导读:本文包含了永生化肝细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肝细胞,细胞移植,急性毒性试验,组织工程
永生化肝细胞论文文献综述
卢扬洲,黎少,姜华,李伟,高毅[1]（2019）在《永生化人肝细胞HepZJ的临床前急性毒性评价》一文中研究指出背景:肝细胞移植、肝脏组织工程与生物人工肝的研究为肝衰竭患者带来福音,然而截至目前仍未发现十分合适的种子细胞。课题组前期自行构建人永生化肝细胞系HepZJ作为新的种子细胞,并进行了临床前安全性评价研究。目的:对新型永生化人肝细胞系HepZJ进行急性毒性研究,为HepZJ应用于临床可能发生的毒副反应以及设计安全剂量提供参考依据。方法:在HepZJ细胞急性毒性研究中,将低、中、高(5×10~6,5×10~7,8.25×10~7)3个剂量组的HepZJ细胞悬液和空白对照溶液经尾静脉单次注射进入SD大鼠体内,观察大鼠的临床症状和体质量变化,注射结束后第1天以及第14天剖检进行血液学相关检验、大体病理和免疫组化检查,综合分析该细胞系的毒副反应和安全剂量。结果与结论:在HepZJ细胞急性毒性研究中,高剂量组大鼠注射结束时出现1只死亡,与对照组比较,血常规、凝血功能和血清生化部分指标差异有显着性意义(P <0.05);14 d后各项检查差异无显着性意义(P> 0.05)。低剂量组和中剂量组大鼠与对照组在临床症状、体质量变化、血液指标和大体病理形态上差异均无显着性意义。结果表明,永生化人肝细胞系HepZJ单次注射安全剂量为5×10~7/只,无明显毒副反应,剂量过大时可出现明显毒副反应,包括炎症应激、凝血障碍和肝功能损伤等,甚至死亡。因此,只有准确控制HepZJ的使用剂量,才能保证该细胞的临床应用安全性。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2019年13期）
卢扬洲,黎少,姜华,李路路,王超[2]（2018）在《新型永生化人肝细胞系HepZJ的安全性研究》一文中研究指出目的对新型永生化人肝细胞系Hep ZJ进行安全性研究。方法获取Hep ZJ培养上清液,通过PCR联合琼脂糖凝胶电泳法进行支原体检测,通过显色基质法进行内毒素检测;将Hep ZJ细胞悬液经尾iv进入SD大鼠后观察其生存情况并于不同时间点进行剖检,通实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法分析该细胞系的生物分布;将Hep ZJ细胞悬液sc进入BALB/c-nu裸鼠后分析其致瘤性。结果 Hep ZJ支原体检测电泳图未见阳性条带;内毒素检测浓度<2 EU/m L;SD大鼠尾iv Hep ZJ后生存情况良好,血液、肺脏、脾脏在不同时间点出现不同程度的GAPDH-Human和TERT-Human基因表达,血液中12 h后、肺脏和脾脏中1周后基本被清除,剖检过程中未见肿块形成;裸鼠sc Hep ZJ后无硬性肿物形成。结论新型永生化人肝细胞系Hep ZJ无支原体、细菌污染,进入体内后无明显副反应及致瘤性,具备应用安全性。(本文来源于《药物评价研究》期刊2018年06期）
马娜[3]（2016）在《树鼯肝细胞永生化方法的建立及ITH6.1细胞系特性分析》一文中研究指出肝脏疾病是一系列严重危害人类健康的疾病,合适的动物模型仍然为许多药物筛选和疫苗开发所急需。相对于小鼠、大鼠等啮齿类动物,树鼩是一种与灵长类亲缘关系更为接近的小型动物,因此具有其独特的应用价值。由于与人相似的肝炎药物靶向基因以及能够感染以人类为特定宿主的嗜肝性病原体(如肝炎病毒等),树鼩肝细胞具备了与人肝细胞很多相似的特点。然而,树鼩这一研究模型还有许多不成熟、需要被优化的地方。例如种群不均一、实验周期长,常常会导致实验结果偏差较大、可重复性差。同时,利用原代树鼩肝细胞进行研究也受到诸多限制,因为肝脏是一种处于分化末端的器官,即使经过较为费时费力的操作获得原代肝细胞,细胞在体外培养数天后就会死亡,很难进行耗时较长的基因导入或基因编辑等实验研究。由于目前还没有建立树鼩永生化肝细胞系的先例,因此本研究以建立永生化树鼩肝细胞系为目的,通过向体外树鼩原代肝细胞导入外源性基因,成功建立了树鼩肝细胞永生化的方法。随后,本研究对一株永生化树鼩肝细胞系ITH6.1 (immortalized tupaia hepatocyte 6.1)进行了特性分析,研究显示：该细胞有着较强的增殖能力,连续传代超过100次后,仍保持相对稳定的细胞特性。进一步对ITH6.1进行基因测序、蛋白表达、生化指标等特性分析,结果显示了ITH6.1具有典型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。树鼩永生化细胞系的建立不但减少了实验动物的使用量,提供了一种更为稳定的实验研究对象,同时也将为树鼩动物肝病模型的优化提供更为方便快捷的体外预分析系统。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2016-05-01）
刘征涛[4]（2014）在《影响广西防城港地区男性人群谷丙转氨酶水平的遗传变异及其在永生化肝细胞株中的验证》一文中研究指出第一章第一部分影响广西防城港地区男性人群谷丙转氨酶水平的流行病学因素及其相互作用分析目的：在普通人群中，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)升高通常提示显着的或者潜在的肝脏疾病，甚至会累计对全身健康造成威胁。因此，基于广西防城港地区男性人群健康调查（The Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey, FAMHES）的结果，我们评估了影响该地区成年男性人群血清中ALT水平的流行病学因素以及他们之间的相互作用。方法：在4304例受试者中，我们总共纳入了2119例在2009年9月至2009年12月完成了完整的体格检查，实验室检查，肝脏超声检查以及调查问卷的符合纳入标准的受试者数据。结果：在纳入人群中，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liverdisease, NAFLD）和代谢综合征（metabolic syndrome, MetS）的患病率显着相关于ALT水平的升高（P <0.05）。NAFLD和MetS的患病率密切相关（r=0.991，P=0.009）不正常的MetS各组分比例随着ALT水平的升高成比例的明显增加（P <0.01）。在随后进行的多元线性回归分析中，腹部肥胖指标体重指数（body mass index, BMI）和高脂血症和ALT水平显着相关（P <0.01）。在乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）和MetS的交互作用研究中，我们并未发现其对于ALT水平有明显交互作用。HBsAg和MetS之间对ALT影响的协同作用系数(synergy index,SI)为0.74，95%可信区间（confidence interval, CI）:0.71-0.80。结论：在防城港地区男性人群中，NAFLD和MetS的患病率显着相关于ALT水平。腹部肥胖和高脂血症是导致ALT水平升高的独立危险因素。这一发现提示在这一地区男性人群中，有必要在检测ALT水平的过程中校正这些可能导致ALT水平升高的危险因素。第一章第二部分针对前瞻性研究的循证医学研究发现谷丙转氨酶水平升高显着相关于代谢综合征的发生目的：代谢综合征（metabolic syndrome, MetS）的发病率在世界范围内显着升高且与谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）活动水平紧密联系。但是，ALT活动水平对MetS发生率的影响在已发表文献中的报道并不一致。因此，我们针对前瞻性队列研究通过荟萃分析的方法估算了ALT活动水平升高和MetS发生率之间的关系。方法：收集所有已发表在Pubmed, Embase,和ISI数据库中的研究ALT活动水平和MetS发生率之间关系的前瞻性队列研究（文献发表在2014年1月10日之前）。包括研究的国别，性别组成，纳入人群的年龄，随访时间，MetS定义，校正因素，相对危险度（relative risk,RR）等具体指标直接或间接从最终纳入文献中提取或计算。我们将分别估计二分类变量的合并RR值及其95%可信区间（confidence interval, CI）（RR定义为高ALT水平组人群MetS发生率/低ALT水平组人群MetS发生率）和连续变量的合并RR值及95%CI(RR定义为ALT水平每升高5单位每升[unit perliter,U/l]人群中MetS发生率变化的比值)。如果组间异质性不明显（P值>0.05以及I2<50%）,在计算合并RR值的过程中则采用固定效应模型；如果组间有显着的差异性(P值≤0.05或I2≥50%)，则采用随机效应模型。结果：总共七篇前瞻性队列研究，包含了31545例受试者和2873例在随访期间发生MetS的病例被纳入本次研究。在比较高值ALT水平和低值ALT水平人群MetS发生率的差异中，合并估计的RR值为1.81(95%CI:1.49-2.14)。而在剂量-反应计算估计ALT水平每升高5U/l导致人群MetS发生率的变化中，合并估计的RR值为1.13（95%CI:1.11-1.16）。亚组分析发现性别差异可能是整个研究中异质性的主要来源。在以性别为标准的亚组分析中，亚组之间剂量-反应(每5U/l)估算的合并RR值比较P=0.007。女性有比男性更高的剂量反应RR（1.38,95%CI:1.20-1.55）。进一步的，敏感度分析证实了结果的可靠性。本次荟萃分析并未发现显着的发表偏倚。结论：目前基于前瞻性研究的循证医学证据支持ALT水平升高增加MetS发生风险的观点。且这种关联在女性人群中表现得更加紧密，一致性更好。这一关系有待更多的研究证实。同时ALT水平升高对MetS发生的潜在机制研究也有待进一步探索。第二章全基因组关联研究发现新的影响广西防城港地区男性人群中血清谷丙转氨酶水平的单核苷酸多态性位点及其生物信息学意义分析目的：谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是评估肝脏疾病和全身健康的重要的生物标志物。ALT水平受到环境因素和遗传因素的共同影响。因此我们实施了一项全基因组关联研究（genome-wideassociation studies，GWAS），结合前期防城港地区男性健康调查（Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey,FAMHES）结果，找出影响防城港地区男性健康人群的ALT水平的常见遗传学变异及其与环境因素的交互作用。方法：采集研究人群的外周静脉血检测血清提取脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）样本。在前期FAMHES纳入的人群中，总共1999例健康男性的外周血样进行全基因组单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphisms,SNPs）检测，平台为Illumina Omni One。在全基因组SNPs分型的基础之上，采用校正了年龄，体重指数（body massindex, BMI）,甘油叁酯（triglycerides,TG）变量的多元线性回归模型，寻找可能影响该地区男性人群ALT水平的常见遗传变异标志。进一步地，全基因组关联分析在以乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）为分类标准的亚组中进行比较。全基因组关联分析统计学检验显着性水平的检验标准为P<1*10‐5,在乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性人群中的统计学检验显着性水平的检验标准为P<0.05。基因分型的质量控制标准：满足哈‐温平衡（Hardy‐Weinberg Equilibrium，HWE检验P＞0.001）;最小等位基因频率>0.01；基因分型成功率(call rate)＞0.95。采用非参数检验（Mann‐Whitney Test）的方法比较以HBsAg和MetS分类的亚组中不同SNP基因型之间的ALT值。最后，采用交互作用的流行病学模型，结合潜在遗传变异和常见的影响ALT水平的表型因素（包括代谢综合征[metabolic syndrome, MetS]和乙肝病毒[hepatitis B virus, HBV]感染）,评估遗传变异和表型因素之间的交互作用。结果：本次GWAS总共发现位于5个基因区域的7个SNPs经全基因组关联分析统计学检验后，显着性水平P<1*10-5,包括：位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061(P=7.46*10-7),rs10752781(P=1.29*10-6),rs1878544(P=2.16*10-6)；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453(P=1.11*10-6)；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847(P=3.26*10-6)；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020(P=7.73*10-6)；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484(P=8.20*10-6)。其中位于2个基因区域的4个SNPs(位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453)经全基因组关联分析统计学检验后显着性水平P<3*10-6。在HBsAg阳性人群中，位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484同时达到在HBsAg阳性人群中的统计学效力（P<0.05）。在结合SNP基因型和MetS，HBsAg表型分组的的亚组分析中，各亚组间人群ALT值仍然SNP基因型的变化而有所差异(P<0.05)。我们发现潜在意义较大(P<3*10-6)的候选SNPs（包括位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061, rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453）和阳性HBsAg之间对ALT水平的影响的协同效应系数[synergy index, SI]及其95%可行区间（confidenceinterval，CI）均大于1。结论：因此，一项针对防城港地区成年男性人群的GWAS发现了新的影响人群血清中ALT水平的常见遗传变异标记。其中SLC35F3和CUX2可能是影响该地区成年男性血清ALT水平的易感基因。但是这种效应可能因为人群的肝炎病毒感染背景不同而有所不同。SNPs对人群ALT水平的影响可能会在HBV感染的背景下扩大。候选SNPs及其所在基因区域为个体化医学诊断和治疗提供了潜在的遗传学标记。同时为下一步的验证ALT水平的遗传学机制提供了有意义的靶点。潜在SNPs及其所在基因区域对ALT水平的影响机制有待进一步研究证实。第叁章第一部分全基因组关联研究发现的新的影响防城港地区男性人群血清谷丙转氨酶水平的单核苷酸多态性位点在永生化肝细胞株中的验证目的：基于前期针对防城港地区男性健康调查（Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey,FAMHES）人群全基因组关联研究（genome-wide association study,GWAS）的结果，我们发现了新的影响防城港地区健康男性血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphisms,SNPs）。但是GWAS发现的SNPs与表型特征之间可能存在假关联。因此，我们选取永生化肝细胞株为研究对象其中候选SNPs与其上清液ALT水平之间的关联关系。同时对SNPs坐落的基因，GPT基因（肝脏ALT编码基因）及其编码蛋白表达水平进行检测，在细胞株层面探讨候选SNPs坐落基因及其编码蛋白的表达水平与GPT基因及编码蛋白表达水平及各细胞株表型（即各细胞株上清液ALT水平）之间存在的关系。方法：选取BEL-7402，BEL-7404，HL-7702，SMMC-7721，Hep-G2，MHCC-97H,MHCC-97L共7株永生化肝细胞株作为研究对象，通过细胞培养繁殖，消化贴壁细胞后提取细胞用做以下实验：1.提取细胞脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），针对目的SNPs设计普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）引物,通过PCR反应获得扩增产物。产物以sanger双向测序法获得目的SNPs（左右约50个碱基对[base-pairs,BP]）片段序列,从而获得目的SNPs的基因型结果；2.提取细胞株上清液，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbentassay，elisa）的方法获取各细胞株上清液ALT值；3.针对候选SNPs坐落基因，设计特异性实时荧光定量PCR（real-time PCR）引物,检测不同基因型的肝细胞株间目的基因和ALT基因的表达情况；4.提取细胞的总蛋白，设计针对目的基因编码蛋白的特异性抗体，采用蛋白印迹（western-blot）的方法观察特异蛋白的表达情况；4.将消化细胞接种到无菌玻璃片上，采用特异性抗体免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）的方法观察各特异蛋白在不同细胞株中的表达部位以及表达量变化。细胞实验均采取叁次重复，计量指标采用平均值±标准差（mean±standard deviation [SD]）表示。各细胞株间上清液ALT值，目的基因表达量及目的蛋白表达量之间比较采用非参数检验Mann-Whitney U检验的方法进行。表达量相关性比较采用pearson相关系数计算。P<0.05被认为有显着统计学差异。结果：总共7个永生化肝细胞株中，在其中3个基因区域的5个SNPs上表现出多态性，所有候选SNPs在细胞株中均表现为纯合子。7个细胞株按照其携带的不同SNPs的高值等位基因数目分布的不同分为3组：其中A组细胞株MHCC-97H和MHCC-97L在位于SLC35F3基因1q42.2区域上的rs10157061,rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12区域上的rs4766453；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847共5个SNPs上均携带高值等位基因，B组细胞株SMMC-7721在位于SHANK1基因上的rs4801847SNP上携带高值等位基因，C组细胞株（包括BEL-7402，BEL-7404，HepG2，HL-7702）在总共位于5个基因区域的7个SNPs上均携带低值等位基因。经比较，A组MHCC-97H和MHCC-97L细胞株在上清液ALT值显着高于其他各组细胞株ALT值，B组SMMC-7721细胞株与C组细胞株间上清液ALT值差异无统计学显着性。实时荧光定量PCR的结果提示A组GPT基因表达水平高于B组，C组，但SLC35F3的表达水平和GPT基因表达水平呈现显着负相关（r2=-0.672，P=0.001），CUX2的表达水平在不同基因型分组中，组间表达差异无统计学显着性（P>0.05）。实时荧光定量PCR结果得到了蛋白印迹和免疫组化结果的印证。在蛋白印迹实验中，A组SLC35F3编码蛋白表达水平显着低于B组，C组，差异有统计学显着性（P<0.05）。A组GPT编码蛋白表达水平显着高于B组，C组，差异有统计学显着性（P<0.05）。CUX2编码蛋白组间表达无统计学差异（P>0.05）。各组间SLC35F3和GPT蛋白表达水平存在明显负相关（r=-0.527， P=0.002）。免疫组化实验印证了蛋白印迹结果。结论：基于FAMHES的GWAS研究中发现的影响男性人群血清ALT水平的SNPs，我们结合体外细胞学验证得出：1.位于SLC35F3基因1q42.2上的显着影响人群血清ALT水平的候选SNPs（包括rs10157061，rs10152781,rs1878544）同时显着影响SLC35F3基因和蛋白表达水平。高值等位基因对应SLC35F3基因和编码蛋白的低表达。2. SLC35F3基因可能是影响肝细胞ALT分泌水平的易感基因。SLC35F3的基因和编码蛋白的表达水平的上调与GPT基因的低表达及细胞ALT的低水平相关。位于1q42.2上的强连锁不平衡区域的rs10157061，rs10152781,rs1878544可能通过影响SLC35F3的基因和蛋白表达水平间接地影响和调控了肝细胞ALT水平。相关机制有待进一步研究证实。第叁章第二部分低浓度乙醇暴露下永生化肝细胞株MHCC-97H和BEL7402中SLC35F3基因表达研究背景和目的：基于前期细胞株验证的初步结果，我们发现SLC35F3基因可能对体外永生化肝细胞株中谷丙转氨酶（glutamic-pyruvictransamine GPT）基因表达水平，上清液谷丙转氨酶（alanineaminotransferase,ALT）水平存在影响。SLC35F3基因及其编码蛋白的低表达关联于GPT基因的高表达和ALT值的升高。但永生化肝细胞株在外界环境压力下，SLC35F3和GPT的表达情况仍不得而知。因此，我们设计了低浓度乙醇干预实验，观察体外永生化肝细胞株SLC35F3，GPT基因及其编码蛋白表达情况，及其相互关系。方法：选取永生化肝细胞株BEL-7402和MHCC-97H作为研究对象。分别以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇浓度干预永生化肝细胞株，并观察永生化肝细胞株在3小时，6小时，12小时，24小时不同时间节点的ALT分泌值，SLC35F3，GPT基因及其编码蛋白表达值选取BEL-7402，MHCC-97H两株永生化肝细胞株作为研究对象，通过细胞培养繁殖，消化吹散后均匀接种于24孔板中，贴壁后观察细胞，分别以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇浓度干预永生化肝细胞株，并观察永生化肝细胞株在3小时，6小时，12小时，24小时不同时间节点对永生化肝细胞株进行以下处理：1.提取细胞株上清液，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，elisa）的方法获取各细胞株上清液ALT值；2.针对SLC35F3和GPT基因，设计特异性实时荧光定量PCR（real-time PCR）引物,检测不同细胞株不同时间-浓度乙醇干预水平下SLC35F3和GPT基因表达水平；3.提取细胞株在不同时间-浓度乙醇干预水平下细胞的总蛋白，设计针对SLC35F3和GPT基因编码蛋白的特异性抗体，采用蛋白印迹（western-blot，WB）的方法观察特异蛋白的表达情况；4.将不同时间-浓度乙醇干预水平下的细胞消化后，接种到无菌玻璃片上，采用特异性抗体免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）的方法观察各SLC35F3和GPT特异蛋白在不同细胞株中的表达部位以及表达量变化。细胞实验均采取叁次重复，计量指标采用平均值±标准差（mean±standard deviation [SD]）表示。组间比较统计学方法使用遵循以下原则：如数据符合正态分布，则比较选用方差分析（one-way ANOVA）;如数据不符合正态分布，则比较选用非参数检验（Mann-Whitney U test）。除非特殊说明，P<0.05被认为是有显着统计学差异。结果：我们检测了不同时间-浓度乙醇干预浓度下BEL-7402和MHCC-97H两株细胞的上清液分泌值，SLC35F3，GPT两基因表达，编码蛋白表达情况。具体结果如下：1. BEL-7402ALT达峰时间稳定在6小时，而MHCC-97H ALT达峰时间由100mmol/l乙醇干预下的12小时，缩短至200mmol/l乙醇干预下的3小时。不同浓度酒精干预下，BEL-7402的ALT峰值水平差别无统计学显着性（P>0.05），MHCC-97H的ALT峰值水平随着乙醇干预浓度的加大而升高，差别有统计学显着性（P<0.05）；2.不同时间-浓度乙醇干预下BEL-7402和MHCC-97H的SLC35F3及GPT基因表达水平存在差异。BEL-7402的SLC35F3基因和GPT基因分别在12小时和6小时达到峰值，相对稳定，且随乙醇暴露浓度的增加峰值水平变化不大,差别无统计学显着性（P>0.05）。而MHCC-97H的SLC35F3基因和GPT基因表达水平的达峰时间和峰值表达水平随着不同干预浓度的变化较大，其达峰时间从50mmol/l乙醇暴露下的24小时，提前到200mmol/l乙醇暴露下的3小时。峰值水平随着乙醇暴露浓度的升高而升高，差异有统计学显着性（P<0.05）。3.蛋白印迹半定量结果显示：BEL-7402SLC35F3和GPT基因编码蛋白表达达峰时间稳定在12小时和6小时，而MHCC-97H SLC35F3和GPT基因编码蛋白表达达峰时间随着乙醇暴露浓度的增加而提前，由200mmol/l乙醇暴露下SLC35F3和GPT编码蛋白表达水平高于相应的50mmol/l和100mmol/l乙醇干预浓度下的表达水平（P<0.05）。免疫组化结果与蛋白印迹观察结果一致。结论：在应激环境下，基础高表达SLC35F3基因的BEL-7402表现出在体外环境下表现出比低表达SLC35F3基因的MHCC-97H细胞株更强的自身稳定性和对乙醇的低度易感性，及其更小的损伤。SLC35F3基因的基础表达水平可能与乙醇干预下肝细胞自身调节及ALT代谢机制有关。在基础状态下SLC35F3基因的高表达有利于在应对乙醇刺激时，降低乙醇损伤的易感性，减轻乙醇所致的肝脏损伤。(本文来源于《广西医科大学》期刊2014-05-01）
温泉[5]（2014）在《L-精氨酸激活离体永生化肝细胞LO_2内源凝血八因子外源表达机制及信号通路的研究》一文中研究指出目的利用L-精氨酸加入人离体肝细胞L02培养基中，使得L02中内源凝血因子VIII（coagulation factor VIII,FVIII）重新表达，进而研究L-精氨酸激活L02中内源FVIII重表达的调控机制和信号通路。方法将L02分为加药组，对照组，抑制剂组和空白抑制剂组，加药组加入L-精氨酸（终浓度为15mM）,对照组用同体积的灭菌水取代L-精氨酸培养，抑制剂组在加入L-精氨酸前3小时加入L-NAME（终浓度为100mM），空白抑制剂组则只加入终浓度为100mM的L-NAME,分别培养12h、24h、36h、48h和60h。用RT-PCR方法检测L02中人FVIII基因、iNOS基因、HNF1A基因、HNF4A基因、C/EBP alpha基因、NF-kappaB基因、I-kappaB alpha基因、CREB基因和sGC alpha3基因的转录水平，Western blot检测L02中人FVIII、常规I-kappaB和磷酸化I-kappaB的表达情况，PKA磷酸化检测试剂盒检测实验体系中PKA磷酸化变化水平，双虫荧光素酶（dual luciferase）实验检测FVIII启动子上游调控序列的转录活性，MSP (methylation special pcr)实验检测FVIII启动子上游调控序列的甲基化水平。结果RT-PCR显示，加药组L02中人FVIIImRNA的转录，对照组、抑制剂组和空白抑制剂组均无人FVIIImRNA的转录，加药组iNOS、HNF4A、NF-kappaB、I-kappaB alpha和CREB的转录水平均有上升，HNF1A、sGC alpha3和C/EBP alpha转录水平均下降，对照组、抑制剂组和空白抑制剂组这些基因转录水平均无明显变化;Western blot显示加入L-精氨酸后，磷酸化I-kappaB表达量明显增加，其他组别则无此变化； PKA检测试剂盒显示加药组PKA磷酸化水平明显增加，其他组别无明显变化；双虫荧光素酶实验显示加药组人FVIII启动子上游调控序列的转录活性明显增加；MSP实验显示FVIII启动子上游调控序列的甲基化水平发生明显降低，去甲基化水平明显增加。结论L-精氨酸一方面通过NO-cGMP-PKG信号通路进而激活MAPK信号通路，导致人FVIII基因启动子上游调控相关的转录因子表达发生变化从而激活人离体肝细胞中内源人FVIII的表达，另一方面L-精氨酸通过NO胁迫诱导人FVIII基因启动子上游调控序列的去甲基化从而激活下游人FVIII的表达。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2014-05-01）
宫绪萌[6]（2014）在《永生化HepGL肝细胞移植救治大鼠急性肝衰竭模型的实验研究》一文中研究指出研究背景：我国是肝炎大国,每年死于肝衰竭的患者约有40万人。肝衰竭的内科治疗效果较差,在原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)临床应用以前,肝衰竭的的存活率<20%。目前,国外文献报道经有效治疗的肝衰竭患者的存活率>65%。但国内肝衰竭患者的预后仍很不理想。OLT治疗肝衰竭的效果理想而肯定,是目前治疗急性肝衰竭、终末期肝病和代谢性肝病的主要方法。但由于供体短缺、免疫排斥及高额的手术治疗费用严重限制其应用于临床,许多患者在等待中死亡。目前治疗肝衰竭的新兴方法还有人工肝支持系统、肝细胞移植、异种器官移植等。其中肝细胞移植由于其众多的优点,已被认为是最具前景的AHF治疗方法之一。肝细胞移植相较于原位肝移植具有以下优点：①相对OLT巨大的手术创伤而言,对患者的创伤性损害较小,尤其是已经不能耐受手术的肝功能极差的患者,同时也可以避免OLT所引起的急性血管排斥反应；②操作方法简单,目前主要采用门静脉注入方式,其他还有脾内注射,大网膜种植等移植方法；③手术费用低,是全肝移植费用的5%-10%；④分离的肝细胞可以保存,所以可以是随时的、多次重复的用于肝衰竭病人的治疗；⑤分离一次可以用于多个肝衰竭患者的治疗,即一对多的治疗；⑥肝细胞移植可保证患者肝脏结构的完整性,急性肝衰竭患者的肝脏可渡过危险期,通过再生使其自身功能的恢复；⑦可对移植的肝细胞进行基因修饰。目前正在研究可供移植的肝细胞有多种,如异种肝细胞、人体干细胞和原代肝细胞移植。异种移植利用猪和狒狒等灵长类动物肝脏作为细胞来源,具有来源丰富,繁育方便,价格较低等优点。但异种移植带来的免疫排斥反应、生理生化兼容性及潜在的病原体传播的风险阻碍了其在临床中的应用。限于动物种系选择、病原体传播及伦理等方面,异种肝细胞移植较其他两种移植有较大的风险。干细胞具有自我更新和分化能力,分有胚胎肝细胞、胎儿干细胞和成人干细胞。源于胚胎和胎儿的干细胞受到政治法律和伦理道德的限制,即使具有功能良好和免疫排斥少等优势也未能大规模展开应用。研究证明人体肝脏祖细胞能修复受损肝脏并使肝脏再增殖,但移植后细胞难以跟踪证明是否能使肝脏完全再生。另有骨髓干细胞和脂肪间充质干细胞具有细胞融合和多向分化能力,成为细胞移植研究热点。肝细胞移植是由Bumgardner率先提出,而世界第一例人体肝细胞移植临床应用是Mito于1992年分离慢性肝病患者自身肝细胞并进行自体移植,证明人肝细胞有修复急性肝损伤的能力,可在一定条件下重建衰竭肝脏。同时有文献报道表明有急性肝衰竭患者接受人肝细胞移植,移植后血氨和胆红素水平降低,并且部分患者肝功能完全恢复。肝细胞移植作为新的治疗AHF手段前景诱人,但还需要克服的问题仍很多。如肝细胞移植后引发的免疫排斥反应就是一个重要问题,将移植肝细胞进行微囊包裹,或者从肝脏实质细胞中去除抗原递呈细胞可以降低肝细胞免疫源性,或者封闭抗原递呈细胞的T细胞共刺激分子(B7蛋白)也可以调控免疫源性,这些都是解决免疫问题的措施。如何解决免疫排斥反应是肝细胞移植应用的重点,但如何提供足够数量、功能良好肝细胞更是决定肝细胞移植能否广泛应用的关键。相比全肝移植,肝细胞易于保存和运输,若能解决肝细胞的来源问题,肝细胞移植将来可在临床上得到的广泛应用。研究目的：本实验通过向SD大鼠脾内注射移植永生化HepGL肝细胞,对急性肝衰竭的大鼠模型进行救治,研究永生化HepGL肝细胞在动物体内的功能,探讨其是否具有替代并重建衰竭肝脏的能力。同时为其将来作为生物人工肝的种子细胞的应用奠定理论基础。实验方法：1.SD大鼠急性肝衰竭(Acute Hepatic Failure, AHF)模型的建立；采用90%肝部分切除术建立SD大鼠AHF模型,具体步骤如下：(1)术前准备包括,术前SD大鼠禁食6h,改喂饮10%葡萄糖水；手术器械高压灭菌；药物(硫酸阿托品、乙醚、青霉素钠等),耗材(5-0丝线、纱布、棉球、棉签、一次性使用注射器等)等的准备；(2)术前准备完成后,将大鼠用乙醚麻醉,待大鼠麻醉后,将其固定于自制手术台上,肌注阿托品0.03mmg(配成0.5ml盐水溶液),并用50ml离心管内放入浸湿了的无水乙醚的棉球,将管口对准大鼠口鼻,持续吸入麻醉,麻醉深度的调节以大鼠停止躁动,呼吸平稳为准；(3)一切就绪后,备皮刀刮毛、腹部常规3次消毒、铺无菌洞巾；(4)选择腹部横切口入腹,以剪刀剪开皮肤、肌肉及腹膜各层,以自制拉钩充分暴露肝脏,解剖各肝叶间及与周围组织之间的菲薄韧带；(5)依次游离出各肝叶后,在右上叶(Right superior lobe,RSL)与肝中叶(Median lobe,ML)之间,游离出肝脏的Glisson系统头支主干,以5-0丝线穿过结扎,可见肝中叶(ML)、左外叶(Left lateral lobe,LLL)迅速缺血,待肝叶变为土黄色后,5-0丝线结扎相应肝叶的肝蒂后并切除；游离出右上叶(RSL)与右下叶(Right inferior lobe,RIL)的共同Glisson系统右支主干,5-0丝线结扎后同上依次切除右上叶与右下叶；仅保留包括前叶(Superior caudate lobe,SCL)与后叶(Inferior caudate lobe,ICL)的尾状叶(Caudate lobe,CL)及腔静脉旁部(paracaval liver,PL)(约占肝脏总量的10%)。检查腹腔内无出血后,于腹腔内注射青霉素20万单位溶液lml,依次缝合腹膜、肌层和皮肤,缝合皮肤前停止乙醚麻醉；(6)术后普通块料喂养,喂饮10%葡萄糖水,室温18～22℃,光照12h/d。2.永生化HepGL肝细胞移植；(1)实验分组：实验组(n=21)—脾内注射约2.5*107个永生化HepGL肝细胞(配成0.5mlDMEM混悬液)/只；空白组(n=21)—未做任何治疗的急性肝衰竭组；(2)实验组永生化HepGL肝细胞移植步骤：SD大鼠腹部行约1cm纵切口,用无菌棉签伸入胃下提出脾脏,2.5*107个永生化HepGL肝细胞(配成0.5mlDMEM混悬液)大鼠脾内注射,注射24h后SD大鼠行90%肝部分切除术。3.观察项目；(1)大体观察：观察空白组及实验组SD大鼠术后的饮食、精神状态、活动量及对外界刺激反应及相关的症状表现等情况。(2)存活率：记录大鼠的死亡时间。(3)生化检查：收集Oh、24h、72h、7d、14d大鼠的静脉血,检测肝功能指标包括：①谷丙转氨酶(ALT)、②总胆红素(Tbil)、③白蛋白(ALB)、④血氨(NH3)、⑤血糖(Glu)、⑥凝血时间(PT)等的变化。(4)病理组织检查：在24h、72h、7d、14d取大鼠肝脏及脾脏做组织病理切片及免疫组化,以了解大鼠肝脏急性肝衰竭病理变化、恢复情况以及移植的HepGL细胞在大鼠体内的存活的情况。实验结果：1.大体观察实验组与空白组SD大鼠均在术后3-10min内即可苏醒翻身爬起,空白组大鼠12h后出现急性肝衰竭症状,包括精神萎靡,拒饮食,对外界反应迟钝,全身蜷缩,鼠毛竖立,尿色发黄、腹泻,口鼻眼角出血等,大部分个体开始逐渐出现肝昏迷直至死亡。实验组大鼠12h后也有精神萎靡,食欲下降,对外界反应迟钝,全身蜷缩,鼠毛竖立等症状,但程度较轻,且无口鼻眼角出血等症状,也有部分个体出现肝昏迷并死亡,部分个体尸解可见腹腔内有较清澈的腹水。2.存活率观察两组术后7d存活率,实验组7d存活率66.67%(14/21),死亡时间点分别为15h、35h、41h、45h、60h、62h;空白组7d存活率为28.57%(6/21),死亡时间点分别为16h、21h、23h、26h、32h、35h、38h、38h、41h、42h、50h、54h、60h、63h、70h,两组死亡基本全部发生在3d内,大鼠存活超过3d,便可长期存活。3.生化检查两组大鼠术后各生化指标均有明显变化,两组ALT、Tbil、NH3、PT等四项指标均在术后24h上升到最高值,且四项指标两组之间均存在差异(P<0.05),后逐渐恢复；两组ALT、Tbil指标72h也存在明显差异(P<0.05),在7d、14d点基本持平；两组PT仅在24h有明显差异；两组ALB、Glu术后均出现下降,ALB指标空白组在7d出现最低值,而实验组在72h出现最低值,两组在24h、72h、7d各点均有明显差异(P<0.05); Glu指标两组均在24h出现最低值,在72h有明显差异(P<0.05)。4.病理组织检查空白组大鼠术后24h时见残余肝脏大体组织色泽淡黄,包膜肿胀,质地松软,触之易碎,镜下可见空泡变性和炎细胞浸润；72h时残余肝脏较前增大,边缘可见血管增生,镜下可见弥漫大量空泡变性和炎细胞浸润,肝小叶结构破坏。实验组大鼠注射后24h时,脾脏红肿,呈鲜红色,术后肝脏病理表现同空白组,脾脏可见表面有斑点状突起。免疫组化可见细胞在脾脏内成团聚集,在肝脏内主要停留在肝血管窦部。实验结论：实验组大鼠生存质量以及存活率明显优于空白组,两组生化指标在一定时间点存在明显差异,组织病理发现实验组大鼠体内存在移植的永生化HepGL肝细胞；说明永生化HepGL肝细胞在动物体内具备一定的生物学功能,能一定程度的替代部分肝功能,可作为生物人工肝的种子细胞研究使用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-03-01）
杨英[7]（2014）在《冻存人源永生化肝细胞微囊用于生物人工肝治疗的研究》一文中研究指出背景每年因肝脏疾病死亡的人数呈现持续增加趋势。人工肝作为治疗肝衰竭的有效手段成为近些年的研究热点,其目标为帮助病患等待适宜的供体器官或自体肝再生。我国在非生物型人工肝支持系统领域已经取得较大进步,但生物型人工肝系统的研究与国外发达国家相比尚有差距。目的本课题组拟选择功能最佳的人源性永生化肝细胞制作微囊,以大规模于液氮中冻存后,在新型生物人工肝支持系统中检测肝衰竭病人血浆对肝细胞的毒性作用以及肝细胞对肝衰竭病人血浆的清除效果,为生物型人工肝的临床试验奠定基础。方法1.永生化人源肝细胞的功能评价。利用MTT、实时定量PCR、免疫荧光和Western blot及ELISA等检测增殖及功能。2.将反应器流化培养的永生化肝细胞系微囊与静态培养肝细胞系微囊、二维培养肝细胞作对比,比较细胞中与功能相关Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特异性核受体基因、CYP450蛋白表达的变化。检测肝细胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成确定冻存条件、冻存时间以及复苏孵育条件并且评价微囊化肝细胞大规模冻存效果。3.体外初步评价生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血浆,将复苏并孵育后的肝细胞微囊加入到肝衰竭病人血浆中培养24h,观察肝衰竭病人血浆对微囊内肝细胞活性和功能的影响以及肝衰竭病人血浆内重要物质成分的变化。结果1HepLi3细胞增殖能力最好,可以进行大规模的培养,获得高数量的细胞,而且其在功能上明显优于其他永生化肝细胞。2.微囊化和流化培养的肝细胞在培养过程中保持很好的活性；微囊化的培养方式可以促进肝细胞特异基因及蛋白的表达；此种培养方式可能是通过抑制细胞内磷酸激酶活性来提高肝细胞特异性功能的。3.确定微囊制作完成孵育2h后进行冻存操作；冻存复苏后孵育2h,其功能可恢复很好,且将体积扩大到50毫升不会影响肝细胞的冻存后的功能。4.肝衰竭病人血浆造成肝细胞活率下降12%,但不影响其作为种子细胞的应用。而且微囊化肝细胞系可以改变肝衰竭病人血浆中物质成分,促进其体内内环境的稳定,为其临床应用奠定基础。结论1.本实验室制作的HepLi3可作为生物人工肝的种子细胞有效发挥肝特异性功能。2.确定了微囊的制作,肝细胞冻存及复苏的条件,并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促进肝细胞功能的原因。3.大规模冻存微囊化肝细胞后,细胞活性保持良好,可以为生物人工肝提供种子细胞库。4.利用肝衰竭病人血浆及生物反应器证明冻存后的微囊化肝细胞可降低重肝血浆中的谷丙转氨酶和直接胆红素。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-01-01）
李爱民,邓丽娟,王泽楠,刘思德,聂玉强[8]（2013）在《基于PiggyBac转座子的肝细胞永生化载体的构建》一文中研究指出目的构建基于PiggyBac转座子的无病毒参与的肝细胞永生化载体,并在HL-7702细胞中初步应用及验证,为进一步构建新型人源性永生化肝细胞株提供实验基础。方法通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建基于PiggyBac的肝细胞永生化载体PB hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo;将永生化载体与辅助载体pCAGG-PBase共转染HL-7702细胞,药物筛选构建稳转细胞株;(本文来源于《中华医学会第十六次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编》期刊2013-06-20）
潘小平[9]（2013）在《永生化人肝星状细胞系的建立及其对肝细胞功能与肝祖细胞分化的影响》一文中研究指出研究背景各种原因引起的肝衰竭病死率高达70%～80%。以肝细胞为生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver, BAL)成为肝衰竭治疗研究的热点和发展方向。基于原代人肝细胞、原代猪肝细胞、C3A肝肿瘤细胞的叁种类型肝细胞的BAL临床试验治疗显示,BAL具有很好的疗效和应用前景。但是,肝细胞源的短缺等问题,依然阻碍着BAL的临床应用和发展。肝脏干细胞可诱导分化为功能成熟的肝细胞,被认为是非常有前景的细胞源。目前,肝脏干细胞在体外诱导分化是受到多种因素影响和调控,分化后的肝细胞尚难达到生物人工肝临床治疗的数量。因此,需要进一步探索肝脏干细胞的规模化培养和诱导分化的新方式和新方法。肝细胞永生化是解决肝细胞来源困难的重要可行性途径之一。然而,永生化人肝细胞的基因表达和细胞功能,与原代人肝细胞功能存在一定的差异。因此,必须在解决肝细胞数量的同时,需要进一步提高永生化人肝细胞的分化程度和细胞功能。细胞与细胞间相互作用在保持和促进细胞功能中起着非常重要作用。在各种共培养体系中,肝细胞与肝非实质细胞之间的相互作用为肝细胞生长提供了微环境,有助于肝细胞保持其结构稳定和细胞功能。肝星状细胞是肝脏中非常重要的非实质细胞。然而,原代肝星状细胞存在着分离繁琐,分离成本较高,容易失去生物学特性和功能等问题。综上所述,我们从以下几个方面进行研究,建立高活性和功能的永生化人肝星状细胞系,探索永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对肝细胞功能的影响,以及探索永生化人肝星状细胞对肝祖细胞向肝细胞分化的影响。为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境和建立肝祖细胞向肝细胞分化的新方法提供实验依据,将为生物型人工肝提供更高质量的肝细胞奠定基础。第一部分永生化人肝星状细胞系的建立及其鉴定目的：建立高活性和功能的永生化人肝星状细胞系,为肝非实质细胞与肝细胞、肝祖细胞共培养研究提供理想的细胞模型。方法：采用SV40LT重组反转录病毒感染原代人肝星状细胞,获得永生化人肝星状细胞系。采用电镜技术、RT-PCR等分析永生化人肝星状细胞的形态学、生物学特性和功能等。结果：建立一株永生化人肝星状细胞系,命名为HSC-Li。该细胞系具有典型的肝星状细胞形态学特征；HSC-Li细胞的Ⅰ、Ⅱ型胶原、HGF等mRNA表达为阳性；HSC-Li细胞的a-SMA、Vimentin、GFAP和SV40LT蛋白表达为阳性。HSC-Li细胞分泌VEGF、HGF、IL-6、TGF-betal等多种细胞因子和炎症因子。结论：建立了一株永生化人肝星状细胞系HSC-Li,该细胞系具有人肝星状细胞的生物学特性和功能；可为肝细胞与肝星状细胞、肝祖细胞与肝星状细胞共培养研究提供理想的细胞模型。第二部分永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对肝细胞功能的影响目的：探索永生化人肝星状细胞与永生化人肝细胞共培养对永生化人肝细胞功能的影响；为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境提供实验依据。方法：首先采用SV40LT重组反转录病毒感染原代人肝细胞,获得一株永生化人肝细胞系；通过直接接触共培养、间接接触共培养方式进行永生化人肝细胞与永生化人肝星状细胞共培养研究,测定永生化人肝细胞共培养24h、48h、72h后ALB、 CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因的表达水平,以及测定CYP1A2活力。结果：建立了一株永生化人肝细胞系HepLi5,HepLi5细胞的ALB、GS、CYP2E1、 CYP3A5等基因的mRNA表达均为阳性,具有分泌白蛋白等原代人肝细胞的生物学特性和功能。HSC-Li细胞与HepLi5细胞直接接触和间接接触共培养研究结果显示,HepLi5细胞在共培养24h、48h、72h后ALB、CYP3A5、CYP2E1、UGT2b7等基因表达显着增强,以及CYP1A2活力显着增强。与单独培养组相比较,直接接触共培养方式和间接接触共培养方式均显着增强肝细胞基因表达和功能。结论：建立了一株永生化人肝细胞系HepLi5,HepLi5细胞具有分泌白蛋白等原代人肝细胞的生物学特性和功能。直接接触共培养和间接接触共培养方式均可显着增强HepLi5细胞的基因表达和细胞功能。为优化和完善永生化人肝细胞培养的微环境提供实验依据,将为生物型人工肝提供更高质量的肝细胞奠定基础。第叁部分永生化人肝星状细胞对肝祖细胞向肝细胞分化的影响目的：探索永生化人肝星状细胞对肝祖细胞BMEL-TAT分化为肝细胞的影响；为建立肝祖细胞向肝细胞分化的新方法提供实验依据。方法：通过永生化人肝星状细胞与肝祖细胞间接接触共培养方式诱导肝祖细胞分化为肝细胞,检测肝祖细胞BMEL-TAT共培养前、后细胞表型和功能。结果：HSC-Li星状细胞与肝祖细胞BMEL-TAT间接接触共培养方式可以诱导肝祖细胞分化为功能成熟的肝细胞。以单独培养BMEL-TAT细胞作为对照,与HSC-Li细胞共培养3天后,BMEL-TAT细胞在细胞形态上开始向肝样细胞转变；与HSC-Li细胞共培养7、14、21天后,BMEL-TAT细胞的ALB、CK18、TAT、G6P等基因表达逐渐增强；细胞免疫荧光染色显示：共培养21天后BMEL-TAT细胞的ALB、CK18表达显着增强,CK19、AFP表达下降。共培养21天后BMEL-TAT细胞的X-gal染色、PAS染色和Dil-LDL吸收实验均为阳性,以及CYP1A2活力和尿素合成也显着增强。结论：建立了肝祖细胞向肝细胞分化的新方法；永生化人肝星状细胞与肝祖细胞间接接触共培养方式可以诱导肝祖细胞BMEL-TAT向肝细胞分化；可为生物型人工肝提供新型、高质量的肝细胞奠定基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2013-02-01）
宋修光[10]（2012）在《1.3倍乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达》一文中研究指出研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是嗜肝DNA病毒属的一员。HBV可以引起肝脏的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中3.5亿以上为慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易彻底治愈,并且具有发展成肝硬化、肝癌的高度危险性。慢性乙型肝炎(CHB)是一个严重的公共卫生问题,每年全世界范围内约有一百万人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。我国约有超过50%的居民曾被乙型肝炎病毒感染过,其中8%-15%的人成为慢性感染者。慢性乙型肝炎(CHB)治疗的目标是要实现的持续抑制HBV的复制,缓解肝脏疾病。乙型肝炎的治疗取决于几个因素,如疾病的阶段,“e”抗原的存在或缺失、耐药性、特别是在肝脏慢性疾病的终末期后期无有效药物治疗。因此,在治疗时机的选择及治疗过程中对以上因素的评价是非常重要的。干扰素a-2a(IFN2a)和干扰素α-2b干扰素(IFN2b)作为首选的治疗CHB已使用多年,治疗的目标是HBeAg血清转换,以激活免疫反应,改变免疫状态,目的是清除乙肝病毒DNA (HBVDNA)缓解疾病。然而,治疗费用昂贵且有许多副作用,如贫血、血红蛋白下降、恶心、呕吐,出冷汗等。而且仅约1/3患者用α-干扰素治疗持续应答。此外,核苷类似物不能完全消除病毒,并可能导致病毒基因突变。因此,开发新的抗病毒治疗药物仍然是一个重大的科研任务。但由于缺乏合适的HBV感染细胞模型或小动物模型来评价新的治疗策略而使CHB的治疗受到阻碍。目前,HepG2.2.15细胞系是最常用的体外研究HBV的细胞模型,HepG2.2.15细胞系作为公认的HBV全基因稳定表达细胞系,能支持HBV的复制,分泌感染性病毒颗粒。但因病毒基因以较为固定的拷贝数整合于宿主细胞染色体,表达水平低,其作为体外HBV感染细胞模型,尤其是作为抗病毒药物筛选和研究耐药突变株生物学特征的感染模型,受到了一定的局限。目前仍然迫切需要建立一个体外细胞培养或试验动物模型来帮助我们理解HBV感染中病毒-宿主相互作用,确定病毒突变体的致病性,检测新的抗病毒药物和对慢性感染治疗方法的选择。应用病毒基因的转导使细胞永生化是建立连续传代细胞系的一种方法。将SV40早期转录区基因导入细胞内是最常用的细胞永生化的方法,几乎适用于各种人类细胞类型。通过对SV40T基因介导的永生化细胞系的深入研究,多数研究结果显示SV40T基因的导入除提高转化细胞的生长速率外,能保留其原始细胞的许多分化表型,而非原始基因的表达很少见,在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性,可作为体外研究的模型。1.3拷贝HBVDNA质粒含HBV完整复制体,基因组小于2.0拷贝,且复制和表达效率高于1.2和1.1拷贝,包含了HBV5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ,复制起始区(DR1、DR2)、前基因组转录起始位点x和前C区启动子,x开放读码框等,所以应用的最多。本研究的目的是构建SV40T永生化小鼠肝细胞系,观察1.3倍全基因HBV真核细胞表达质粒(pHBV1.3)在其细胞中的表达。希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。第一部分SV40T永生化小鼠肝细胞系的建立[目的]建立SV40T永生化小鼠肝细胞系,以作为后续实验研究的基础。[方法]1、建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。1.1、原代小鼠肝细胞的分离与培养。1.2、SV40T基因质粒(pRSV-T)扩增及抽提。1.3、利用脂质体lipofectamine2000介导pRSV-T质粒转染原代培养小鼠肝细胞。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系的检测。2.1、SV40T抗原检测：通过间接免疫荧光法检测SV40T抗原在小鼠肝细胞内的分布情况。2.2、形态学观察：在倒置相差显微镜下观察原代鼠肝细胞和SV40LT抗原永生化小鼠肝细胞的形态,同时在电子显微镜下对两种细胞进行超微结构观察。2.3、绘制原代及SV40T永生化小鼠肝细胞生长曲线,了解细胞生长周期。2.4、生化检测：测定原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)的含量。2.5、RT-PCR检测肝细胞系中ALB-mRNA的表达。2.6、免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞CK-18的免疫反应性。[结果]1、原代小鼠肝细胞的培养和转染：直接胶原酶消化法分离的肝细胞培养后,倒置相差显微镜下原代小鼠肝细胞形态扁平、呈多边形、通常多个细胞成串簇状排列,细胞呈单层贴壁、铺满瓶底。原代培养小鼠肝细胞经脂质体转染SV40L T抗原和50μ g/ml氨苄青霉素(Amp)筛选,于转染后30天出现一明显的上皮细胞样抗Amp的阳性克隆细胞。其余脂质体组和空白对照组细胞已大多死亡。2、SV40T抗原检测：转染后SV40T抗原免疫荧光逐渐增强,至转染后30天时可见明显荧光。胞浆内呈磨砂样荧光,细胞核内呈颗粒状荧光。3、转染肝细胞形态：原代及转染小鼠肝细胞均呈单层贴壁生长,形态呈上皮细胞样,原代小鼠细胞增殖缓慢,传代一次需7-9d。永生化小鼠肝细胞增殖明显比原代快,传代一次只需4-5d。在电子显微镜下,转染肝细胞与正常原代培养小鼠肝细胞相比无明显差异,呈典型的肝细胞形态与结构,细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见；细胞膜外可见典型的微状突起物；正在进行分裂的双核仁细胞体现了转染肝细胞体外增殖分化的过程。4、细胞生长曲线：在含10%的胎牛血清培养基中原代小鼠肝细胞生长缓慢,原代小鼠肝细胞在接种后第7天细胞增殖减缓。第8天开始出现细胞死亡。转化后的细胞于接种后第3-4日起增殖减缓,第5天开始出现细胞死亡。5、生化检测：原代及SV40T永生化小鼠肝细胞培养液上清液中ALT、AST、AFP的含量变化差异无显着性(P>O.05)。6、RT-PCR检测转染肝细胞中ALB mRNA的表达：对原代和转染小鼠肝细胞进行总RNA抽提和一步法RT-PCR扩增ALB-mRNA,结果2个标本在475bp处均出现明亮条带,表明转染肝细胞具有表达ALB mRNA的能力。7、Wostern blot检测原代、转染小鼠肝细胞角蛋白18(CK-18)免疫反应性：对原代、转染小鼠肝细胞进行蛋白质提取,经SDS-PAGE、Western blot检测,目的条带细胞CK-18显色均呈阳性,表明原代、转染肝细胞均具有CK-18免疫反应性。[结论]1、pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。2、SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态、生长特性及功能,且在体外可以传代培养。可以进一步用来研究建立适宜于HBV感染的细胞模型。到目前为止,经过了五年多的冻存复苏和传代培养,SV40T永生化小鼠肝细胞已经传代50代次,传代、复苏和冻存不改变细胞的形态及增殖能力,细胞形态和生长特性没有明显改变。第二部分pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达[目的]观察pHBV1.3质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞系的表达,希望能建立一种新型的HBV体外细胞模型。[方法]1、pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系：按脂质体转染试剂盒lipofectamine2000说明将pHBV1.3质粒转染SV40T永生化小鼠肝细胞系22代。2、pHBV1.3质粒在永生化小鼠肝细胞中的表达2.1、HBsAg及HBeAg的检测：用Abbott的AXSYM自动免疫分析仪及其配套的微粒子酶免分析法(MEIA)诊断试剂盒对转染细胞上清液进行HBsAg、HBeAg检测。2.2、间接免疫荧光检测细胞内HBsAg、HBcAg的表达：将SV40T永生化鼠肝细胞系22代细胞接种于24孔板,转染后24、48、72h用PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定,按试剂盒说明进行免疫荧光检测,兔抗一HBc以1：500稀释,鼠抗一HBs1：50稀释。2.3、Southern blot:提取转染后72h细胞内总DNA并纯化。将纯化的DNA样本点样于1%琼脂糖凝胶上电泳后,转移至硝酸纤维素膜上与地高辛标记的3.2KB全长HBVDNA探针杂交。地高辛标记及Southern试剂盒购于罗氏,方法按说明进行。2.4、透射电镜检测pHBVl.3质粒转染小鼠肝细胞培养液中HBV病毒颗粒：收集转染后72小时培养上清液,280000×g,4℃超速离心5小时弃去上清,沉淀用100μ L TN缓冲液溶解混匀。滴于有支持膜(0.3%Formvar)的铜网上,2%磷钨酸负染2分钟,室温中干燥30分钟,JEOL透射电镜(JEM-1200EX Electron Microscope)观察,拍照。[结果]1、转染24h后,细胞上清液中可检出HBsAg、HBeAg,72h达到高峰,96h呈下降趋势。转染细胞传代后细胞上清液中HBsAg、HBeAg呈下降趋势。传代至第4代时HBsAg、HBeAg均为阴性。2、转染24小时后,有HBsAg和HBcAg阳性细胞出现,72h细胞表达最强。HBsAg主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。3、Southern杂交检测转染细胞内HBVDNA的复制：转染后72h,转染细胞中存在3.5KB、2.4KB、2.1KB病毒复制中间体。4、电镜结果：收集转染后72小时细胞培养上清,超速离心后,沉淀用2%磷钨酸负染,JEM-1200EX透射电镜观察。电镜下可以见到少量直径42nm的双层壳状Dane颗粒和较多的直径22nm的小球型颗粒及少量丝状颗粒。[结论]经SV40T抗原转染的小鼠肝细胞系可以被pHBV1.3质粒二次转染,转染后HBV可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成病毒复制中间体。并且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、 HBeAg和HBcAg; pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。总结本研究结果证实,pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态和生长特性,且在体外可以传代培养。且可以被pHBVl.3质粒二次转染,转染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒复制中间体,且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。SV40T永生化小鼠肝细胞可以作为一个新型的适宜于HBV瞬时转染的细胞模型,为体外抗病毒药物筛选提供新的细胞模型。观察了HBVDNA在小鼠肝细胞内的复制情况,为建立人HBVDNA转染跨种属肝细胞模型奠定基础。(本文来源于《山东大学》期刊2012-05-20）
永生化肝细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的对新型永生化人肝细胞系Hep ZJ进行安全性研究。方法获取Hep ZJ培养上清液,通过PCR联合琼脂糖凝胶电泳法进行支原体检测,通过显色基质法进行内毒素检测;将Hep ZJ细胞悬液经尾iv进入SD大鼠后观察其生存情况并于不同时间点进行剖检,通实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法分析该细胞系的生物分布;将Hep ZJ细胞悬液sc进入BALB/c-nu裸鼠后分析其致瘤性。结果 Hep ZJ支原体检测电泳图未见阳性条带;内毒素检测浓度<2 EU/m L;SD大鼠尾iv Hep ZJ后生存情况良好,血液、肺脏、脾脏在不同时间点出现不同程度的GAPDH-Human和TERT-Human基因表达,血液中12 h后、肺脏和脾脏中1周后基本被清除,剖检过程中未见肿块形成;裸鼠sc Hep ZJ后无硬性肿物形成。结论新型永生化人肝细胞系Hep ZJ无支原体、细菌污染,进入体内后无明显副反应及致瘤性,具备应用安全性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
永生化肝细胞论文参考文献
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