导读:本文包含了食品级酵母表达系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:食品级酵母表达系统,分泌,展示表达,GAL1基因,GAL4基因
食品级酵母表达系统论文文献综述
郭钦[1]（2009）在《食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建》一文中研究指出基因工程酵母菌在食品工业中的应用逐渐普遍,但重组菌抗生素抗性标记的存在对食品安全具有潜在隐患。此外,较低的生产成本、简单方便的下游操作技术和高水平的表达量等是工业大规模生产重组蛋白必须具备的特点。针对这些问题,本课题根据半乳糖-葡萄糖对GAL基因家族诱导-抑制效应以及GAL4p对GAL基因的调控机制,采用同源重组技术分步敲除了工业多倍体酿酒酵母MS-1染色体上的GAL1基因,并将GAL4基因整合到GALl基因位点,构建了不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115.DPG65和GQ21。同时,选用α-半乳糖苷酶作为食品级选择标记、β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为报告基因构建了在GALl启动子和MFαl信号肽控制指导下的食品级分泌表达载体YGMPA-PM:并以α-凝集素C-端320个氨基酸为锚定序列,构建了能够展示表达p-1,3-1,4-葡聚糖酶的食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将构建的载体和不同GAL基因型的重组酵母相结合,得到了适合工业化生产的食品级高效分泌表达系统和食品级高效展示表达系统。主要研究结果如下：扩增了GAL4结构基因全长序列,并构建了包含GAL4基因+KanMX表达盒的模板质粒PMD18-TGK.通过同源重组以GAL4+KanMX表达盒替换了工业叁倍体酵母MS-1的叁个等位的GALl基因中的一个,得到具有双GAL4的重组酵母。以KanMX为敲除框架,敲除了MS-l染色体上的一个GALl基因。利用LFH原理,设计了另外两套基因敲除框架KanMX+GALls和GALlt+KanMX,依次敲除了双GAL4重组菌株染色体上剩余的两个GALl等位基因。考虑到重组菌株应用的安全性,利用Cre/loxP系统切除了构建重组酿酒酵母菌株时使用的KanMX抗性表达盒,并通过传代使Zeocin抗性质粒pSH47/ZEO丢失,得到不同GAL基因型的重组酵母SGl、DG115.DPG65和GQ21。其中,重组菌株GQ21染色体上叁个GALl基因全部缺失,且其中一个GALl基因位点被整合了一个GAL4基因拷贝。对不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21在含有不同碳源的培养基中的生长、发酵性能以及抗性和遗传稳定性进行了测试。结果表明,重组酵母的GAL基因型在传代过程中保持稳定,没有发生回复突变且抗性基因已经被彻底删除。GALl基因的缺失对重组菌株对葡萄糖的利用有轻微地影响。不同的培养方式影响重组酵母对半乳糖的利用。在YPG培养基中,GALl基因敲除对酵母利用半乳糖的影响并不明显,MS-1.SGl.DG115在20 h内将培养基中的半乳糖全部消耗完毕,DPG65则在26 h内将半乳糖利用完毕。在YPGL培养基中,MS-1、SG1.DG115和DPG65利用完半乳糖的时间分别为20 h、44 h、44 h和68 h。在两种培养模式中,GQ21培养基中的半乳糖浓度一直维持不变,表明GALl基因确实已经被完全敲除。GALl基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加没有改变重组菌株的热致死温度。重组菌株和对照菌株的热致死温度仍然是54℃。构建了PGKl启动子控制下的α-半乳糖营酶表达单元,并将此表达单元克隆到多拷贝质粒YEPlacl 81上构建了食品级克隆载体YPM.YPM转化酵母后得到的重组子可以在以蜜二糖为唯碳源的培养基中生长,并能在涂有X-α-gal的培养上显蓝色,表明α-半乳糖苷酶已经被有效表达。重组酵母/YPM在YPD培养基和MSD培养基中表达的a-半乳糖苷酶酶活最高为104 U/m1和41.72 U/ml；对照菌株安琪酵母表达的α-半乳糖苷酶存在蜜二糖／葡萄糖诱导-抑制效应,在YPD培养基和MSD培养基中的最高酶活为29.79 U/ml和266.38U/mI。在MSD培养基中,安琪酵母12h进入对数生长期,32 h进入稳定期；重组酵母YPM在68 h后才开始快速生长,164 h后进入稳定期。两者在YPD培养基中的生长性能一致,8 h进入对数生长期,32 h达到稳定期。扩增了GALl启动子、MFal信号肽以及ADHl终止子基因序列,以p-1,3-1,4-葡聚糖酶为报告基因在克隆载体YPM的基础上构建了食品级分泌表达载体YGMPA-PM.以α-半乳糖苷酶为筛选标记,将载体YGMPA-PM转入所构建的重组酵母菌株SG1、DG115、DPG65和GQ21以及MS-1,在蜜二糖平板(MSD)挑选出了转化子。测定不同GAL基因型酵母中p-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达水平。结果表明,SG1、DG115、DPG65和GQ21的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为1523.48 U/ml、2480.43 U/ml、3161.53 U/ml和3991.00 U/ml,为MS-1 (846.37U/ml)的1.8倍、2.93倍、3.73和4.72倍,说明酵母染色体上GALI基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加确实有利于提高外源蛋白表达的水平。重组分泌表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0。50℃保温2 h后p-1,3-1,4-葡聚糖酶残留酶活为51.90%；60℃保温2 h后的活力下降为初始酶活的20.14%。在pH4-6的范围内于4℃放置24 h,酶活仍能保持80%以上。扩增了编码α-凝集素C-末端320个氨基酸的基因序列并在载体YGMPA-PM的基础上构建了食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将其与不同GAL基因型的重组酵母相结合构建了食品级展示表达系统。此展示表达系统将p-1,3-1,4-葡聚糖酶成功展示表达在酿酒酵母细胞表面。通过平板鉴定和酶活测定确证了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的正确定位。SG1、DG115、DPG65和GQ21展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为84.98 U/ml、118 U/ml、161.55 U/ml和201.87 U/ml,分别为MS-1 (45.10 U/ml)的1.88倍、2.62倍、3.56倍和4.48倍。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生改变。最适温度变为60℃,热稳定性也被增强。50℃保温3 h对酶活几乎没有影响；60℃保温1 h残留酶活为初始酶活的129.2%,60℃保温3 h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%,3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH4-7的范围内稳定性较好。(本文来源于《浙江大学》期刊2009-09-15）
赵颖怡,梁世中,黄日波[2]（2002）在《一种新的食品酵母表达系统:产朊假丝酵母》一文中研究指出由于其安全性及高效性,产朊假丝酵母表达系统受到越来越广泛的重视。该酵母具有以下特点:严格好气的条件下生长不会产生乙醇、发酵密度高、在廉价的糖蜜中能生长。本文详细介绍了该系统的生物学特点、转化方法和应用前景。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2002年06期）
食品级酵母表达系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
由于其安全性及高效性,产朊假丝酵母表达系统受到越来越广泛的重视。该酵母具有以下特点:严格好气的条件下生长不会产生乙醇、发酵密度高、在廉价的糖蜜中能生长。本文详细介绍了该系统的生物学特点、转化方法和应用前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
食品级酵母表达系统论文参考文献
[1].郭钦.食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建[D].浙江大学.2009
[2].赵颖怡,梁世中,黄日波.一种新的食品酵母表达系统:产朊假丝酵母[J].生物技术通讯.2002