本文主要研究内容
作者林静（2019）在《腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立》一文中研究指出：腐败梭菌（Clostridium septicum）在土壤等自然界环境中分布十分广泛,是造成动物和人类恶性水肿病的主要病原体。该细菌感染羊后主要引发羊快疫,发病羊在2-3天内迅速死亡,给我国畜牧行业带来重大损失。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的早期诊断方法,以做到对临床可疑发病样品的快速筛查。腐败梭菌最主要毒力因子为α毒素,该毒素具有溶血、致死和坏死等多种生物学活性,因此本研究以α毒素为主要研究对象,通过制备α毒素单克隆抗体及多克隆抗体,完成对双抗体夹心ELISA（Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）检测方法的初步探索,为羊快疫等腐败梭菌病的早期临床诊断提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌天然α毒素与重组毒素蛋白的制备将腐败梭菌参考株（ATCC 12464）进行菌种复苏和增菌培养后,粗提腐败梭菌天然蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）对提纯后的蛋白进行验证,获得大小为46 kDa的天然α毒素。根据NCBI上公布的腐败梭菌α毒素的CDs区序列,扩增α毒素基因,构建腐败梭菌α毒素原核表达系统,并在最佳诱导条件下(菌液OD600nm为0.4-0.6时,向菌液中加入浓度为0.5 mmol/mL的IPTG,37℃条件下诱导表达5 h)大量表达可溶性重组蛋白并纯化,最终测得目的蛋白浓度为4.28 mg/mL。通过Western blot分析表明该蛋白具有良好的免疫原性,证明腐败梭菌α毒素原核表达系统构建成功。2、单克隆抗体及多克隆抗体的制备使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫新西兰大白兔,将获得的阳性血清利用抗原亲和层析方法进行纯化,获得纯化后的多克隆抗体浓度为0.98 mg/mL,多克隆抗体对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,通过SDS-PAGE及Western-blot检测结果发现该多克隆抗体纯度高,特异性良好。使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠血清转阳后制备脾细胞并进行细胞融合,通过杂交瘤细胞筛选及亚克隆实验,最终确定8株强阳性细胞株。通过稳定性检测发现有6株细胞可以稳定分泌单克隆抗体,其中3E8、6B12和6F10细胞株对天然α毒素的识别能力较强。选取其中的两株细胞3E8和6B12,分别腹腔注射免疫BALB/c小鼠,收集腹水并纯化后,通过间接ELISA测得两株单抗对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,两株单抗浓度分别为2.27mg/mL和1.96 mg/mL,通过SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定单抗纯度及特异性,结果发现制备的两株单克隆抗体纯度高,特异性良好。3、针对腐败梭菌α毒素DAS-ELISA的初步建立为建立高效、灵敏的DAS-ELISA方法,探索最佳配对抗体及抗体工作浓度,本研究将多克隆抗体作为捕获抗体,将单抗3E8和6B12分别作为检测抗体,通过方阵滴定实验,确定作为捕获抗体的多克隆抗体的最佳工作浓度为1.25μg/mL,作为检测抗体的单抗3E8的最佳工作浓度为0.5μg/mL。在优化条件下验证该方法的特异性,结果表明该方法仅对腐败梭菌重组α毒素和天然α毒素具有识别作用,与其他蛋白无交叉反应,特异性良好。本研究成功构建了腐败梭菌α毒素重组蛋白的原核表达系统,在最佳诱导条件下大量诱导表达可溶性的目的蛋白,并以α毒素重组蛋白为基础,成功制备出针对腐败梭菌α毒素的特异性强,稳定性好的单克隆抗体及多克隆抗体。初步摸索出DAS-ELISA的最佳配对抗体及最佳抗体工作浓度,并验证了优化后的DAS-ELISA的特异性。为家畜腐败梭菌病的临床诊断提供了技术方法,也为腐败梭菌病疫苗和相关药物的研发提供了技术支撑。
Abstract
fu bai suo jun （Clostridium septicum）zai tu rang deng zi ran jie huan jing zhong fen bu shi fen an fan ,shi zao cheng dong wu he ren lei e xing shui zhong bing de zhu yao bing yuan ti 。gai xi jun gan ran yang hou zhu yao yin fa yang kuai yi ,fa bing yang zai 2-3tian nei xun su si wang ,gei wo guo chu mu hang ye dai lai chong da sun shi 。yin ci ,pai qie xu yao jian li yi chong zhen dui yang kuai yi deng fu bai suo jun bing de zao ji zhen duan fang fa ,yi zuo dao dui lin chuang ke yi fa bing yang pin de kuai su shai cha 。fu bai suo jun zui zhu yao du li yin zi wei αdu su ,gai du su ju you rong xie 、zhi si he huai si deng duo chong sheng wu xue huo xing ,yin ci ben yan jiu yi αdu su wei zhu yao yan jiu dui xiang ,tong guo zhi bei αdu su chan ke long kang ti ji duo ke long kang ti ,wan cheng dui shuang kang ti ga xin ELISA（Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）jian ce fang fa de chu bu tan suo ,wei yang kuai yi deng fu bai suo jun bing de zao ji lin chuang zhen duan di gong ji shu zhi chi 。yan jiu nei rong ke fen wei yi xia san ge bu fen :1、fu bai suo jun tian ran αdu su yu chong zu du su dan bai de zhi bei jiang fu bai suo jun can kao zhu （ATCC 12464）jin hang jun chong fu su he zeng jun pei yang hou ,cu di fu bai suo jun tian ran dan bai ,shi yong shi er wan ji liu suan na -ju bing xi xian an ning jiao dian yong （Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）dui di chun hou de dan bai jin hang yan zheng ,huo de da xiao wei 46 kDade tian ran αdu su 。gen ju NCBIshang gong bu de fu bai suo jun αdu su de CDsou xu lie ,kuo zeng αdu su ji yin ,gou jian fu bai suo jun αdu su yuan he biao da ji tong ,bing zai zui jia you dao tiao jian xia (jun ye OD600nmwei 0.4-0.6shi ,xiang jun ye zhong jia ru nong du wei 0.5 mmol/mLde IPTG,37℃tiao jian xia you dao biao da 5 h)da liang biao da ke rong xing chong zu dan bai bing chun hua ,zui zhong ce de mu de dan bai nong du wei 4.28 mg/mL。tong guo Western blotfen xi biao ming gai dan bai ju you liang hao de mian yi yuan xing ,zheng ming fu bai suo jun αdu su yuan he biao da ji tong gou jian cheng gong 。2、chan ke long kang ti ji duo ke long kang ti de zhi bei shi yong mie huo hou de chong zu αdu su dan bai mian yi xin xi lan da bai tu ,jiang huo de de yang xing xie qing li yong kang yuan qin he ceng xi fang fa jin hang chun hua ,huo de chun hua hou de duo ke long kang ti nong du wei 0.98 mg/mL,duo ke long kang ti dui chong zu dan bai xiao jia jian ce jie guo wei 1:256000,dui tian ran αdu su xiao jia jian ce jie guo wei 1:128000,tong guo SDS-PAGEji Western-blotjian ce jie guo fa xian gai duo ke long kang ti chun du gao ,te yi xing liang hao 。shi yong mie huo hou de chong zu αdu su dan bai mian yi BALB/cxiao shu ,xiao shu xie qing zhuai yang hou zhi bei pi xi bao bing jin hang xi bao rong ge ,tong guo za jiao liu xi bao shai shua ji ya ke long shi yan ,zui zhong que ding 8zhu jiang yang xing xi bao zhu 。tong guo wen ding xing jian ce fa xian you 6zhu xi bao ke yi wen ding fen bi chan ke long kang ti ,ji zhong 3E8、6B12he 6F10xi bao zhu dui tian ran αdu su de shi bie neng li jiao jiang 。shua qu ji zhong de liang zhu xi bao 3E8he 6B12,fen bie fu qiang zhu she mian yi BALB/cxiao shu ,shou ji fu shui bing chun hua hou ,tong guo jian jie ELISAce de liang zhu chan kang dui chong zu dan bai xiao jia jian ce jie guo wei 1:256000,dui tian ran αdu su xiao jia jian ce jie guo wei 1:128000,liang zhu chan kang nong du fen bie wei 2.27mg/mLhe 1.96 mg/mL,tong guo SDS-PAGEhe Western-blotfang fa jian ding chan kang chun du ji te yi xing ,jie guo fa xian zhi bei de liang zhu chan ke long kang ti chun du gao ,te yi xing liang hao 。3、zhen dui fu bai suo jun αdu su DAS-ELISAde chu bu jian li wei jian li gao xiao 、ling min de DAS-ELISAfang fa ,tan suo zui jia pei dui kang ti ji kang ti gong zuo nong du ,ben yan jiu jiang duo ke long kang ti zuo wei bu huo kang ti ,jiang chan kang 3E8he 6B12fen bie zuo wei jian ce kang ti ,tong guo fang zhen di ding shi yan ,que ding zuo wei bu huo kang ti de duo ke long kang ti de zui jia gong zuo nong du wei 1.25μg/mL,zuo wei jian ce kang ti de chan kang 3E8de zui jia gong zuo nong du wei 0.5μg/mL。zai you hua tiao jian xia yan zheng gai fang fa de te yi xing ,jie guo biao ming gai fang fa jin dui fu bai suo jun chong zu αdu su he tian ran αdu su ju you shi bie zuo yong ,yu ji ta dan bai mo jiao cha fan ying ,te yi xing liang hao 。ben yan jiu cheng gong gou jian le fu bai suo jun αdu su chong zu dan bai de yuan he biao da ji tong ,zai zui jia you dao tiao jian xia da liang you dao biao da ke rong xing de mu de dan bai ,bing yi αdu su chong zu dan bai wei ji chu ,cheng gong zhi bei chu zhen dui fu bai suo jun αdu su de te yi xing jiang ,wen ding xing hao de chan ke long kang ti ji duo ke long kang ti 。chu bu mo suo chu DAS-ELISAde zui jia pei dui kang ti ji zui jia kang ti gong zuo nong du ,bing yan zheng le you hua hou de DAS-ELISAde te yi xing 。wei jia chu fu bai suo jun bing de lin chuang zhen duan di gong le ji shu fang fa ,ye wei fu bai suo jun bing yi miao he xiang guan yao wu de yan fa di gong le ji shu zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山东农业大学的林静，发表于刊物山东农业大学2019-07-08论文，是一篇关于腐败梭菌毒素论文,原核表达系统论文,单克隆抗体论文,多克隆抗体论文,山东农业大学2019-07-08论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山东农业大学2019-07-08论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：腐败梭菌毒素论文; 原核表达系统论文; 单克隆抗体论文; 多克隆抗体论文; 山东农业大学2019-07-08论文;