徐帆陈道中曹华陈良万
（福建医科大学附属协和医院心脏外科福建福州350004）
【摘要】目的：观察HTK液在灭菌孵育期间对大鼠带瓣管道活性的影响并探讨其作用机制。方法：将SD大鼠随机分成4组，取下主动脉带瓣管道，(1)对照组：带瓣管道不经灭菌孵育直接进行各项指标的检测。(2)实验组A：带瓣管道置于含有RPMI1640培养基和抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。(3)实验组B：带瓣管道置于含有半量RPMI1640培养基，半量HTK液及抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。(4)实验组C：带瓣管道置于含有HTK液和抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。对灭菌孵育后的带瓣管道进行细菌学、细胞活性、组织学检测。结果：各组灭菌孵育后的带瓣管道均未检出细菌及真菌，除对照组之外，实验组C带瓣管道的细胞活性保存最好，组织结构保存最完整。结论：在灭菌孵育期间采用HTK液，能提高大鼠带瓣管道的细胞活性及组织结构的保存效果。其主要机制是在灭菌孵育期间，HTK液中的组氨酸缓冲对能有效维持细胞内外环境的稳定，色氨酸及酮戊二酸作为能量底物，对缺血状态下的带瓣管道提供能量。
【关键词】HTK液；带瓣管道；保存
【中图分类号】R19【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2015）09-0252-03
同种异体带瓣管道(valvedhomograftconduit，VHC)因具有正常半月瓣的解剖形态，动力学性能良好，不需使用抗凝剂等诸多优点[1]被广泛应用于临床，其保存方法也成为研究热点。VHC在灭菌孵育期间易出现缺血性损伤，影响保存效果，而HTK液具有强大的缓冲能力及高能量底物，可提高组织对抗热缺血损伤的能力；为改善VHC的保存效果提供了可能。因此，我们通过从动物实验明确HTK液对灭菌孵育过程中带瓣管道活性的影响，并探讨其相关机制，旨在为临床工作中带瓣管道的保存提供新的思路及有价值的保存方法。
1.材料与方法
1.1抗生素营养液的配制
1）抗生素营养液I：在RPMI1640培养基中加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。
2）抗生素营养液Ⅱ：半量RPMI1640培养基及半量HTK液的混合液，并加入加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。
3）抗生素营养液Ⅲ：在HTK液中加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。
1.2实验动物及分组
采用健康成年雄性SD大鼠40只，体重约250～300g，随机分为4组，每组10只，采用无菌手术法取下主动脉带瓣管道。
1）对照组：取下带瓣管道不经灭菌孵育直接进行各项指标的检测。
2）实验组A：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液I的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。
3）实验组B：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液Ⅱ的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。
4）实验组C：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液Ⅲ的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。
1.3细菌学检测
在超净台下，取出灭菌孵育后的带瓣管道，PBS液清洗2遍，剪下部分主动脉管壁及瓣叶，行细菌及真菌培养。
1.4细胞活性检测（XTT比色法）
可溶性四氮唑（XTT）和电子偶联化合物可以进入活细胞中，线粒体内脱氢酶可将XTT和电子偶联化合物还原为橘红色甲簪产物，在450nm波长下产生吸收峰，吸收峰OD值与活细胞数量呈线性相关。
在超净台下取出灭菌孵育后的带瓣管道，PBS液清洗2遍，将带瓣管道剪成1×1mm大小的组织块备用。于暗室中向96孔板中每一孔内加入无酚红的RPMI1640培养基100ul，XTT染色工作液25ul；每份标本各取一份1×1mm大小组织块，电子天平上精确称重，置于96孔板中，于5%CO2、37℃的培养箱中孵育4小时；随后将96孔板放入酶标仪中，波长450nm激发光下测定吸收峰OD值；带瓣管道细胞活性以每毫克组织块将XTT还原成甲簪在450nm激发光下产生吸收峰的OD值表示。
1.5组织学检查
采用HE染色，观察带瓣管道细胞形态和组织结构。结果判定：带瓣管道的形态学结构半定量分析：按照内皮细胞存在和平滑肌细胞形态基本正常(1级)、内皮细胞部分脱落或部分平滑肌细胞疏松、轻度水肿(2级)、内皮细胞脱落并伴有平滑肌细胞空泡样变性、崩解(3级)分为3个级别。
1.6统计学处理
所有数据均采用SPSS16.0软件进行统计分析，XTT比色OD值采用（x-±s）表示，采用单因素方差分析进行统计，HE染色结果采用秩转换的非参数检验统计分析，P<0.05视为有显著性差异。
2.结果
2.1细菌学检测
实验组A、实验组B、实验组C共30份标本均送检细菌及真菌培养，所有标本均未检测出细菌及真菌。
2.2细胞活性检测
对照组每毫克组织吸光度最高，平均为0.081±0.004，高于实验组C的0.065±0.002，实验组B的0.048±0.008，实验组A最低，为0.037±0.005。各组之间的差别均有统计学意义（P<0.05）。随着HTK液浓度的提高，各实验组带瓣管道每毫克组织的吸光度相应提高（见表1）。
表1XTT比色法测量结果
3.组织学检查
实验组A：内皮细胞部分脱落，大部分平滑肌细胞形态正常，部分水肿、空泡样变性；实验组B：内皮细胞少许脱落，大部分平滑肌细胞形态正常，偶见水肿、个别空泡样变性；实验组C：偶见内皮细胞脱落，绝大多数平滑肌细胞形态正常，个别轻度水肿；对照组：内膜层完整，内皮细胞连续，前弹力膜光滑完整，中膜层平滑肌细胞形态正常，平滑肌细胞层之间胶原纤维、弹性纤维清晰、平顺，外膜层结缔组织疏松。
对4组带瓣管道HE染色镜下观察结果进行等级判定计分，进行秩转换的非参数检验（Kruskal-Wallis检验），P<0.05，并对各组间行Nemenyi检验，各组之间P<0.05。结果表明随着HTK液浓度的提高，带瓣管道的保存效果随之改善（见表2）。
表2HE染色秩检验结果
4.讨论
4.1灭菌效果
VHC在制备过程中虽然采取无菌操作，但是由于取材时间及现场环境的关系，污染仍不能完全避免，而将未经灭菌孵育的VHC进行细菌及真菌培养，阳性率高达85%[2]。因此，在液氮深低温保存之前，对VHC进行灭菌孵育必不可少。
我们在实验中，3组实验组分别采用完全RPMI1640培养基，半量RPMI1640培养基+半量HTK液，完全HTK液作为营养液，均采用欧洲移植物储存中心推荐的方法，即青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml配制抗生素营养液，于4℃条件下对带瓣管道进行灭菌孵育24小时[3]，30例标本均未检出细菌及真菌，说明以HTK液替代RPMI1640培养基作为营养液，对抗生素在4℃条件下发挥相应的灭菌活性并无明显影响。在灭菌效果方面，以HTK液代替传统的细胞培养基在灭菌孵育期间为VHC提供营养物质是可行的。
4.2HTK液对灭菌孵育期间带瓣管道保护作用的机制
通过对灭菌孵育后带瓣管道的细胞活性及组织结构的完整性进行检测和对比分析，我们发现，HTK液相比RPMI1640培养基作为营养液对带瓣管道的保存效果更佳，而这与HTK液的组成成分有关。
HTK液即组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液，是在以细胞内液成分为主的基础上，增加了组氨酸、a-酮戊二酸、色氨酸和甘露醇等成分。
4.2.1组氨酸
在灭菌孵育过程中，VHC处于缺血缺氧状态下，能量供应主要来自于糖酵解，而伴随糖酵解过程，大量的乳酸等酸性物质堆积，PH下降。RPMI1640培养基采用H2CO3/HCO3-缓冲对，缓冲能力有限，而HTK液含有大量组氨酸及组氨酸盐，缓冲能力比RPMI1640强数十倍，能有效避免细胞内外酸中毒，解除对糖酵解的抑制，使ATP的生成保持在较高的速率[4]。SumimotoR
等[5]研究发现，ATP，ADP，AMP在酸性环境下极性丧失，易从细胞膜中穿出，导致ATP合成前体的丢失。而用具有强大缓冲能力的组氨酸缓冲对，可以保持组织PH接近正常水平，防止了高能量的核苷的丢失，为ATP合成提供前体，保证了细胞内ATP的水平。此外，与其它缓冲系统相比，组氨酸有较好的水溶性，能由毛细血管渗透到组织间隙而发挥作用，而在HTK液中低钠和色氨酸能阻止组氨酸进入细胞内，而且组氨酸为非渗透性因子，可以将组织水分维持于细胞外，减少细胞和间质发生的水肿[6]。在实验中，我们发现，以HTK液作为营养液的带瓣管道细胞的代谢活性最佳，细胞及细胞器肿胀程度最轻，提示组氨酸在灭菌孵育期间对带瓣管道起到保护作用。
4.2.2α-酮戊二酸及色氨酸
RPMI1640培养基主要以葡萄糖供应能量，而在灭菌孵育期间，葡萄糖主要通过糖酵解的方式供能，利用率低，能量供应有限。HTK液主要能量底物为α-酮戊二酸(AKA)及色氨酸。AKA为三羧酸循环的中间产物，它可以通过三羧酸循环，呼吸链及氧化磷酸化产生ATP，色氨酸是一种生糖兼生酮氨基酸，为尼可酰胺核苷酸辅酶(NAD，NADP)的前体，而NAD/NADP是许多脱氢酶的辅酶，三羧酸循环脱下的氢通过NAD/NADP经呼吸链及氧化磷酸化产生ATP[7]。因此，AKA及色氨酸有助于在缺血-再灌注期间ATP的合成。
4.2.3低钙、低钠、高钾
HTK液是一种细胞内液型器官保存液，其低钠、高钾的环境与细胞内液相似，减小了缺血期间钠离子的内流，使动作电位不能产生，进而使心肌及主动脉管壁的平滑肌处于舒张状态，减少了能量消耗。另外，较少的钠离子内流也有助于减轻了缺血期间细胞水肿。HTK液中无钙，这有利于在缺血期间细胞外钙的内流，减少细胞内钙超载以及因钙离子过高而导致的细胞损伤。
4.2.4其他成分
HTK液中含有适度的甘露醇和镁离子。甘露醇可以防止能量缺乏时，Na+-K+-ATP酶活性降低，Na+内流导致的细胞肿胀，同时甘露醇还有抗氧自由基的作用，可以减轻缺血再灌注损伤。而镁离子是细胞内的重要阳离子，它是组成高能磷酸键的重要成分及细胞酶系统的一个辅助因子，它又是各种ATP酶的激活剂，适度的离子有助于维持细胞正常的功能状态[8]。
5.结论
本实验结果表明，将HTK液作为营养液对带瓣管道进行灭菌孵育，在灭菌效果和带瓣管道的保存上，均较以往的培养基有一定的提高。其机制可能是HTK液中组氨酸能提供强大的缓冲能力，维持细胞内外环境稳定，AKA及色氨酸在缺血缺氧状态下为细胞提供能量等有关。
【参考文献】
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