导读:本文包含了插入体库论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:黄瓜,T-DNA,突变体,TAIL-PCR
插入体库论文文献综述
冯路路,段莉莉,张璐,李季,陈劲枫[1]（2018）在《黄瓜T-DNA插入突变体库构建及初步分析》一文中研究指出T-DNA插入突变是快速构建植物突变体库的重要手段,在拟南芥和水稻突变体库的构建中已成功应用。因此可利用T-DNA插入突变构建黄瓜突变体库,获得性状稳定并可遗传的突变体,为黄瓜的基因功能研究提供突变材料。通过TAIL-PCR或反向PCR可获得T-DNA插入位点的侧翼序列,之后利用序列比对软件在黄瓜基因组全序列中预测T-DNA插入的位置,进一步通过生物信息学分析获得候选基因。本研究以本实验室已经建立的农杆菌介导的遗传转化的基础上创制T-DNA插入突变体,获得T0代植株并通过单株自交和抗性筛选得到T1植株。对T0和T1代植株的整个生长发育时期进行突变性状观察和鉴定。通过农杆菌介导的遗传转化体系共得到106株T0代植株,并通过单株自交收获82个编号的T0代植株种子,之后对部分T0代种子进行抗性筛选得到T1代植株。通过对T0代植株进行的突变性状统计观察,初步发现了复雌花、茎融合、多种叶型变异以及花粉败育等突变表型。通过提取植株DNA并设计引物进行PCR验证,初步鉴定了部分具有突变表型的T0代植株。下一步计划进行T1代植株的突变表型观察统计以及探究T0代突变表型的遗传稳定性,并对具有重要意义的突变表型植株进行southern blot验证其拷贝数以及TAIL-PCR获得相关突变表型的侧翼序列信息,为之后基因功能的研究奠定基础。(本文来源于《中国园艺学会第八届黄瓜学术研讨会暨新品种展示观摩活动会议手册》期刊2018-10-12）
张晴[2]（2018）在《苜蓿中华根瘤菌Sm2011 Tn5-sacB插入突变体库的构建及共生相关突变体的筛选》一文中研究指出豆科植物与根瘤菌共生形成一个特殊的器官-根瘤,根瘤是根瘤菌共生固氮的场所,其形成和发育都是根瘤菌与宿主植物相互作用的结果。在豆科植物中,存在两种不同形态的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生组织活性周期短,且根瘤各个组织的发育阶段一致;不定型根瘤的分生组织活性延续时间长,根瘤菌则持续感染其分生组织,导致根瘤有明确的分生区、侵染区、固氮区和衰老区,各个区域处于不同的发育阶段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤属于不定型根瘤,其共生伙伴-苜蓿中华根瘤菌在侵染区与固氮区间开始分化成类菌体并行使固氮功能。为了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的机制,本研究以中华苜蓿根瘤菌Sm2011菌株为材料,开展了共生固氮相关基因突变体分离和鉴定的工作,主要研究结果如下:1.构建了苜蓿中华根瘤菌Sm2011菌株的突变体库:利用叁亲本杂交技术,以Sm2011为受体,以E.coli S17-1/pMH1701为供体、E.coli/pRK2073作为辅助菌进行叁亲本杂交。其结果表明,Tn5-sacB转座频率为1.84×10~(-6),经Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性筛选,分离得到约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体。随机挑选23个单菌落,通过PCR证实Tn5-sacB插入在根瘤菌基因组。2.筛选根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相关基因的突变体:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突变体(nad1),在接种野生型根瘤菌时,形成不能固氮根瘤(白色)。利用该突变体的根瘤表型,接种Tn5-sacB插入突变的根瘤菌,尝试筛选出能形成粉红色的根瘤。结瘤实验结果表明,在约1600棵nad1缺陷型植株中,未发现有结粉红色根瘤的植株。说明利用该方法难以筛选到根瘤菌恢复nad1突变体结固氮根瘤的表型。3.苜蓿根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定:利用巢式PCR检测技术,从约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体库中鉴定和筛选出4个特定目标基因的插入位点及其突变体,即固氮酶基因nifH-75-9,结瘤基因nodC-32-33,肽聚糖相关基因smc04024-76-79和smc01188-11-80,其中只有smc04024的插入位点位于基因F端上游,其他叁个突变体中Tn5均插入在基因序列中。通过结瘤实验,考察突变体共生及固氮表型,得到野生型苜蓿种子接种nifH基因突变体28 d后,形成不能固氮根瘤(白色);接种nodC基因突变体10 d后,不能形成根瘤。该结果与已经报道的结果完全一致,证实了突变体库的完整性。而在接种smc01188基因突变体28 d后,所得到的根瘤虽然呈粉红色,但红色区域较野生型根瘤大大减少,且植株叶片背面呈红褐色,植株呈现一定程度的缺氮表型;接种smc04024基因突变体28 d后,植株根瘤及叶片与接种野生型根瘤菌相比基本相同,这说明该基因的插入位点未破坏该基因的正常表达。此举为鉴定苜蓿根瘤菌突变体提供资源及筛选程序,为后续深入研究根瘤菌共生固氮调节的分子机制提供科学资料。(本文来源于《华中农业大学》期刊2018-06-01）
周向珍,朱辉[3]（2018）在《百脉根根瘤菌MAFF303099 Tn5转座子插入突变体库的构建及筛选》一文中研究指出以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有Tn5-sacB插入,叁亲本转化效率为3.75×10~(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。(本文来源于《华中农业大学学报》期刊2018年02期）
张贝,安邦,罗红丽[4]（2018）在《橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及插入位点分析》一文中研究指出橡胶树炭疽病主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起,是影响橡胶产量的重要病害之一。病原菌功能缺失突变体的构建是研究病菌致病分子机理的有效手段。为了获得充足的胶孢炭疽菌突变体用于解析其致病机理,本研究对根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系进行优化。结果表明,当AGL-1农杆菌OD_(600)=0.8、胶孢炭疽菌孢子浓度为10~6个/mL、乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol/L时,共转化48 h,可使转化效率达到480个转化子/106个孢子。基于这个体系,构建了一个库容量为861的T-DNA突变体库。随机挑选8个转化子进行PCR验证,结果均为阳性。从突变体库中筛选出1株致病力下降的突变体,对其进行TAIL-PCR扩增插入位点侧翼序列,得到一个750 bp序列进行序列测定。通过与野生型菌株基因组进行序列比对,确定了T-DNA的插入位置。为进一步研究橡胶树胶孢炭疽菌致病分子机理提供理论参考。(本文来源于《分子植物育种》期刊2018年13期）
李俊香,古勤生[5]（2017）在《甜瓜棒孢叶斑病病原菌鉴定、生物学特性研究及T-DNA插入体库的构建》一文中研究指出棒孢属(Corynespora cassiicola)真菌是无性型真菌丝孢菌纲暗色丝孢科中的重要类群,主要引起叶斑病,该类真菌种类繁多,寄主范围及地理分布广泛。农杆菌介导的遗传转化成为真菌实现菌种改良、新基因标记及目的基因的筛选、分离和克隆的重要方法之一。该方法操作简单、受体范围广、转化率高、单拷贝率高及突变体遗传稳定,解决了传统转化方法的瓶颈。截止目前,在国内外,有关甜瓜棒孢菌的相关报道相对较少,鉴于此,本研究以从广西武鸣采集的病样中分离得到的甜瓜棒孢叶斑病菌为受体材料,利用农杆菌介导的方法构建T-DAN插入突变体库,完成对转化子的分子鉴定。主要研究结果如下:2015年10月在我国广西武鸣的厚皮甜瓜叶片上发现一种新的叶斑病。该甜瓜叶斑病典型症状表现为仅危害叶片,病斑圆形或不规则形,棕色,有的有黄色晕圈,呈轮纹状。该病原菌疑似通常危害植物叶片引起叶斑病的多主棒孢菌。将病样带回,采用病原分离,致病性试验,形态学观察及多基因测序的方法对引起该病的病原菌进行了鉴定,同时对该病原菌的生物学特性和常见杀菌剂的敏感性进行了测定。在PDA平板上,病原菌菌落圆形,中间墨绿色,边缘浅褐色。分生孢子呈圆柱形或倒棍棒形,单生或串生,直立或稍微弯曲,具0-13个隔,大小为3.1–6.4×14–138.9μm。克隆测定该病原菌的4个基因序列ITS1,2、ITS4,5、ACT、TUB2。甜瓜叶片上分离纯化的病原菌回接到甜瓜幼苗及离体叶片上,甜瓜幼苗及叶片均表现出与田间相似的症状,并能从病叶上不断分离该病原菌,符合柯赫氏法则。接种该病原菌的西瓜和黄瓜幼苗及离体叶片均发病。病原菌菌丝生长的最适碳源是葡萄糖,最适氮源是KNO3,最适温度是27°C,最适p H是6–9。分生孢子萌发的最适碳源是蔗糖和葡萄糖,最适pH是5–8。在室内采用菌丝生长速率法测定了23种杀菌剂对多主棒孢的抑菌能力。对该病原菌抑制效果较好的杀菌剂是50%咪鲜胺锰盐WP、30%苯醚甲环唑SC,40%氟硅唑EC,80%福美双WG。建立农杆菌介导的甜瓜棒孢菌的高效遗传转化体系。本研究发现,抑制甜瓜棒孢菌生长的最佳潮霉素浓度为100μg·mL-1,抑制农杆菌生长的最佳特美汀浓度为200μg·mL~(-1)。本研究中以甜瓜棒孢菌的分生孢子作为转化受体,摸索建立了转化体系,转化效率较高,可以达到20~30个转化子每1×105个/mL的分生孢子。在此转化体系条件下,转化效率对转化子进行分子鉴定。对转化菌株运用特异性引物进行PCR扩增、测序,结果证明转化菌株含有T-DNA插入基因片段。目前获得转化子209个,用于致病性分析。(本文来源于《河南省植物保护学会第十一次、河南省昆虫学会第十次、河南省植物病理学会第五次会员代表大会暨学术讨论会论文集》期刊2017-12-09）
高嵩[6]（2017）在《利用烟曲霉T-DNA插入突变体库筛选及验证生长繁殖相关基因功能》一文中研究指出烟曲霉是一种重要的条件致病真菌,发病率仅次于白假丝酵母,位于深部真菌感染第二位。一般来说,烟曲霉感染人体时主要是以孢子的形式沿呼吸道进入肺泡,在肺泡表面存活、定植、萌发,最终向下侵袭生长入血,引起系统性真菌感染。利用T-DNA及转座子等技术插入染色体DNA,获得插入突变体的反向遗传学方法,是研究植物、真菌等生物基因功能的一种重要方法。本实验室前期工作中已建立了烟曲霉T-DNA插入突变体库,用于烟曲霉基因功能的研究。本研究的主要目的是寻找与烟曲霉生长繁殖相关的基因,并研究其与烟曲霉致病力的关系。经筛选获得形态改变突变体54株,其中3株表型变化明显。在研究过程中,确定突变体插入位点,明确破坏基因是其关键技术之一。然而,现有的方法存在操作复杂,需要限制性内切酶酶切及T-A克隆连接等技术的辅助,阳性率低,有非特异性扩增,耗时长,成本高等缺点。本研究结合降落PCR、热不对称PCR及抑制PCR技术,建立了一种新型高通量的插入位点分析方法。该方法阳性率高,操作简便快捷,节省时间、人力及物力。获得的侧翼序列长度在300-2500bp之间,可满足插入位点的生物信息学分析,为高通量分析插入位点提供技术支撑。在此基础上,应用该技术对烟曲霉T-DNA插入突变体库T-DNA插入位点进行分析。对其中一株白化突变株AFM1006进行深入的基因功能研究,确定其打断基因为烟曲霉几丁质合酶csmB基因,其影响的表型变化为烟曲霉分生孢子梗顶囊产生小梗的分化过程出现障碍。该成果可为寻找影响烟曲霉菌株形态分化相关通路,揭示其生长繁殖的分子机制等提供科学依据。1.烟曲霉形态改变突变体的筛选通过筛选烟曲霉菌株IFM40808的T-DNA插入突变体,获得54株具有表型变化的突变体。其表型变化涵盖菌落生长速度变缓、白化、气生菌丝增多、出现褶皱等。其中叁株表型变化明显。菌株AFM2690白化,菌落出现褶皱,菌丝弯曲,粗细不均一;菌株AFM3270,菌落生长极为缓慢;菌株AFM1006白化,菌落大小无明显差异。这些生长繁殖发生改变的突变体为进一步分析烟曲霉生长发育、分化等过程的分子机制提供物质基础。2.高通量插入突变体库插入位点分析方法的建立本研究首次结合降落pcr、热不对称pcr和抑制pcr原理,建立了一种可用于高通量分析插入突变插入位点的方法。其具体方法为:在插入突变区边缘向外连续设计两个半巢式固定端引物,距离边缘较远的引物需要有较高的退火温度,用于预扩增;距离边缘较近的引物用于第二轮扩增。另一端使用在5`端有特定保守dna片段的简并引物随机与模板结合。非特异性片段会因其单链两端反向互补倒读而导致单链成环,无法进一步扩增。在预扩增阶段,通过预扩增-瞬时降温-缓慢升温-再次扩增的方式,尽量提高其扩增阳性率;在第二轮扩增时,随机端引物更换为人为在简并引物5`端加入的特异性片段,使其变为简单的pcr反应,通过降落pcr方法,同时兼顾了特异性和扩增效率。经过两轮pcr扩增后即可扩增特异性目标条带,仅切胶回收无需t-a克隆即可测序。经实验摸索,模板dna的完整性是反应能否正确完成的关键。该方法仅需在插入位点边缘连续设计两轮半巢式引物,且仅第一轮引物需要较高的退火温度,相较原有连续叁轮半巢式引物,均需要较高的退火温度来说,引物设计的难度大大降低。扩增产物不需要t-a克隆,简单易行,单一pcr仪一批次可完成96个样品,从基因组提取到完成测序反应从原有的至少四天,减少至叁天内完成,单个样品分析成本由原有的60元降低至25元以内,适合于插入突变位点的高通量分析。该方法已成功应用于本实验室烟曲霉、土曲霉、申克氏孢子丝菌、尖孢镰刀菌atmtt-dna插入突变体库插入位点的分析。已成功确定100余株烟曲霉插入位点,为揭示烟曲霉分子机理、探讨致病机制等奠定了坚实的基础。3.烟曲霉白化突变株afm1006基因功能研究通过分子分析确定筛选获得的烟曲霉白化突变株afm1006打断区域为假定的几丁质合酶基因,对其结构域分析最终确定其为烟曲霉v类几丁质合酶csmb。通过肉眼观察、乳酸酚棉蓝染色光学显微镜观察、荧光白染色荧光相差显微镜观察、扫描电子显微镜观察及荧光相差显微镜观察等方法确定,该基因的缺失对烟曲霉菌丝延伸速度、菌丝直径、细胞壁厚度、菌丝平均分枝距离和平均分隔距离、足细胞的分化、菌丝细胞壁几丁质含量等均无明显变化;仅影响了分生孢子梗上顶囊分化产生小梗的过程,进而影响孢子的产生。通过分光光度法和Real-time PCR法对突变体进行生理生化分析,确定突变体菌株几丁质总含量无明显变化,csmB基因不表达而其他的几丁质合酶具有不同程度的代偿性表达上调。对该基因氨基酸序列进行分析,发现其包含叁个结构域,分别为肌球蛋白头部结构域、细胞色素b5样结构域和几丁质合酶结构域C。据此提出假说,烟曲霉几丁质合酶csmB基因仅影响烟曲霉分生孢子梗上顶囊分化生成小梗,其分子机制为该基因表达后受肌动蛋白影响最终成熟于顶囊顶端细胞膜上发挥合成细胞壁几丁质的功能。同时也成功建立了AFM1006菌株回复突变株。本研究成果可为进一步明确烟曲霉生长发育的分子机理,确定烟曲霉的致病机制等提供重要的技术资料。综上,本研究通过筛选烟曲霉形态改变突变体共获得有形态差异的突变体54株,其中3株表型变化明显。首次成功建立了基于降落PCR、热不对称PCR和抑制PCR的插入位点分析技术。该方法操作简单易行、高通量,仅需PCR扩增而不需要限制性内切酶及T-A克隆等技术,从基因组提取到完成测序仅需3天,单个样品成本降至25元以内。本实验室已成功将其应用于多种T-DNA插入突变体库插入位点的分析工作。本研究中已成功确定一百余株烟曲霉T-DNA插入突变体插入位点。对白化菌株AFM1006进行进一步的基因功能分析,最终确定其插入突变位点为csmB基因,仅影响烟曲霉顶囊分化产生小梗。这些研究成果为通过反向遗传学方法探讨病原真菌致病机制、耐药机制等奠定基础,同时,本研究亦可为其他病原真菌、其他插入突变技术研究提供参考和借鉴。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-06-01）
周向珍[7]（2017）在《中慢生根瘤菌MAFF303099Tn5-sacB插入突变体库的构建及共生相关突变体的筛选》一文中研究指出根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用避免了人工施用氮肥的种种弊端,在农业生产中有重要研究和利用价值。目前对共生固氮的研究仍聚焦在其具体分子机制。根瘤菌合成的结瘤因子(NF)是共生起始的关键信号分子,除此之外,根瘤菌中很多基因均参与共生过程,保证根瘤菌可以正常分化并行使固氮功能,包括nod基因,nif基因,fix基因及一些lps基因等。Mesorhizobium loti MAFF303099与模式豆科植物百脉根(Lotus japonicus)的共生在共生固氮体系中极具代表性,对揭示共生固氮机理有重要的研究价值。MAFF303099是中慢生根瘤菌属内最早完成全基因组测序的菌株。本课题以MAFF303099为研究对象,利用转座子Tn5-sacB转座技术得到了约10,000个MAFF303099的转座接合子,构建突变体库,旨在构建并筛选百脉根根瘤菌MAFF303099中共生相关基因的突变体,更好地阐明共生机制。主要研究结果如下:1.测定百脉根根瘤菌MAFF303099的生长曲线,确定了其在TY培养基中培养时,对数生长期在OD600为1.0左右;测定MAFF303099对Km的敏感性,确定Km筛选浓度为50μg/mL。2.利用叁亲本杂交方法将含Tn5-sacB转座子的质粒pMH1701转入目的菌株MAFF303099,转化效率为3.75×10~(-5),并挑取复筛后的约10,000转座接合子用96孔板培养并保藏,构建MAFF303099的转座子随机插入突变体库。3.利用PCR、抗性筛选、蔗糖筛选验证了复筛后的转座接合子中均有转座子Tn5-sacB插入在其基因组中,进一步通过TAIL-PCR的方法在16个突变体中鉴定出了10个转座子插入基因编码框的突变体,并确定了其具体插入位点,证实了突变体库构建的可行性。4.探索并构建了一套能从MAFF303099突变体库中快速筛选目的突变体的方法,成功筛选到了结瘤因子相关合成基因nodB的突变体,命名为MAFF303099/nodB-1,且确定了Tn5-sacB在nodB基因中的具体插入位点。5.对MAFF303099/nodB-1进行共生相关表型的分析,发现MAFF303099/nodB-1不能使百脉根结瘤;通过组织化学染色对百脉根NINpro-GUS转基因植株根部进行GUS染色,发现MAFF303099/nodB-1仍可以少量诱导LjNIN的表达,并形成极少数的侵入线(IT)结构。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
刘源[8]（2016）在《有害疣孢霉遗传转化体系的建立及其T-DNA插入突变体库的构建》一文中研究指出有害疣孢霉(Hypomyces perniciosu)可引起双孢蘑菇(Agaricus bisporus)湿泡病。随着种植面积的逐年增大,该病的发病率也逐渐增多,特别是在我国双孢蘑菇主产区,因此,对有害疣孢霉的致病分子机制,特别是致病基因的挖掘研究迫在眉睫。高效稳定的遗传转化系统和突变体库构建是挖掘和研究病原菌致病基因的基础和有效手段。但是目前尚未建立有效的有害疣孢霉遗传转化系统和突变体库。因此,本文以高致病力的有害疣孢霉WH001菌株为研究材料,建立并优化根癌农杆菌介导的遗传转化体系,并利用该技术构建有害疣孢霉T-DNA插入突变体库,获得表型改变,致病力降低的突变体库,为今后挖掘有害疣孢霉未知基因功能、解析生物学性状、探讨致病分子机制奠定基础。主要实验结果如下:(1)采用冻融法将pCAMBIA1302的质粒DNA转入根癌农杆菌EHA105中,利用PCR鉴定获得阳性转化子,成功构建了含有GFP荧光蛋白的农杆菌工程菌。然后,以有害疣孢霉WH001为受体,利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术(ATMT)进行转化,并探讨影响转化效率的主要因素,建立了高效、稳定的ATMT转化体系。结果表明有害疣孢霉的潮霉素耐受浓度为250ng/L;以菌丝球为受体,潮霉素为筛选标记进行遗传转化。利用潮霉素磷酸转移酶基因和CaMV35S启动子对获得的转化子进行PCR鉴定,获得阳性转化子;通过荧光蛋白活体成像仪检测到转化子产生荧光,表明GFP基因在阳性转化子中得到表达。然后,本研究进一步对遗传转化体系进行了优化:当农杆菌侵染液浓度OD_(600nm)为0.8,侵染时间45min,共培养培养基中的乙酰丁香酮(AS)浓度为1mg/ml,共培养时间为两天,转化效率达到8.33%。这些结果为有害疣孢霉WH001致病基因功能研究奠定了良好的基础。(2)采用冻融法将双元载体质粒pBHt1转入农杆菌AGL-1中,利用农杆菌介导法构建了高致病力有害疣孢霉WH001菌株的T-DNA插入突变体库,共计得到了转化子964个。然后,选取抗性稳定的11种类型转化子进行了PCR鉴定和形态学观察,通hph的PCR鉴定结果表明,T-DNA已成功导入到有害疣孢霉WH001染色体中;形态学鉴定结果表明,与原菌种WH001相比,有4个类型菌株生长速率降低,有2个类型升高;有3个类型菌株颜色变为浅黄色,有5个类型变为白色;有1个类型菌株产生紫色色素,有2类型菌株产生粉红色色素;有1个类型菌株菌丝变为放射状,有10个类型菌株菌丝变为气生菌丝;有2个类型菌株致病力降低;有6个类型菌株产孢量降低;因此,本研究获得了表型和致病力降低的有害疣孢霉突变菌株,为进一步利用TAIL-PCR技术进行插入位点的准确定位鉴定,挖掘有害疣孢霉WH001重要基因功能、致病分子机制等方面奠定基础。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2016-05-24）
郑伟[9]（2016）在《Botryosphaeria dothidea突变体库的构建和突变体筛选及T-DNA插入位点侧翼序列分析》一文中研究指出Botryosphaeria dothidea是重要的林果溃疡病害病原,分布广,危害重,寄主多样。该病菌引起的病害在20多个国家均有报道,在我国引起的危害亦为严重。因此,明确病菌的致病机制对于有效防控林果溃疡病具有重要意义。目前对于B.dothidea研究主要集中在形态分类、系统发育、遗传多样性以及防治方法等方面,但对其致病的分子机制缺乏系统研究。突变体库的建立和致病相关基因的分离和功能鉴定是深入解析病菌致病分子机理基础,可为病害防控提供理论依据。本研究在已建立的农杆菌介导(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)的遗传转化体系基础上构建了B.dothidea突变体库,得到1053个转化子,通过继代培养和PCR检测证明T-DNA插入到B.dothidea基因组中。对突变体库进行了系统的分析,筛选获得了一些与该病菌生长发育及致病性相关的突变体,并进一步对部分突变菌株的T-DNA插入位点的右翼序列进行了扩增和分析,研究结果如下:(1)以野生型菌株B.dothidea SDAU11-126为对照,对526个转化子的菌落形态、生长特性及致病性测定,筛选到8株突变体菌株:(1)菌株LW-27在PDA上气生菌丝致密但不茂盛,菌落淡黄色,其生长速率和致病性均最小,生长速率和致病性与野生型都有显着差异且分别降低了28.64%和54.90%;(2)菌株LW-22在PDA上气生菌丝致密也不茂盛,菌落淡黄色,其生长速率和致病性均不存在显着差异;(3)菌株LW-7在PDA上气生菌丝疏松旺盛,菌落初为白色,后为灰褐色,生长速率和致病性与野生型均存在显着差异且分别增长了27.60%和13.76%;(4)菌株LW-31在PDA上气生菌丝疏松茂盛,菌落乳白色,其生长速率和致病性与野生型均增强且存在显着差异,分别提高了29.35%和15.65%;(5)菌株LW-26在PDA上气生菌丝致密但不茂盛,菌落乳白色,其生长速率较野生型存在显着差异且降低了24.43%,但其致病性与野生型不存在显着差异;(6)菌株LW-64在PDA上气生菌丝疏松不茂盛,菌落边缘有水溶现象,菌落红褐色,生长速率和致病性与野生型不存在显着差异;(7)菌株LW-100在PDA上气生菌丝疏松不旺盛,菌落呈轮纹状,红褐色,生长速率和致病性与野生型不存在显着差异;(8)LW-111在PDA上气生菌丝疏松且茂盛,菌落呈同心轮纹状、乳白色,生长速率与野生型存在显着差异且增长了27.83%,但其致病性与野生型不存在显着差异。(2)通过hiTAIL-PCR技术对筛选得到的4个突变体菌株进行右侧翼序列扩增,其突变体LW-27的右侧翼序列大小为994bp,经序列比对为甘油激酶(Glycerol kinase)基因;LW-64的右侧翼序列大小为1105bp,经序列比对为GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase)基因;LW-100的侧翼序列大小为1097bp,,经序列比对为GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase)基因,LW-31的侧翼序列大小为1154bp,经序列比对为假定蛋白(hypothetical protein)。(本文来源于《山东农业大学》期刊2016-05-01）
王鑫[10]（2016）在《甘蔗梢腐病菌T-DNA插入突变体库的构建和分析》一文中研究指出甘蔗梢腐病是世界范围内重要的经济作物真菌性病害,其病原真菌为轮枝镰孢菌(F. verticillioides)和层出镰刀菌(F. proliferatum)。通过农杆菌介导的遗传转化分别构建了这两个镰刀菌种(菌株CNO-1和YN41)的突变体库,并利用高效TAIL-PCR和菌落形态对突变体库进行鉴定。结果分别构建了库容量为195的YN41突变体库和库容量为956的CNO-1突变体库。从两个突变体库中分别随机挑选6个转化子,进行PCR鉴定,结果均为阳性。通过菌落特征和致病性筛选YN41和CNO-1突变体库,鉴定出生长速度减慢且致病力下降突变体1个(A5),生长速度减慢且致病力不变突变体1个(C8),生长速度加快且致病力增强突变体2个(A1、A2),菌丝变浓密且菌丝疏水性变弱突变体1个(A3)；采用高效TAIL-PCR对这些转化子的T-DNA侧翼序列进行扩增,获得了A1、A2、A3突变体的T-DNA侧翼序列,通过BLAST鉴定到其插入位点(下游)基因,这些基因分别与色氨酸加氧酶和苯丙氨酸解氨酶等有关。CNO-1突变体库中,筛选出生长速度减慢突变体23个,色素变异突变体1个；对47株突变体进行高效TAIL-PCR,扩增插入位点侧翼序列,得到有效序列22条,BLAST结果显示,T-DNA的22个插入位点分布在CNO-1的15条基因组scaffold上；对插入位点(下游)基因进行分析,结果显示,生长速度减慢突变体的插入失活基因分别与细胞分裂、DNA修复、△12脂肪酸脱氢酶、E3泛素连接酶等有关。(本文来源于《广西大学》期刊2016-05-01）
插入体库论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
豆科植物与根瘤菌共生形成一个特殊的器官-根瘤,根瘤是根瘤菌共生固氮的场所,其形成和发育都是根瘤菌与宿主植物相互作用的结果。在豆科植物中,存在两种不同形态的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生组织活性周期短,且根瘤各个组织的发育阶段一致;不定型根瘤的分生组织活性延续时间长,根瘤菌则持续感染其分生组织,导致根瘤有明确的分生区、侵染区、固氮区和衰老区,各个区域处于不同的发育阶段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤属于不定型根瘤,其共生伙伴-苜蓿中华根瘤菌在侵染区与固氮区间开始分化成类菌体并行使固氮功能。为了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的机制,本研究以中华苜蓿根瘤菌Sm2011菌株为材料,开展了共生固氮相关基因突变体分离和鉴定的工作,主要研究结果如下:1.构建了苜蓿中华根瘤菌Sm2011菌株的突变体库:利用叁亲本杂交技术,以Sm2011为受体,以E.coli S17-1/pMH1701为供体、E.coli/pRK2073作为辅助菌进行叁亲本杂交。其结果表明,Tn5-sacB转座频率为1.84×10~(-6),经Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性筛选,分离得到约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体。随机挑选23个单菌落,通过PCR证实Tn5-sacB插入在根瘤菌基因组。2.筛选根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相关基因的突变体:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突变体(nad1),在接种野生型根瘤菌时,形成不能固氮根瘤(白色)。利用该突变体的根瘤表型,接种Tn5-sacB插入突变的根瘤菌,尝试筛选出能形成粉红色的根瘤。结瘤实验结果表明,在约1600棵nad1缺陷型植株中,未发现有结粉红色根瘤的植株。说明利用该方法难以筛选到根瘤菌恢复nad1突变体结固氮根瘤的表型。3.苜蓿根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定:利用巢式PCR检测技术,从约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体库中鉴定和筛选出4个特定目标基因的插入位点及其突变体,即固氮酶基因nifH-75-9,结瘤基因nodC-32-33,肽聚糖相关基因smc04024-76-79和smc01188-11-80,其中只有smc04024的插入位点位于基因F端上游,其他叁个突变体中Tn5均插入在基因序列中。通过结瘤实验,考察突变体共生及固氮表型,得到野生型苜蓿种子接种nifH基因突变体28 d后,形成不能固氮根瘤(白色);接种nodC基因突变体10 d后,不能形成根瘤。该结果与已经报道的结果完全一致,证实了突变体库的完整性。而在接种smc01188基因突变体28 d后,所得到的根瘤虽然呈粉红色,但红色区域较野生型根瘤大大减少,且植株叶片背面呈红褐色,植株呈现一定程度的缺氮表型;接种smc04024基因突变体28 d后,植株根瘤及叶片与接种野生型根瘤菌相比基本相同,这说明该基因的插入位点未破坏该基因的正常表达。此举为鉴定苜蓿根瘤菌突变体提供资源及筛选程序,为后续深入研究根瘤菌共生固氮调节的分子机制提供科学资料。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
插入体库论文参考文献
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