受照GBM细胞自噬激活中的作用:筛选出针对GBM细胞有效抑制TCTP表达的药物:甲硫哒嗪和双氢青蒿素。实验显示,利用药物抑制受照GBM细胞的TCTP表达,辐照后48h,自噬标记物LC3B-II/I比例显着升高、p62表达降低,荧光染色和透射电镜结果进一步证实细胞内自噬发生;采用基因干扰技术(小干扰RNA或构建稳转低表达胶质瘤细胞系)抑制TCTP表达,结果与之一致,提示TCTP在受照胶质瘤细胞自噬的发生中发挥抑制作用。3.TCTP参与调控Beclin 1复合物功能和ATM-AMPK-mTOR信号通路:蛋白质共沉淀(Co IP,Co-Immunoprecipitation)和荧光共定位实验均证实,GBM细胞受到辐照后,TCTP与Beclin 1的共定位表达显着增强,同时,过表达TCTP可抑制Beclin 1与Vps34结合,相反,低表达TCTP可以促进二者的结合;WB结果显示,抑制TCTP表达,受照GBM细胞在辐照后48h即出现ATM-AMPK通路激活、mTOR抑制,从而激活自噬,提示TCTP可以通过ATM-AMPK通路调控自噬的发生。4.激活自噬或抑制TCTP均可有效提高GBM细胞的辐射敏感性:使用雷帕霉素激活受照GBM细胞自噬发生,细胞的划痕愈合能力明显降低,MTT增殖曲线下移;稳转低表达TCTP的GBM细胞受到辐照后,MTT实验表明细胞生存能力显着降低,Transwell实验显示细胞的迁移能力降低,双氢青蒿素在抑制TCTP激活自噬的同时可抑制受照胶质瘤细胞增殖和迁移。5.在体实验证实抑制TCTP可提高GBM的放疗敏感性:裸鼠移植瘤实验表明,腹腔注射双氢青蒿素可有效抑制脑肿瘤组织中的TCTP表达、降低受照荷瘤小鼠的移植瘤质量,同时伴随自噬标记物LC3B-II/I的比例显着增加。6.TCTP影响胶质瘤患者的预后:通过检索TCGA数据库,分析GBM患者临床和基因组数据发现,TCTP基因TPT1突变(缺失性为主)可显着延长GBM患者的中位生存期和无病生存期,同时,TPT1突变脑组织中的TP53/PTEN蛋白平均表达水平增加,伴随EGFR蛋白表达降低;接受标准放疗患者中,TCTP mRNA高表达者中位生存期明显缩短。研究结论:1.TCTP参与抑制受照GBM细胞的自噬发生。一方面,TCTP通过与Beclin 1相互作用而影响Beclin 1-Vps34复合物功能,另一方面,辐照后48h,TCTP可抑制ATM-AMPK信号通路,进而激活mTOR并抑制自噬发生。2.离体条件下,激活自噬或通过抑制TCTP激活自噬,均可提高GBM细胞的辐射敏感性;3.甲硫哒嗪和双氢青蒿素可有效抑制GBM细胞TCTP的表达,其中,双氢青蒿素可提高移植瘤裸鼠的放疗敏感性并激活GBM细胞自噬,提示TCTP参与调控受照GBM细胞的自噬并影响其辐射敏感性。4.TCTP影响胶质瘤患者放疗效果和预后;
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肿瘤翻译调控蛋白论文参考文献
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