1浙江海正药业有限公司浙江台州3170042华中农业大学应用真菌研究所湖北武汉4300703湖北国家生物技术开发有限公司湖北武汉430074
摘要：本文对阿魏侧耳子实体多糖的分离纯化及其级份PW2的化学结构进行了初步研究。阿魏侧耳子实体经热水提取醇沉得粗多糖PW。将PW用Sevag法脱蛋白后，去离子，层析，分级分离得三种多糖级份PW1、PW2和PW3，PW2经紫外光谱鉴定不含有蛋白质和核酸；采用纸色谱和高压电泳以及柱色谱分析结果表明多糖PW2满足结构分析的要求。测定其分子量为3.18×104。PW2经过完全酸水解后，测定多糖是由葡萄糖和半乳糖两种单糖组成，摩尔比例为1.77:1。通过红外光谱，核磁共振测试分析，初步确定多糖PW2主要以α构型为主，含有少量β构型，单糖的连接方式主要以1-6连接为主链，含有1-4连接的支链，糖环构型为D-吡喃糖环。
关键词：阿魏侧耳多糖分离纯化化学结构
前言
在真菌多糖的研究方面，早在50年代Bradner等（1958）就提取了酵母多糖，60年代日本对100多种真菌进行了筛选，70年代我国开展了大量的研究，目前对真菌多糖的研究与利用已成为一个“热点”。据文献报道，高等真菌已有50个属178种的提取物都具有抑制S-180肉瘤及艾氏腹水瘤等细胞生长的生物学效应，明显促进肝脏蛋白质及核酸的合成及骨髓造血功能，促进体细胞免疫和体液免疫功能。多糖作为一类重要的生物活性物质，虽然到目前为止，只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖、灰树花多糖等用于临床，但它们在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、愈溃疡等疑难杂症的治疗方面已显示了诱人的前景[22]。随着多糖的制备、结构、合成、药理学及临床学研究的不断深入，多糖药物将具有更广阔的前景。
阿魏侧耳(PleurotusferulaeLanzi)又名阿魏蘑、阿魏菇、白灵菇等，隶属于担子菌亚门Basidiomycotina，层菌纲Hymenomycetes，伞菌目Agaricales，侧耳科Pleurotaceae，侧耳属Pleurotus(黄年来，1997)。阿魏侧耳是一种食药用大型真菌，它因寄生或腐生在一种药用植物阿魏上而得名。本实验室对阿魏侧耳子实体多糖的研究已有十余年历史，结合国内外相关文献得知阿魏侧耳子实体多糖具有免疫调节抗肿瘤等作用，但以前的研究多注重于多糖类化合物的生物活性分析，对活性多糖成分多采用简单的分级，大多未进行完全的分离纯化。因此对阿魏侧耳子实体多糖的化学研究有待进一步深入。
材料与方法
1试验材料
阿魏侧耳（PleurotusferulaeLanzi）子实体由北京金信食用菌有限公司提供。
2主要仪器
真空冷冻干燥机（ALPHAⅠ－5Germany），722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂），DYY-Ⅲ-4型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂），SPD-10A紫外检测器，红外光谱仪（Spectrum2000美国PE公司），高效液相色谱仪（CLASS-VP日本岛津公司），C-R6A色谱数据处理机（日本岛津制造所），超导核磁共振仪（Bruker400德国Bruker公司）。
3试验方法
3.1粗多糖的提取
将阿魏侧耳子实体烘干粉碎，然后取菇粉500g用95%乙醇分别回流6h，脱脂完毕，固形物置于室温通风处凉干，称重为492g，然后分装固形物，各自分三次加入相当于样品重量30倍的水，水浴98±2℃浸提，每次加水提取时间为3h，合并提取液，离心，取上清夜，水浴蒸发浓缩至小体积待用。
3.2粗多糖的分离纯化
3.2.1脱蛋白、去离子
按样品溶液与Sevag试剂（三氯甲烷：正丁醇=5:1）5:1的比例充分混匀，用电磁搅拌器搅拌1-2小时，然后离心收集上清夜，去除蛋白质，按照同样的步骤处理上清夜几次，直至三氯甲烷与上清夜之间无白色胶状物产生为止。然后将脱蛋白后的上清液流水透析三天，蒸馏水透析一天，透析液浓缩至小体积，加入3倍量的95％乙醇沉淀，离心后，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀，最后真空冷冻干燥，得脱蛋白多糖PW4.35g，产率0.87%。
3.2.2分级分离
称取60gDEAE-纤维素，用水浸泡后浮选倾去上清夜，先用1000mL0.5mol/L的NaOH浸泡30min，水洗至中性，然后以1000mL0.5mol/L的HCl处理30min，水洗至中性，再以1000mL0.5mol/L的NaOH处理30min，使之转为OH—型，并用水洗至近中性，然后装柱。将脱蛋白后的粗多糖全部溶于水，经DEAE(OH)型纤维素柱（2.6cm×100cm）层析，先用蒸馏水洗脱，自动收集器收集，每管15min，用苯酚—硫酸法逐管检测多糖含量，一直洗至多糖为阴性反应，然后用0~1mol/L的NaCl作梯度洗脱，每管6min，用苯酚—硫酸法逐管检测多糖含量，一直洗至多糖为阴性反应，合并主峰部分，乙醇沉淀多糖，冷冻干燥得到三个组分PW1、PW2和PW3。将PW2单独保存作为下一步结构研究的样品。
3.3多糖PW2的纯度鉴定
3.3.1紫外分光光度法
将多糖PW2加0.9%NaCl溶液溶解，配成浓度为1mg/mL的溶液，采用UV-160A紫外可见光谱仪扫描（200nm-300nm）观察260nm、280nm处是否有吸收峰。
3.3.2纸层析法（PC）
取0.5%的多糖PW2样品溶液50µL，点样于新华中速滤纸（3cm×20cm）距端点1cm处的中部，以正丁醇：浓氨水：水（40:50:5）为展开剂，饱和2小时以上，在室温下展开6h，取出吹干，用0.5%甲苯胺蓝液染色，立即用95%乙醇漂洗至背景褪色。
3.3.3凝胶柱层析法
用DEAE-纤维素52（2.6cm×100cm）柱层析，0.1mol/LNaCl洗脱，流速6mL/h，按2mL一管分部收集，苯酚—硫酸法逐管检测，绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。
3.3.4琼脂糖（Agarose）凝胶电泳法
在琼脂糖板（厚度为0.2cm）上点样3~5µL采用浓度为0.075mol/L，pH8.6的巴比妥缓冲液，电泳1~1.5h，电压为64~80V，甲苯胺蓝（浓度为1%）染色，醋酸乙醇混合溶液（醋酸：乙醇：水=0.1:5:5）脱色。PW2多糖纯品经电泳展开。
3.4红外光谱分析
取干燥样品微量，压片，全波段扫描。
3.5核磁共振分析
将样品10mg，溶于D2O（重水）中，溶解温度80℃，分别在400MHz和500MHz上测定1HNMR和13CNMR。
3.6单糖组成分析
3.6.1样品的水解：称取20mg样品，加入2mL2mol/L的H2SO4于安培管中沸水浴水解8h，水解液用BaCO3中和至pH=7，离心，取上清夜置冰箱冷藏备测。
3.6.2高效液相色谱：色谱条件为：色谱柱为ShodexKS804Sugar(300mm×7.8mm)，柱温40度；流动相为水，流速0.8mL/min。检测用410RⅠ示差检测器，数据处理用810GPC软件进行。同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖八种单糖进行对照，根据峰值确定样品的单糖组成。
3.7分子量的测定：
以标准分子量的葡聚糖Pulluan作分子量测定标准。让其通过高压液相色谱柱，条件同3.72，先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线，从标准葡聚糖Pulluan的工作曲线上可以求得PW2分子量。
结果与分析
1多糖的提取和分离
以阿魏侧耳子实体为原料，经热水提取后的到脱蛋白多糖的产率为0.87%，经过NaCl梯度浓度柱色谱分离三种多糖级份的比例为2.9:1.3:3.8，即其中PW3的含量最高，PW2的含量最低。
2多糖的基本物理性质
PW1和PW3为淡黄色粉末，PW2为白色粉末，均无臭、无味，都较难溶于冷水，但都易溶于热水或稀酸，且水溶液浓度较大是呈胶体状，都易被醇、酮和醚等有机溶剂析出。
4纯度鉴定结果
多糖PW2的紫外扫描结果表明，该多糖仅在200nm处显示多糖吸收峰，无260nm处的核酸吸收峰和280nm处的蛋白质吸收峰。说明PW2多糖不含有核酸和蛋白质。纸层析法鉴定结果是在滤纸上呈现单一斑点，琼脂糖凝胶电泳在凝胶带上也呈现单一斑点，柱色谱的结果也呈现单一对称峰，说明样品PW2为较为均一的多糖，其纯度满足结构测定的要求。
5红外光谱分析
样品PW2的红外光谱图见图1、2：
图中显示在4000cm-1~650cm-1区内的是具有多糖类物质的一般特征。3372cm-1的吸收峰是O-H和N-H的伸缩振动峰，2931cm-1为C—H的吸收峰，即为-CH和-CH2的共振吸收锋。这两类是糖类的特征吸收峰。848cm-1吸收峰表明在PW2多糖纯品结构中存在α型（即α端基差向异构体），1026cm-1、1081cm-1和1152cm-1的吸收峰表明PW2中的糖环为吡喃糖环，这是由醚键C—O—C振动而产生的吸收峰；而呋喃糖环在此区间上只有两个强吸收峰。在890cm-1处有微弱吸收，表明样品中含有少量β型糖苷键，而在810cm-1处没有振动吸收峰表明没有甘露糖的存在。928cm-1为糖类分子振动吸收峰，即D-吡喃糖的非对称环伸缩振动产生。而1725cm-1的存在，表明多糖含有糖醛酸基团，即PW2为酸性多糖。
6核磁共振氢谱分析
在图3中：5.39吸收峰表明样品的主要构型为α-构型，由于存在4.97吸收峰的存在，表明存在少量的β-构型（α-构型C-1信号在δ103以下，H-1信号在δ5.0以上；β-构型C-1信号在δ104以上，H-1信号在δ5.0以下）。且α-构型与β-构型残基的比例为1:0.2843。
7核磁共振碳谱分析
由图4可以看出：C-1信号在100.4ppm，即处在90-103之间，表明多糖的异头碳的构型为α-构型，同时可以看到存在一个微弱的117ppm峰，表明样品中有少量的β-构型，峰的相对高度正比于碳的数目，即α-构型与β-构型残基的比例为1:0.29，这个结果和红外光谱以及氢谱的结论完全吻合。
图中70-76之间的碳共振峰分别是未被取代的C-2、C-3、C-4，其中，α与β两种构型的共振峰重叠严重，由于77.906为被取代的C-4的糖苷键的共振峰，图中可以看出存在重叠峰，这是由于α与β两种构型和两种单糖造成的，C-6部分共振峰由61.114向低场移动到69.977表明多糖PW2存在1-6糖苷键，根据峰高比例可以大约看出多糖PW2的主链为1-6糖苷键，存在1-4糖苷键的支链。由C-1和C-6的峰高比例可以看出多糖PW2的支链不多。
8PW2的单糖组成及分子量
将水解后的多糖样品PW2进行HPLC分析，结果如表所示：阿魏侧耳子实体多糖PW2经过酸水解后，得到2种单糖：葡萄糖和半乳糖，摩尔比例1.77:1。
经HPLC测定后对照标准曲线得多糖PW2的分子量为3.18×104。
讨论
在脱蛋白的过程中，本文应用的是大多数报道中采用的Sevag法，但是在本实验中，可以看出有些报道中说的8次左右并不足以完全清除蛋白质，需要更多次的反复，直到分液层没有白色乳状物为止，这样造成许多的多糖在分液过程中流失，所以对最后多糖产率有很大的影响。如果结合蛋白质水解酶水解（如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶等）使用，先使样品中蛋白质部分水解后，再用Sevag法处理，效果更明显，这样可以节约大量的试剂和时间。
由于碳谱的分辨率不高，所以给结构的分析造成了困难，其原因可能有两方面，一是测试之前多糖在D2O中没有充分的溶解，在溶解时间和温度上需要摸索，另外还可能是在核磁共振过程中的重复次数不够，或者仪器的频率不够。如果结合化学的方法可以弥补不足，比如高碘酸氧化法，就可以更好的确定多糖的重复单元。有关工作可在进一步有关工作完成。
综上分析，可以对多糖PW2的化结构可以表征为：其主体结构为α（1-6）-D-Glc构成，分支点在C-4位，以α（1-4）糖苷键或者β（1-4）糖苷键与Gal相连，且分子侧链较少。
本文只对阿魏侧耳子实体三种组分中的PW2进行了结构测定，其它两个组分PW1和PW3有待进一步的结构鉴定研究，对三种多糖的免疫活性也可以进行对比试验。
参考文献
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