导读:本文包含了胚胎肺论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:Shh信号通路,基因敲除,肺发育,免疫荧光
胚胎肺论文文献综述
包和婧,马树东[1]（2018）在《Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育的调控作用》一文中研究指出目的探讨经典Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的调控作用。方法利用免疫组化检测Shh通路受体Smo(Smoothened)以及血小板源性生长因子受体(Pdgfr-α)的表达;利用Pdgfr-α间质特异性表达的特点构建Pdgfr-α-cre,通过他莫昔芬的诱导,在E12.5-E16.5(E,embryo)天转基因小鼠肺间质中特异性敲除Shh关键信号分子Smo;利用免疫荧光观察E12.5-E16.5小鼠胚胎肺间质特异性敲除Shh信号通路之后,小鼠胚胎肺发育过程中上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的改变,探讨Shh信号通路在小鼠胚胎肺发育过程中对上皮-间质转化的作用。结果 Smo在假腺期早期的肺上皮与间质中显着表达,后表达量逐渐下调,主要集中在肺间质,Pdgfr-α在假腺期早期胚胎肺中集中在远端肺上皮及间质,后期逐渐往近端间质发展,直至集中在主支气管周围的近端间质;首次利用Pdgfr-α-Cre系统在间质中特异性敲除Smo,成功制备了Smo缺失小鼠模型;与对照组肺相比,E12.5-E16.5基因敲除组小鼠的肺体积缩小,支气管分支形成减少;近端上皮指标P63的表达量下降(P<0.05);平滑肌标志物表达水平发生改变;支气管软骨发育滞后,黏蛋白表达量下降。结论 Shh信号通路的时空特异表达在小鼠胚胎肺上皮、间质(支气管软骨、平滑肌)发育的起着重要的调控作用。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2018年03期）
王小如[2]（2016）在《组蛋白去乙酰化酶3在小鼠胚胎肺发育过程中作用机制的研究》一文中研究指出支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早产儿常见的呼吸系统疾病,其典型的病理改变为气道结构异常和肺泡发育不良,具体表现为气道上皮细胞分化异常,肺泡数量减少,肺泡结构破坏,肺泡问质增生等结构功能的改变。BPD的发病机制仍不十分清楚,目前发现的可能的致病因素包括：早产、子宫内环境、氧气治疗和机械通气,感染与炎症等因素。除了以上外在因素外,遗传因素异常在BPD的发生过程也有重要意义,但是目前对BPD模型的表观遗传学的研究较少,本研究将从发育生物学的角度来探究表观遗传学因素在BPD发生过程中的的作用机制。表观遗传学是研究没有DNA序列变化的,但可遗传的基因表达的改变。组蛋白修饰是表观遗传学研究的一个重要方向,包括乙酰化,甲基化,磷酸化以及核糖基化等。调控组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶,其中乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acelyltransferase, HAT)催化完成,去乙酰化则由组蛋白去乙酰化酶(Histone deacelylase, HDAC)介导。目前的研究发现的哺乳动物的HDACs总计18种,按照其结构和功能分为4组,分别为Ⅰ型,Ⅱa型,Ⅱb型和Ⅳ型。Ⅰ型HDACs家族包含四个成员,分别是HDAC1,HDAC2, HDAC3和HDAC8。HDACs被证明在促进细胞的增殖和抑制凋亡过程中发挥重要作用。除此之外,随着近年来小鼠同源重组和基因敲除技术的进步,人们发现HDACs在多种器官的发育过程中也发挥不同的组织特异性功能。本实验室的前期研究发现Ⅰ型HDACs(HDAC1、HDAC 2和HDAC 3)在整个小鼠胚胎发育过程中在肺内广泛、持续表达,提示其在肺器官发育过程中中可能发挥重要作用。在肺上皮细胞内组织特异性敲除HDAC1和HDAC2基因,会导致肺的近端气道(proximal airway)发育不良。同样,在肺上皮细胞中敲除HDAC3基因,会抑制在肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT1)在肺发育晚期肺泡形成阶段的重塑功能,导致AT1扩张障碍和肺泡塌陷。除了肺上皮细胞内,HDAC3在整个胚胎发育阶段同时也肺间质细胞内广泛表达,在本研究中,我们构建HDAC3组织特异性敲除小鼠模型来探明肺间质细胞中HDAC3缺失导致小鼠肺发育不全的作用机制。第一部分：HDAC3基因缺失导致小鼠肺发育不良为了研究为了研究HDAC3基因在小鼠胚胎肺发育中的重要作用,我们首先要明确在胚胎发育的不同时期HDAC3基因在小鼠肺内的表达模式。我们对胚胎发育各个时期的肺组织切片进行HDAC3免疫荧光染色,实验结果显在肺发育的整个过程中,HDAC3在肺上皮细胞和间质细胞中持续而广泛的表达,我们可以推测HDAC3在小鼠肺发育过程中可能发挥重要的作用。为了进一步研究肺间质细胞中HDAC3基因在肺发育过程中的作用机制,我们利用Cre-loxP系统组织特异性敲除目的基因。我们在HDAC3基因4-7号外显子两端分别插入一个LoxP位点,在Cre酶作用下将HDAC3基因的4-7号外显子将被切除。Dermo1-Cre转基因小鼠是间质细胞特异性转基因小鼠,该小鼠的Cre重组酶活性由间质细胞特异性蛋白Dermo1基因的启动子调控,可达到在间质细胞特异性表达Cre重组酶的目的。我们将HDAC3flox/flox转基因小鼠与Dermo1-Cre+/-转基因小鼠杂交,获得HDAC3flox/+;Dermo1Cre+/-基因型小鼠后代,后者再次与HDAC3flox/flox小鼠杂交后可获得敲除两个HDAC3基因的纯合体。(HDAC3flox/flox;Dermo1 Cre+/-基因型,又记作HDAC3Dermo1CreKO)分别于小鼠胚胎发育的不同时期解剖小鼠取胚胎肺,对其进行基因组鉴定,部分肺叶组织固定包埋切片,用于HE染色和免疫荧光染色。部分肺组织加入细胞裂解液提取总RNA,用于Q-PCR分析实验。我们通过免疫荧光染色来检测Dermo1-Cre重组酶的效率,发现在肺间质细胞中几未检测出HDAC3蛋白,提示杂交小鼠在Cre重组酶的作用下有效敲除了在肺间质细胞中的HDAC3基因。95%以上的HDAC3Dermo1CreKO基因型的新生小鼠在出生后几小时内因呼吸窘迫死亡。组织学分析实验发现,HDAC3Dermo1CreKO基因型的小鼠胚胎肺较野生型(WT)对照组略减小,但肺叶数量和位置未见异常,肺叶边缘不规整,提示存在肺间质发育不良。高倍镜视野下可见气道分枝化形态发生正常,提示HDAC3不是气道分枝化形态发生的必要因素。E18.5肺组织切片的HE染色显示实验组小鼠的肺泡数量减少,部分肺泡塌陷,肺间隔显着增厚,肺扩张存在明显障碍。肺泡发育畸形导致无法形成有效的气体交换平面以建立正常的呼吸功能,是新生小鼠致死的主要原因。。综上所述,肺间质细胞中HDAC3的重要作用可能贯穿整个小鼠胚胎肺发育过程,早期HDAC3基因缺失导致肺间质发育不良,但是不会影响肺上皮细胞的分枝化形态发生过程。在胚胎发育的晚期原始肺泡发育阶段,HDAC3基因缺失会导致远端气道的发育缺陷。HDAC3具体以何种机制参与到肺泡晚期远端气道的组织分化调控,是我们下一步的研究重点。第二部分：HDAC3在小鼠肺间质细胞增殖和分化过程中的作用第一部分的组织学分析结果显示,HDAC3DermolCreKO基因型小鼠胎肺较野生型(WT)明显减小,由此我们推测肺间质细胞HDAC3基因缺失导致的肺发育不良可能是由于肺上皮细胞或者肺间质细胞的增殖能力下降所引起的。为了评估HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺发育过程中肺内细胞增殖是否受到抑制,我们对胚胎发育不同时期的肺组织切片行PO4-H3免疫荧光染色和TTF-1、BrdU双重染色以检测细胞增殖率,统计分析发现PO4-H3和TTF-1-BrdU+细胞比例与对照组(WT)相比明显减少,TTF-1+BrdU+细胞占总细胞数百分比无明显变化,说明肿间质细胞内HDAC3缺失直接影响肺间质细胞的增殖能力,但是肺上皮细胞的增殖未受到影响。众所周知,HDACs会通过调节基因表达来参与细胞周期的调节,主要通过细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)、细胞周期蛋白(Cyclins)的正向调控和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CKIs)的负向调控来实现。我们对HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺组织内表达的细胞周期相关因子进行Q-PCR分析发现,在肺间质细胞HDAC3基因缺失的小鼠肺组织内,细胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1和CDK1的mRNA表达水平显着下降；P27的mRNA表达较对照组显着升高,其他相关细胞周期蛋白和激酶无明显变化。这个结果与早前研究报道相一致,提示HDAC3是通过细胞周期相关因子来参与调控细胞周期以达到控制细胞生长的目的,而其中的具体的分子生物学机制尚未完全清楚,可能是一个多因素参与的复杂过程。在肺发育的过程中,肺间质细胞会发育分化成多种细胞系,如平滑肌细胞(smooth muscle cells)、内皮细胞(endothelial cells)、周细胞(pericytes)和间质成纤维细胞(interstitial fibroblasts)。为了研究HDAC3对肺中胚层来源的细胞系分化的影响,我们对转基因小鼠肺组织切片行特异性细胞标志物免疫荧光染色。1.小鼠肺组织切片行Sox2和SM22双重免疫荧光染色,结果显示HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠气道平滑肌未见异常,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响间质细胞源性平滑肌细胞的分化。2.内皮细胞标志蛋白Pecam表达在HDAC3基因缺失的肺组织内未见异常,Q-PCR结果显示内皮细胞特异性标志物的mRNA表达与蛋白表达水平相-致,说明HDAC3未参与肺内皮细胞分化的调控。3. 间质成纤维细胞几个重要标志物Pdgfr-b和Vmentin的蛋白和mRNA表达在HDAC3基因缺失的小鼠肺组织中显着降低。HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠和野生型对照小鼠的肺组织中分离的肺间质细胞进行体外培养,免疫荧光染色结果显示Ki67+和Pdgfr-b+细胞占总细胞的百分比明显降低,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3影响肺间质来源的成纤维细胞的增殖和分化。第叁部分HDAC3在小鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞分化过程中作用机制的研究小鼠胚胎发育至E17.5,肺的发育由气道分枝化形态发生阶段进入原始肺泡形成阶段。这个阶段包含远端气道末端扩张呈囊和肺泡上皮细胞分化两个主要的发育过程。为了研究肺间质细胞HDAC3基因缺失是否影响肺上皮细胞的分化,我们采用组织切片免疫荧光染色和Q-PCR分析来检测肺上皮细胞的细胞标志物的蛋白和mRNA表达：1.肺泡1型上皮细胞(AEC 1)的细胞标志物AQP-5和T1-alpha的蛋白和mRNA表达在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中明显减低,提示AEC 1细胞分化障碍。2.肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC 2)的细胞特异性标志物Sftpc、Sftpb和Abca在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织的表达未见明显异常,说明肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响AEC 2细胞的分化和成熟。3.纤毛上皮细胞特异性细胞标志物Foxj1和beta-tublin Ⅳ,分泌细胞标志物Scbg1a1,HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中这些近端气道的上皮细胞的标志物的表达与对照组相比(WT)无明显差异,提示HDAC3基因不参与肺近端气道上皮细胞的分化和发育的调控。为了研究肺间质细胞内HDAC3缺失导致肺泡扩张障碍和AEC 1细胞分化不全的的分子机制,我们采用磁珠分选的方法分离肺上皮细胞和间质细胞,并对其进行Q-PCR分析。实验结果显示HDAC3缺失的EpCAM-的肺间质细胞中配体Wnt2和Wnt5的表达明显下降；EpCAM+的肺上皮细胞中配体Wnt5a和Wnt7a表达同样受到抑制,经典Wnt信号通路中常见的目的基因Axin2、Lef-1和CyclinD1的表达明显减低。以上实验结果证实肺间质细胞特异性敲除HDAC3会抑制Wnt信号通路配体的表达,进一步导致经典Wnt/p-catenin信号通路的活性下降。HDAC3在胚胎肺发育晚期的肺泡扩张和AEC1分化成熟的过程发挥重要作用,体外肺组织培养实验验证了在胚胎肺发育晚期抑制Wnt/β-catenin信号通路活性可以造成肺发育晚期AEC1分化缺陷,同时挽救实验中在胚胎发育晚期给孕鼠腹腔注射Wnt信号通路激动剂LiCI可以缓解肺间质细胞HDAC3缺失导致的肺发育不良。由此我们可以得出结论,肺间质细胞内的HDAC3对肺发育晚期AEC1的分化成熟具有重要意义,HDAC3Dermo1CreKO转基因的小鼠的肺内AEC1的分化缺陷是由于肺上皮细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性减低所引起的,而HDAC3作为上游的调控因子对Wnt/β-catenin信号通路活性发挥调节作用。(本文来源于《山东大学》期刊2016-04-06）
师迎旭,杜华,郑国光[3]（2014）在《人胚胎肺成纤维细胞复制性衰老模型的建立》一文中研究指出目的建立人胚肺成纤维(HEL)细胞,复制性衰老模型,模拟正常细胞的衰老过程。方法利用HEL细胞的复制性衰老特性,通过细胞传代培养的办法,将获得的原代HEL细胞培养直至其衰老,冻存不同代的HEL细胞备用。然后利用β-半乳糖苷酶染色、端粒长度的检测以及p21蛋白的表达变化检测细胞的衰老状态。结果培养HEL细胞,按1∶2分瓶传代直至其衰老,最终细胞代龄为64。通过染色与分子检测证实细胞随着传代逐渐衰老。结论成功建立了HEL衰老模型,为进一步研究正常细胞复制性衰老奠定了基础。(本文来源于《中国老年学杂志》期刊2014年08期）
张倩,彭俊飞,凌遥,苟文钰,张浩[4]（2013）在《藏鸡胚胎肺组织eNOS和ACE基因表达与低氧适应分析》一文中研究指出1引言藏鸡生活在我国高海拔地区,对高原低压、低氧、高寒等恶劣气候环境具有极强的适应性。与之相比,低地鸡在低氧环境下胚胎死亡率会显着升高。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和血管紧缩素l转移酶(ACE)在体内分别催化产生一氧化氮(NO)和血管紧缩素Ⅱ(AngⅡ)。NO是重要的血管舒张因子,AngⅡ是血管收缩因子,二者共同调节血管压力和血管重塑,提高血液运输功能。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测这2个基因在不同氧浓度(本文来源于《中国畜牧兽医学会家禽学分会第九次代表会议暨第十六次全国家禽学术讨论会论文集》期刊2013-05-12）
董丽萍,邹鹰,黄河,张喆,魏楚蓉[5]（2011）在《巢蛋白在人胚胎肺中的表达》一文中研究指出目的:研究不同时期人胚胎肺中巢蛋白的表达变化,探讨巢蛋白在肺发育过程中的作用。方法:取3～8月人胚胎肺组织,常规石蜡切片,采用免疫组织化学法检测巢蛋白在胚胎肺中的表达及分布。结果:各胎龄段(3～8月)肺均有巢蛋白的表达,巢蛋白阳性细胞主要分布于肺内支气管旁和血管中,而在支气管上皮中未发现阳性细胞。结论:正常人胚胎肺中有巢蛋白的表达,随着胎龄的增加,巢蛋白表达量下降。(本文来源于《国际病理科学与临床杂志》期刊2011年06期）
冯林[6]（2010）在《1.从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱 2.深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究》一文中研究指出该博士学位论文由相对独立的两部分工作组成。第一部分从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱发育与肿瘤具有一定程度的相似性。从胚胎发育中探索和挖掘隐藏在肿瘤细胞内的恶性信息,为肿瘤基础及临床研究提供新的线索,正逐步成为一个新的研究方向。本研究从叁个方面观察了影响原发性肺癌预后的分子事件在胚胎肺发育过程中的变化规律：1)人胚胎肺发育的mRNA表达特征：2)人胚胎肺发育与原发性肺癌基因表达谱相似性比较；3)人胚胎肺发育相关基因对原发性肺癌预后的影响。研究结果显示,胚胎肺发育在组织学层面的时空变化与分子水平的mRNA表达具有动态联系,在我们所关注的两个基因簇中,其mRNA表达随发育的进程而呈现此消彼长、互呈X状走向的表达模式。高开低走型表达模式的基因簇与细胞增殖相关；而低开高走型基因簇则和细胞与细胞、细胞与间质通讯,胞膜成熟相关。根据基因表达特征,将原发性肺腺癌与肺鳞癌投射到胚胎肺发育的动态模式中,发现肿瘤样本间的异质性明显大于正常组织；与非肿瘤成人肺相比,肺腺癌的基因表达特征与胚胎肺组织相似,肺鳞癌则与更早期肺组织相似。根据基因表达的动态分布特征,以SMC4为代表的、在胚胎肺发育过程中表达丰度呈高开低走型的基因群在肺癌组织中的表达则重新上调。进一步分析发现,SMC4基因群总体表达水平与肺腺癌患者临床预后有关,并且不依赖于患者的临床分期、淋巴结转移情况等；但却未发现它们与肺鳞癌患者临床预后有关。SMC4基因群作为分子表型与肺腺癌患者临床表型的相关性,在多组公共数据库来源的独立样本中均得到了验证。本研究结果提示,人胚胎肺发育组织与原发性肺癌在分子水平存在共性；与肺癌患者预后相关的恶性分子事件可能是胚胎记忆的重新唤起。以胚胎发育作为切入点,系统整合分析胚胎发育与肿瘤的内在联系,不失为一条探索肿瘤发生与发展机理的新途径。第二部分深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究基于第二代测序的数字表达谱技术(next-generation sequencing based Digital Gene Expression tag profiling, DGE)已经开始用于基因表达谱研究。为了评价DGE测序平台和基因芯片平台对mRNA表达谱的检测质量,我们分别对这两个平台在基因表达谱检测能力、技术重复性、动态范围和检测结果间的一致程度等主要技术指标进行了测评。检测对象是转染了DENND2D基因和空载体的NCI-H1299细胞系的mRNA表达谱。结果显示,在两种细胞内,基因芯片平台共检测到17,362个基因,DGE测序平台共检测到15,938个,其中13,221个基因为两平台共同检测到的基因。两技术平台内两次技术重复间的相关系数均大于0.99,变异系数小于9%。基因芯片平台的动态范围固定在4个数量级,而DGE平台的动态范围根据其测序深度的不同是可拓展的。两平台检测结果的一致性高,特别是对于那些丰度较高的基因。相比于DGE测序平台,基因芯片平台更难检测出表达丰度低的基因。虽然基因芯片技术或许最终会被深测序(deep sequencing)技术取代,但由于基因芯片的成本优势,以及已经建立的硬件和数据分析基础,短期内该平台还将是基因表达谱研究领域的重要技术手段。(本文来源于《中国协和医科大学》期刊2010-04-01）
邹焰,申旭波,姜慧,贾飞飞,熊云刚[7]（2010）在《亚砷酸钠对人胚胎肺成纤维细胞p53基因表达的诱导作用观察》一文中研究指出目的探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人胚胎肺成纤维细胞(HELF)p53基因表达的影响。方法以0、3、9、15μmol/L的NaAsO2处理体外培养的HELF24h,然后用Real-ti me PCR检测p53mRNA的表达,免疫组化SABC法检测p53蛋白水平。结果3、9、15μmol/L NaAsO2处理24h后,HELF中p53mRNA及蛋白表达均明显增高(P<0.05),且除9、15μmol/L组间p53mRNA表达无明显差异外,其余各组mRNA及蛋白表达水平均随NaAsO2剂量升高而增加(P<0.05)。直线相关分析显示,HELF中p53mRNA及蛋白表达均与NaAsO2剂量呈正相关(r=0.947,P<0.01;r=0.992,P<0.01)。结论NaAsO2可诱导HELF中p53mRNA和蛋白表达增加,并与剂量呈正相关。(本文来源于《解放军医学杂志》期刊2010年01期）
杨汀,王辰,庞宝森,代华平,何培英[8]（2009）在《透明质酸对人胚胎肺成纤维细胞胶原凝胶的作用及其途径》一文中研究指出目的了解透明质酸(HA)片段是否促进人胚胎肺成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs),探讨HA与细胞的相互作用对胶原收缩和降解的影响,初步研究HA与肺成纤维细胞作用的受体途径。方法1)取人胚胎肺组织块进行肺成纤维细胞培养;2)实验分为5组:CD44抗体组(C组)、整合素β1(Integralβ1)抗体组(B组)、IgG1对照抗体组(I组)、HA组(H组)和蒸馏水对照组(M组);3)肺成纤维细胞分别与CD44抗体、Integralβ1抗体或IgG1抗体孵育30min;4)将细胞悬液与胶原溶液、透明质酸溶液(200000、0.1g/L)混匀,共同孵育,待形成凝胶后将凝胶漂浮于培养液中,连续培养72h;5)每24h记录凝胶面积,留取第1个24h的培养上清液应用酶联免疫吸附法检测MMPs,72h后收集凝胶,应用分光光度测定法进行羟脯氨酸检测;6)应用免疫细胞化学法检测肺成纤维细胞透明质酸CD44受体。结果1)5个组的凝胶面积均随时间的推移而逐渐变小,C组和B组的凝胶面积在各个时间点与I组和H组比较都有显着增加,差异有统计学意义(P=0.000),与对照组比较差异无统计学意义。2)肺成纤维细胞胶原凝胶中羟脯氨酸的含量以C组和M组最高,2组与B组、I组及H组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3)肺成纤维细胞C组和B组MMP-9的水平明显低于H组和I组(P<0.05),与M组比较差异无统计学意义;C组MMP-1的水平明显低于B组、H组和I组(P<0.05),与M组比较差异无统计学意义。4)HA可促进肺成纤维细胞CD44受体的表达,以相对分子质量为200000的片段作用最强。结论HA对人肺成纤维细胞MMPs的分泌有促进作用,加剧了胶原凝胶的收缩和降解,这种作用可被CD44抗体所抑制,也可被Integrinβ抗体部分抑制。(本文来源于《首都医科大学学报》期刊2009年04期）
宋春阳,潘逼然,陈誉华,陈澄[9]（2009）在《小鼠胚胎肺Smad1互作蛋白p72的筛选鉴定及其功能的初步分析》一文中研究指出肺是重要的呼吸器官,新生儿只有具有发育成熟的肺才能健康存活。在肺发育的过程中先形成构筑复杂的气道系统,随后末梢肺组织分化形成具有完善功能的气体交换面。BMP4-Smad1信号通路在这两个过程中都发挥重要的调控作用。此前的研究发现,敲除发(本文来源于《细胞·生命·健康——第十一届中国细胞生物学学术大会暨2009西安细胞生物学国际会议论文集》期刊2009-07-05）
马跃文,柏广涛,张美侠[10]（2009）在《纤维连接蛋白诱导人胚胎肺纤维细胞增殖的MAPK信号转导通路研究》一文中研究指出目的探讨纤维连接蛋白(FN)诱导人胚胎肺纤维细胞(HFL1)增殖的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。方法采用不同浓度FN刺激HFL1,观察细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059、p38蛋白激酶抑制剂SB203580对FN诱导HFL1增殖作用的影响。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖情况。结果FN对HFL1诱导增殖作用呈剂量依赖性升高趋势,在50ng/ml时作用显着;PD98059和SB203580可抑制FN诱导的HFL1细胞增殖。结论FN诱导HFL1的细胞增殖可以通过MAPK信号转导途径实现。(本文来源于《中国医科大学学报》期刊2009年05期）
胚胎肺论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早产儿常见的呼吸系统疾病,其典型的病理改变为气道结构异常和肺泡发育不良,具体表现为气道上皮细胞分化异常,肺泡数量减少,肺泡结构破坏,肺泡问质增生等结构功能的改变。BPD的发病机制仍不十分清楚,目前发现的可能的致病因素包括：早产、子宫内环境、氧气治疗和机械通气,感染与炎症等因素。除了以上外在因素外,遗传因素异常在BPD的发生过程也有重要意义,但是目前对BPD模型的表观遗传学的研究较少,本研究将从发育生物学的角度来探究表观遗传学因素在BPD发生过程中的的作用机制。表观遗传学是研究没有DNA序列变化的,但可遗传的基因表达的改变。组蛋白修饰是表观遗传学研究的一个重要方向,包括乙酰化,甲基化,磷酸化以及核糖基化等。调控组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶,其中乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acelyltransferase, HAT)催化完成,去乙酰化则由组蛋白去乙酰化酶(Histone deacelylase, HDAC)介导。目前的研究发现的哺乳动物的HDACs总计18种,按照其结构和功能分为4组,分别为Ⅰ型,Ⅱa型,Ⅱb型和Ⅳ型。Ⅰ型HDACs家族包含四个成员,分别是HDAC1,HDAC2, HDAC3和HDAC8。HDACs被证明在促进细胞的增殖和抑制凋亡过程中发挥重要作用。除此之外,随着近年来小鼠同源重组和基因敲除技术的进步,人们发现HDACs在多种器官的发育过程中也发挥不同的组织特异性功能。本实验室的前期研究发现Ⅰ型HDACs(HDAC1、HDAC 2和HDAC 3)在整个小鼠胚胎发育过程中在肺内广泛、持续表达,提示其在肺器官发育过程中中可能发挥重要作用。在肺上皮细胞内组织特异性敲除HDAC1和HDAC2基因,会导致肺的近端气道(proximal airway)发育不良。同样,在肺上皮细胞中敲除HDAC3基因,会抑制在肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT1)在肺发育晚期肺泡形成阶段的重塑功能,导致AT1扩张障碍和肺泡塌陷。除了肺上皮细胞内,HDAC3在整个胚胎发育阶段同时也肺间质细胞内广泛表达,在本研究中,我们构建HDAC3组织特异性敲除小鼠模型来探明肺间质细胞中HDAC3缺失导致小鼠肺发育不全的作用机制。第一部分：HDAC3基因缺失导致小鼠肺发育不良为了研究为了研究HDAC3基因在小鼠胚胎肺发育中的重要作用,我们首先要明确在胚胎发育的不同时期HDAC3基因在小鼠肺内的表达模式。我们对胚胎发育各个时期的肺组织切片进行HDAC3免疫荧光染色,实验结果显在肺发育的整个过程中,HDAC3在肺上皮细胞和间质细胞中持续而广泛的表达,我们可以推测HDAC3在小鼠肺发育过程中可能发挥重要的作用。为了进一步研究肺间质细胞中HDAC3基因在肺发育过程中的作用机制,我们利用Cre-loxP系统组织特异性敲除目的基因。我们在HDAC3基因4-7号外显子两端分别插入一个LoxP位点,在Cre酶作用下将HDAC3基因的4-7号外显子将被切除。Dermo1-Cre转基因小鼠是间质细胞特异性转基因小鼠,该小鼠的Cre重组酶活性由间质细胞特异性蛋白Dermo1基因的启动子调控,可达到在间质细胞特异性表达Cre重组酶的目的。我们将HDAC3flox/flox转基因小鼠与Dermo1-Cre+/-转基因小鼠杂交,获得HDAC3flox/+;Dermo1Cre+/-基因型小鼠后代,后者再次与HDAC3flox/flox小鼠杂交后可获得敲除两个HDAC3基因的纯合体。(HDAC3flox/flox;Dermo1 Cre+/-基因型,又记作HDAC3Dermo1CreKO)分别于小鼠胚胎发育的不同时期解剖小鼠取胚胎肺,对其进行基因组鉴定,部分肺叶组织固定包埋切片,用于HE染色和免疫荧光染色。部分肺组织加入细胞裂解液提取总RNA,用于Q-PCR分析实验。我们通过免疫荧光染色来检测Dermo1-Cre重组酶的效率,发现在肺间质细胞中几未检测出HDAC3蛋白,提示杂交小鼠在Cre重组酶的作用下有效敲除了在肺间质细胞中的HDAC3基因。95%以上的HDAC3Dermo1CreKO基因型的新生小鼠在出生后几小时内因呼吸窘迫死亡。组织学分析实验发现,HDAC3Dermo1CreKO基因型的小鼠胚胎肺较野生型(WT)对照组略减小,但肺叶数量和位置未见异常,肺叶边缘不规整,提示存在肺间质发育不良。高倍镜视野下可见气道分枝化形态发生正常,提示HDAC3不是气道分枝化形态发生的必要因素。E18.5肺组织切片的HE染色显示实验组小鼠的肺泡数量减少,部分肺泡塌陷,肺间隔显着增厚,肺扩张存在明显障碍。肺泡发育畸形导致无法形成有效的气体交换平面以建立正常的呼吸功能,是新生小鼠致死的主要原因。。综上所述,肺间质细胞中HDAC3的重要作用可能贯穿整个小鼠胚胎肺发育过程,早期HDAC3基因缺失导致肺间质发育不良,但是不会影响肺上皮细胞的分枝化形态发生过程。在胚胎发育的晚期原始肺泡发育阶段,HDAC3基因缺失会导致远端气道的发育缺陷。HDAC3具体以何种机制参与到肺泡晚期远端气道的组织分化调控,是我们下一步的研究重点。第二部分：HDAC3在小鼠肺间质细胞增殖和分化过程中的作用第一部分的组织学分析结果显示,HDAC3DermolCreKO基因型小鼠胎肺较野生型(WT)明显减小,由此我们推测肺间质细胞HDAC3基因缺失导致的肺发育不良可能是由于肺上皮细胞或者肺间质细胞的增殖能力下降所引起的。为了评估HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺发育过程中肺内细胞增殖是否受到抑制,我们对胚胎发育不同时期的肺组织切片行PO4-H3免疫荧光染色和TTF-1、BrdU双重染色以检测细胞增殖率,统计分析发现PO4-H3和TTF-1-BrdU+细胞比例与对照组(WT)相比明显减少,TTF-1+BrdU+细胞占总细胞数百分比无明显变化,说明肿间质细胞内HDAC3缺失直接影响肺间质细胞的增殖能力,但是肺上皮细胞的增殖未受到影响。众所周知,HDACs会通过调节基因表达来参与细胞周期的调节,主要通过细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)、细胞周期蛋白(Cyclins)的正向调控和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CKIs)的负向调控来实现。我们对HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺组织内表达的细胞周期相关因子进行Q-PCR分析发现,在肺间质细胞HDAC3基因缺失的小鼠肺组织内,细胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1和CDK1的mRNA表达水平显着下降；P27的mRNA表达较对照组显着升高,其他相关细胞周期蛋白和激酶无明显变化。这个结果与早前研究报道相一致,提示HDAC3是通过细胞周期相关因子来参与调控细胞周期以达到控制细胞生长的目的,而其中的具体的分子生物学机制尚未完全清楚,可能是一个多因素参与的复杂过程。在肺发育的过程中,肺间质细胞会发育分化成多种细胞系,如平滑肌细胞(smooth muscle cells)、内皮细胞(endothelial cells)、周细胞(pericytes)和间质成纤维细胞(interstitial fibroblasts)。为了研究HDAC3对肺中胚层来源的细胞系分化的影响,我们对转基因小鼠肺组织切片行特异性细胞标志物免疫荧光染色。1.小鼠肺组织切片行Sox2和SM22双重免疫荧光染色,结果显示HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠气道平滑肌未见异常,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响间质细胞源性平滑肌细胞的分化。2.内皮细胞标志蛋白Pecam表达在HDAC3基因缺失的肺组织内未见异常,Q-PCR结果显示内皮细胞特异性标志物的mRNA表达与蛋白表达水平相-致,说明HDAC3未参与肺内皮细胞分化的调控。3. 间质成纤维细胞几个重要标志物Pdgfr-b和Vmentin的蛋白和mRNA表达在HDAC3基因缺失的小鼠肺组织中显着降低。HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠和野生型对照小鼠的肺组织中分离的肺间质细胞进行体外培养,免疫荧光染色结果显示Ki67+和Pdgfr-b+细胞占总细胞的百分比明显降低,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3影响肺间质来源的成纤维细胞的增殖和分化。第叁部分HDAC3在小鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞分化过程中作用机制的研究小鼠胚胎发育至E17.5,肺的发育由气道分枝化形态发生阶段进入原始肺泡形成阶段。这个阶段包含远端气道末端扩张呈囊和肺泡上皮细胞分化两个主要的发育过程。为了研究肺间质细胞HDAC3基因缺失是否影响肺上皮细胞的分化,我们采用组织切片免疫荧光染色和Q-PCR分析来检测肺上皮细胞的细胞标志物的蛋白和mRNA表达：1.肺泡1型上皮细胞(AEC 1)的细胞标志物AQP-5和T1-alpha的蛋白和mRNA表达在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中明显减低,提示AEC 1细胞分化障碍。2.肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC 2)的细胞特异性标志物Sftpc、Sftpb和Abca在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织的表达未见明显异常,说明肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响AEC 2细胞的分化和成熟。3.纤毛上皮细胞特异性细胞标志物Foxj1和beta-tublin Ⅳ,分泌细胞标志物Scbg1a1,HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中这些近端气道的上皮细胞的标志物的表达与对照组相比(WT)无明显差异,提示HDAC3基因不参与肺近端气道上皮细胞的分化和发育的调控。为了研究肺间质细胞内HDAC3缺失导致肺泡扩张障碍和AEC 1细胞分化不全的的分子机制,我们采用磁珠分选的方法分离肺上皮细胞和间质细胞,并对其进行Q-PCR分析。实验结果显示HDAC3缺失的EpCAM-的肺间质细胞中配体Wnt2和Wnt5的表达明显下降；EpCAM+的肺上皮细胞中配体Wnt5a和Wnt7a表达同样受到抑制,经典Wnt信号通路中常见的目的基因Axin2、Lef-1和CyclinD1的表达明显减低。以上实验结果证实肺间质细胞特异性敲除HDAC3会抑制Wnt信号通路配体的表达,进一步导致经典Wnt/p-catenin信号通路的活性下降。HDAC3在胚胎肺发育晚期的肺泡扩张和AEC1分化成熟的过程发挥重要作用,体外肺组织培养实验验证了在胚胎肺发育晚期抑制Wnt/β-catenin信号通路活性可以造成肺发育晚期AEC1分化缺陷,同时挽救实验中在胚胎发育晚期给孕鼠腹腔注射Wnt信号通路激动剂LiCI可以缓解肺间质细胞HDAC3缺失导致的肺发育不良。由此我们可以得出结论,肺间质细胞内的HDAC3对肺发育晚期AEC1的分化成熟具有重要意义,HDAC3Dermo1CreKO转基因的小鼠的肺内AEC1的分化缺陷是由于肺上皮细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性减低所引起的,而HDAC3作为上游的调控因子对Wnt/β-catenin信号通路活性发挥调节作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胚胎肺论文参考文献
[1].包和婧,马树东.Shh信号通路对小鼠胚胎肺发育的调控作用[J].南方医科大学学报.2018
[2].王小如.组蛋白去乙酰化酶3在小鼠胚胎肺发育过程中作用机制的研究[D].山东大学.2016
[3].师迎旭,杜华,郑国光.人胚胎肺成纤维细胞复制性衰老模型的建立[J].中国老年学杂志.2014
[4].张倩,彭俊飞,凌遥,苟文钰,张浩.藏鸡胚胎肺组织eNOS和ACE基因表达与低氧适应分析[C].中国畜牧兽医学会家禽学分会第九次代表会议暨第十六次全国家禽学术讨论会论文集.2013
[5].董丽萍,邹鹰,黄河,张喆,魏楚蓉.巢蛋白在人胚胎肺中的表达[J].国际病理科学与临床杂志.2011
[6].冯林.1.从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱 2.深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究[D].中国协和医科大学.2010
[7].邹焰,申旭波,姜慧,贾飞飞,熊云刚.亚砷酸钠对人胚胎肺成纤维细胞p53基因表达的诱导作用观察[J].解放军医学杂志.2010
[8].杨汀,王辰,庞宝森,代华平,何培英.透明质酸对人胚胎肺成纤维细胞胶原凝胶的作用及其途径[J].首都医科大学学报.2009
[9].宋春阳,潘逼然,陈誉华,陈澄.小鼠胚胎肺Smad1互作蛋白p72的筛选鉴定及其功能的初步分析[C].细胞·生命·健康——第十一届中国细胞生物学学术大会暨2009西安细胞生物学国际会议论文集.2009
[10].马跃文,柏广涛,张美侠.纤维连接蛋白诱导人胚胎肺纤维细胞增殖的MAPK信号转导通路研究[J].中国医科大学学报.2009