导读:本文包含了休眠诱导论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肝细胞性肝癌,肿瘤休眠,肿瘤相关巨噬细胞,M1型巨噬细胞上清
休眠诱导论文文献综述
庄梦玮[1]（2019）在《M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠》一文中研究指出研究目的肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是高死亡率和病死率的原发性肝癌,是世界上最常见的恶性肿瘤。由于它缺乏早期诊断的生物标记以及手术后具有较高的复发率和转移率,肝癌对人的健康造成了严重的威胁,高复发和易转移率严重影响了患者的生存率,研究如何防止肝癌患者手术后肿瘤复发和转移的原因和机制具有重要的意义。肿瘤转移是导致癌症相关死亡的主要原因,在原发性肿瘤手术后或者化疗后,肿瘤块会减少,而肿瘤细胞经过数月,数年或数十年,形成转移病灶,肿瘤转移过程中,播散性肿瘤细胞(DTCs)发挥了巨大作用。由于残余播散性肿瘤的生物学特性似乎与原发性肿瘤生物学特性大相径庭,当播散性肿瘤细胞转移到新的组织时,长期处于慢速增殖状态,因此具有更强的免疫逃逸以及耐药性并且保持临床无症状,此时播散性肿瘤细胞(DTCs)可能进入休眠状态。肿瘤休眠的概念最初由Rupert Willis提出,1952年被Geoffrey Hadfield重新定义为肿瘤细胞暂时的有丝分裂阻滞。肿瘤休眠分为叁类:细胞休眠、血管生成休眠、免疫介导的休眠。目前的治疗方法以增殖肿瘤细胞为目标,但是,这种“觉醒”的想法是为了唤醒肿瘤细胞后杀之,可能会加重病人的病情。有些文献阐述肿瘤干细胞有可能是处于休眠的细胞,如果将肿瘤干细胞一直保持休眠状态,或者可以在休眠状态下被根除,这可能将是制定防止肝癌转移的新策略。免疫系统叁大功能之一免疫监视,主要指体内突变的肿瘤细胞。2002年Schreiber等人提出“肿瘤免疫编辑学说”,该学说将肿瘤免疫监视的过程分为3个主要阶段:清除阶段、平衡阶段和逃逸阶段。其中平衡阶段是指免疫系统与肿瘤细胞处于一种静态平衡的状态。免疫诱导的肿瘤休眠就是指在机体免疫系统作用下,肿瘤细胞出现增殖相关基因表达下调、细胞周期阻滞和代谢缓慢等现象。在免疫系统中发挥免疫效应的细胞主要是T细胞,NK细胞和巨噬细胞。在肿瘤微环境中存在着与肿瘤相关巨噬细胞,根据其表型和功能的不同,将巨噬细胞分成M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有较强杀菌和抑制肿瘤的作用;M2型巨噬细胞促进肿瘤的生长和转移是由于抑制抗肿瘤细胞免疫反应。之前文献报道M1型巨噬细胞通过影响肿瘤的迁移与侵袭,EMT的进程,血管生成和促进肿瘤细胞调亡,此外文献表明M1型巨噬细胞抑制结肠癌的生长,并使结肠癌细胞发生细胞周期阻滞,因此我们猜想M1型巨噬细胞可能会引起肿瘤细胞休眠来发挥抗肿瘤的作用,这是本课题的研究目的。针对以上问题我们根据肿瘤休眠的定义做了如下研究,第一部分是体外细胞实验,研究M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠;第二部分是体内动物实验,研究小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠从而抑制肿瘤的生长。研究方法和结果第一部分体外细胞实验,研究M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠一、M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞的增殖(一)采用transwell共培养体系,小室中THP-1细胞用PMA诱导贴壁后,再使用LPS和IFN-y诱导其分化为M1型巨噬细胞,然后将含有M1型巨噬细胞的小室放置在6孔板上层,小室的下层接种HuH-7细胞,共培养24小时后,将培养HuH-7细胞旧培养基换成含有EdU的培养基,培养2小时后进行流式细胞术检测细胞增殖的情况。结果表明M1型巨噬细胞上清刺激的肝癌细胞EdU阳性率降低。(二)按如上方法将THP-1诱导成M1型巨噬细胞后,弃掉旧培基换成新培基,培养24小时后获得相应的M1型巨噬细胞上清,将SMMC-7721、BEL-7402和HuH-7细胞分别种在96孔板中,用M1型巨噬细胞上清分别刺激叁种不同的肝癌细胞系48小时后,每天对细胞进行统计个数,一共统计2天。结果表明M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞增殖。二、M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞MKI-67的表达M1型巨噬细胞上清分别刺激SMMC-7721、BEL-7402、HuH-7细胞24小时后,收获RNA,通过RT-PCR检测MKI-67分子在mRNA水平的表达。以未刺激的肝癌细胞作为对照组,结果表明M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞MKI-67的表达。叁、M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞葡萄糖的消耗M1型巨噬细胞上清刺激HuH-7细胞48小时后,弃掉旧培基,用PBS清洗叁遍,加入新鲜的培养基,48小时后,收集培养基并离心,用葡萄糖试剂盒检测新鲜培养基和48小时后培养基中葡萄糖的含量,并计算两种培养基中葡萄糖浓度的差值,然后再计数两组细胞的数目,最后计算每个细胞所消耗的葡萄糖。采用未刺激组的肝癌细胞作为对照组,结果显示M1上清刺激组葡萄糖的消耗低于对照组。这表明M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞葡萄糖的消耗。四、M1型巨噬细胞上清可导致肝癌细胞发生细胞周期阻滞(一)M1型巨噬细胞上清导致肝癌细胞周期的改变将M1型巨噬细胞上清刺激BEL-7402细胞48小时后,用PI分别对M1上清刺激的肝癌细胞和未刺激肝癌细胞进行染色,细胞流式检测细胞周期变化,结果显示S期细胞数目降低,G2/M期细胞数目增多,肝癌细胞系阻滞于G2/M期。(二)M1型巨噬细胞上清导致肝癌细胞发生周期蛋白表达的变化将M1型巨噬细胞上清分别刺激SMMC-7721、BEL-7402、HuH-7肝癌细胞系48小时后,收获RNA,通过RT-PCR检测M1上清刺激的肝癌细胞和未刺激肝癌细胞CCNB1 mRNA水平表达,结果显示M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞CCNB1的表达。五、M1型巨噬细胞上清导致与肝癌细胞增殖相关信号通路活性的改变M1型巨噬细胞上清刺激SMMC-7721、BEL-7402、HuH-7肝癌细胞系48小时后,提取蛋白质,Western blot检测处理组和未处理组Erk1/2、p-Erk1/2、p38、p-p38的表达,结果表明M1型巨噬细胞上清上调p-Erk1/2的表达,对p-p38的表达没有影响。M1型巨噬细胞上清刺激SMMC-7721、BEL-7402肝癌细胞系48小时后,提取蛋白质,Western blot检测BEL-7402,SMMC-7721 细胞的AKT和p-AKT表达水平,结果显示M1型巨噬细胞上清下调p-AKT的表达。六、M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞的增殖具有可持续性(一)M1型巨噬细胞上清诱导肝癌细胞的增殖具有可持续性将M1型巨噬细胞上清刺激HuH-7细胞48小时后,与对照组HuH-7细胞分别接种在96孔板,每天统计细胞数目,一共统计4天,结果表明M1型巨噬细胞上清刺激处理的肝癌细胞持续处于增殖阻滞的状态。(二)M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞的克隆形成用M1型巨噬细胞上清分别刺激SMMC-7721和BEL-7402细胞48小时以后,与未处理的SMMC-7721和BEL-7402细胞分别种于6孔板中,1周后,用PBS清洗叁遍,甲醇固定30min,结晶紫染色30min,进行拍照。统计克隆形成的数目和每个克隆中细胞的数目,结果表明M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞的克隆形成。七、M1型巨噬细胞上清未导致肝癌细胞的衰老和调亡(一)M1型巨噬细胞上清未导致肝癌细胞衰老M1型巨噬细胞上清刺激SMMC-7721、BEL-7402和HuH-7细胞48小时后,用β-半乳糖苷酶试剂盒分别检测未刺激的肝癌细胞、M1型巨噬细胞上清刺激的肝癌细胞衰老的情况,结果表明M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞生长并不是细胞衰老引起的。(二)M1型巨噬细胞上清未导致肝癌细胞调亡用Western blot检测未处理肝癌细胞系、M1型巨噬细胞上清刺激的肝癌细胞调亡蛋白Bax表达情况,结果表明Bax并没有变化,M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞生长并不是细胞调亡引起的。八、M1型巨噬细胞上清对肝癌细胞增殖的抑制具有可逆性在96孔板中接种HuH-7细胞,用M1型巨噬细胞上清刺激HuH-7细胞48小时后,弃掉旧培养基后用PBS清洗叁遍,加入含10%胎牛血清的新鲜培养基,继续培养M1型巨噬细胞上清刺激48小时后的肝癌细胞,每天计数,结果显示6天以后这种处理的肝癌细胞恢复增殖状态,我们称这种细胞为刺激后恢复的细胞。我们将叁种不同状态的肝癌细胞:未刺激的细胞,M1型巨噬细胞上清刺激的细胞和刺激后恢复的细胞,分别种在96孔板中(5×104个/孔),每24小时统计一次细胞数目,一共统计48小时,结果表明M1型巨噬细胞刺激的肝癌细胞数目处于缓慢增殖的状态,刺激后恢复的细胞增殖能力恢复,结果表明M1型巨噬细胞上清对肝癌细胞增殖的抑制具有可逆性。EdU细胞增殖流式检测SMMC-7721肝癌细胞系叁种不同状态的阳性率,结果显示相对于未刺激细胞,M1型巨噬细胞刺激的肝癌细胞EdU阳性率降低,刺激后恢复的细胞EdU阳性率无明显差异。用PI分别对SMMC-7721、BEL-7402和HuH-7肝癌细胞系的叁种不同状态的细胞进行染色,细胞流式术检测细胞周期变化,结果显示相对于未刺激细胞,M1型巨噬细胞刺激的肝癌细胞S期细胞数目降低,G2/M期细胞数目增多,M1型巨噬细胞使肝癌细胞的周期阻滞于G2/M期,刺激后恢复的细胞周期无明显差异。九、M1型巨噬细胞上清抑制肝癌细胞干细胞样细胞的增殖活性M1型巨噬细胞上清刺激HuH-7细胞48小时后,HuH-7细胞培养基换成含有EdU的培养基,培养2小时后收集细胞,用CD13标记干细胞样的细胞,再用流式检测CD13标记干细胞样细胞的EdU阳性率,结果显示M1型巨噬细胞刺激的肝癌细胞干细胞样的EdU阳性率降低,表明其增殖活性下降。第二部分体外实验小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠一、小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞上清可导致肝癌细胞的周期阻滞我们将小鼠骨髓细胞用M-CSF诱导成巨噬细胞,然后用LPS刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞,诱导成M1型巨噬细胞,将培养基弃掉换成新鲜培养基,进一步培养24小时后获得相应的M1型巨噬细胞上清。用小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞上清刺激H22细胞48小时以后,用PI对H22小鼠肝癌细胞系进行染色,细胞流式术检测细胞周期变化,结果显示相对于未刺激细胞,M1型巨噬细胞刺激的H22细胞S期细胞数目降低,G2/M期细胞数目增多,M1型巨噬细胞使H22细胞的周期阻滞于G2/M期。二、小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠,抑制肿瘤生长(一)采用小鼠肝癌细胞H22或者M1型巨噬细胞与H22细胞的混合物,分别接种到小鼠皮下,成瘤后每叁天测量肿瘤体积一次,共六次,并对12天测量的肿瘤体积进行统计学分析,结果显示M1型巨噬细胞抑制肿瘤生长。(二)采用小鼠肝癌细胞H22或者M1型巨噬细胞上清刺激的H22细胞,分别接种到小鼠皮下,成瘤后每叁天测量肿瘤体积一次,共六次,并对18天测量的肿瘤体积进行统计学分析,处死小鼠以后,剥离小鼠的肿瘤,拍照,并称量肿瘤的质量,结果显示M1巨噬细胞上清处理的H22细胞所形成的肿瘤生长缓慢。结论一、M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠M1型巨噬细胞上清可抑制肝癌细胞的增殖并使代谢发生缓慢,这种增殖抑制作用是通过细胞周期阻滞而实现的,并非由细胞衰老或凋亡所致,并且这种增殖抑制作用具有可逆性和可持续性,表明M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞进入休眠状态。二、M1型巨噬细胞通过诱导肝癌细胞休眠抑制肝癌的生长小鼠肝癌细胞被M1型巨噬细胞诱导休眠后,接种小鼠皮下后肿瘤生长缓慢;M1型巨噬细胞和小鼠肝癌细胞共接种小鼠皮下后肿瘤生长缓慢。这表明M1型巨噬细胞可通过诱导肝癌细胞休眠来抑制肿瘤的生长。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-07）
刘超敏,王涛,郭亚楠,王玉洁,苏海翔[2]（2019）在《中药诱导血管性休眠防治肿瘤的研究进展》一文中研究指出肿瘤休眠是恶性肿瘤的生物学特征之一,也是肿瘤难以根治、复发转移的主要原因。在无法根除肿瘤细胞的情况下,可通过诱导肿瘤细胞休眠减缓生长、防止肿瘤复发或通过靶向存活机制、耐药机制诱导残留休眠细胞死亡。血管性休眠作为肿瘤休眠的一种类型,通过抑制内皮细胞增殖和血管生成,调节促血管生成因子和抗血管生成因子间的平衡,可以使肿瘤细胞退出生长周期,维持休眠状态,能显着抑制肿瘤的复发和转移。中医"久病入络"理论与西医肿瘤血管生成理念相似,通过中医药抑制促血管生成因子可诱导肿瘤血管性休眠,从而防止肿瘤复发。本研究对中医药诱导血管性休眠的相关机制进行综述,以期为中医药对肿瘤的精准治疗提供理论依据。(本文来源于《甘肃医药》期刊2019年03期）
文滨滨,张新昊,陈修德,高东升,朱翠英[3]（2019）在《叁种不同需冷量桃品种休眠诱导期生理变化》一文中研究指出以叁个不同需冷量的桃品种‘常绿桃’(无)、‘春捷’(102～120 C.U.)、‘青州蜜桃’(1200 C.U.)嫁接在同一桃树砧木‘山桃’上为实验材料,研究不同需冷量桃叶片在自然休眠诱导期(8月20日-11月20日)的生理变化。结果表明:在自然休眠诱导期,桃叶片的抗氧化保护酶活性、光合速率、可溶性糖和淀粉含量发生显着变化。随着休眠诱导的发展,超氧化物歧化酶(SOD)活性一直升高,在休眠诱导期后期(10月10日)‘常绿桃’高于‘春捷’和‘青州蜜桃’,过氧化物酶(POD)活性下降,不同需冷量桃无显着差异,过氧化氢酶(CAT)活性呈双峰变化且常绿桃峰值低于‘春捷’和‘青州蜜桃’;净光合速率呈下降趋势但常绿桃高于‘春捷’和‘青州蜜桃’且峰值分别是‘春捷’和‘青州蜜桃’的1.96和3.13倍;可溶性糖含量降低、淀粉含量增加但‘常绿桃’可溶性糖含量高于‘春捷’和‘青州蜜桃’、淀粉含量低于‘春捷’和‘青州蜜桃’。以上结果表明,‘常绿桃’在休眠诱导期保护酶活性、光合速率和可溶性糖含量均高于‘春捷’和‘青州蜜桃’,淀粉含量低于‘春捷’和‘青州蜜桃’。(本文来源于《山东农业大学学报(自然科学版)》期刊2019年01期）
曾鹏,陈天及,申江[4]（2017）在《使用麻醉剂及低温诱导休眠对鲫生理抑制作用影响的比较》一文中研究指出为研究比较使用MS-222、丁香酚等麻醉剂及低温休眠对鲫代谢抑制作用的影响,分别选取10、20、30 mg/L的MS-222、丁香酚以及0℃低温作为麻醉方式进行试验,分析鲫在麻醉作用下的生理变化,探讨不同麻醉方式的抑制效果。结果显示:30 mg/L的丁香酚及MS-222能有效抑制血糖浓度的升高,但是对于皮质醇水平没有明显的抑制作用;脑丙二醛(MDA)、肝脏过氧化氢酶(CAT)与鲫麻醉20 h后的呼吸频率正相关。脑MDA的结果显示,在相同浓度丁香酚的作用下,脂质过氧化程度较低,起到较好的代谢抑制作用。推荐20 mg/L丁香酚作为鲫成鱼长时间浸泡麻醉的浓度。(本文来源于《水产科技情报》期刊2017年06期）
张紫晋,王威,付青平,陈静[5]（2017）在《高温诱导对小麦种子休眠及相关基因表达的影响》一文中研究指出小麦穗发芽(Pre-harvest sprouting,PHS)严重降低籽粒产量、品质和种用价值。种子休眠与穗发芽抗性关系非常密切,是受多个基因控制和环境影响的复杂性状。本研究通过对灌浆期小麦进行5天的短期高温处理,了解高温胁迫对小麦籽粒休眠以及相关基因表达的影响。结果发现,高温诱导显着地普遍降低种子休眠水平,仅极少数品种表现温度不敏感的强休眠特性。高温条件下,主效休眠和穗发芽抗性基因Vp1-B、PM19-A1和TaPHS1的表达持续下降且极显着低于对照水平,而温度不敏感型休眠品种的PM19-A1基因表达呈先降低又快速恢复到对照水平的变化特征。高温胁迫后,经外源ABA处理的成熟种子TaPHS1表达量显着增加(表达峰值时间迟于对照),而休眠基因Vp1-B和PM19-A1的表达量几乎没有变化。以上结果表明,高温能显着抑制小麦休眠和穗发芽抗性主效基因的表达,并导致其对ABA诱导的表达响应推迟甚至消失,可能是高温降低种子休眠的主要原因,同时也部分解释了大田品种分子标记与种子休眠或穗发芽抗性鉴定不一致的现象,对抗穗发芽理论研究和育种应用具有重要参考价值。(本文来源于《第八届全国小麦基因组学及分子育种大会摘要集》期刊2017-08-07）
郇蕾[6]（2017）在《油桃花芽休眠诱导期PpFAR1/PpFHY3的表达分析及PpABI5上游调控因子的筛选》一文中研究指出光信号和植物激素ABA是诱导休眠的重要因子,FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3(FHY3)和它的同源基因FAR-RED-IMPAIREDRESPONSE 1(FAR1)是phyA信号途径中重要的正调控因子,参与远红光、ABA对拟南芥种子休眠的调节,然而FHY3/FAR1在木本植物花芽休眠中的表达尚不清楚;ABI5是ABA信号响应的关键基因,研究调控ABI5基因表达的转录因子对进一步阐述ABA信号转导及调控具有重要意义。本研究以‘中油四号’油桃花芽为材料,根据NCBI中拟南芥FAR1/FHY3登陆的基因,在拟南芥基因组数据库中查得FAR1/FHY3的蛋白序列,与已建立的桃全基因组氨基酸序列进行Blast序列比对,初步筛选出同源氨基酸序列的候选基因,将这些基因通过Pfam进行分析,去除无FAR1/FHY3保守结构域的基因序列;测定了5个同源基因在休眠诱导期的表达,并在休眠诱导期分别用ABA及远红光处理桃树,荧光定量检测了基因的表达量变化;以PpABI5启动子序列为诱饵,转化酵母细胞构建诱饵载体,构建桃花芽酵母单杂交cDNA文库,经同源重组筛选PpABI5启动子的上游转录调节因子。主要研究结果如下:1.桃中FAR1/FHY3的同源基因Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000在休眠诱导期均有上调,且受ABA诱导表达上调,受远红光诱导表达下调,而Prupe.2G327900在休眠诱导期表达下调,受ABA诱导下调,受远红光诱导上调。说明PpFRSs基因可能通过不同的模式参与ABA和远红光对油桃花芽休眠诱导的调控。2.构建的cDNA文库库容为1×107 CFU,插入片断长度平均在1500bp左右。酵母单杂筛选结果经测序和Blast同源性分析,获得PpDAM3和PpDAM5 2个与桃休眠相关的转录因子。通过互作验证进一步证实PpDAM3和PpDAM5与PpABI5存在潜在的结合关系,说明PpDAM3和PpDAM5可能通过与PpABI5互作参与ABA信号途径进而调控桃的休眠。(本文来源于《山东农业大学》期刊2017-05-08）
梁晓雨[7]（2017）在《γ干扰素诱导肿瘤再生细胞休眠的机制及相关应用的研究》一文中研究指出肿瘤细胞与免疫系统的相互作用被归纳为3E理论(Dunn et al.,2004;Schreiber et al.,2011),包括 Eradication(消灭),Equilibrium(平衡),Evasion(逃逸)。在机体中,肿瘤细胞在免疫因素的作用下会出现以上叁种生物现象:肿瘤细胞被免疫系统消灭清除;在免疫系统的监视下肿瘤细胞与机体达到均势;肿瘤细胞逃脱免疫系统的控制进而侵害全身(Romero et al.,2014)。免疫诱导的肿瘤休眠(tumordormancy),是指肿瘤细胞在机体免疫系统作用下,出现细胞周期阻滞、增殖相关基因表达下调、代谢减慢等现象。此种现象是肿瘤与机体免疫系统相互作用的过程中进入平衡稳定状态的集中体现(Sosa et al.,2014),与免疫监视这一假说相呼应。目前的科学研究由于缺少有效公认的肿瘤休眠的体内外模型,免疫诱导的肿瘤休眠缺乏有效的手段研究其深入的机制。在对于肿瘤细胞休眠这一领域的科学研究中,目前的研究成果仅限于通过运用中和抗体和转基因动物探究该现象的存在,及确定与之相关的免疫分子如Interferonγ(伽马干扰素,IFNγ)。Interferonγ作为免疫效应分子,在肿瘤免疫中,IFNγ主要由肿瘤微环境中的杀伤性T细胞(CTLs)所分泌,对控制肿瘤的生长具有重要的作用(Akira etal.,2006;Dunn etal.,2006),可能会引起肿瘤细胞的休眠。但IFNγ如何作用于肿瘤细胞休眠,其内在的作用机制尚未阐明。肿瘤细胞具有异质性,不同的亚群具有不同的特性。其中,肿瘤干细胞即肿瘤再生细胞(tumorigenic cells,TRCs)是一群具有很强成瘤能力和增殖分裂能力的细胞,且表现为较强的耐药特性,与肿瘤的复发转移具有紧密关系(Enver et al.,2009;Visvader and Lindeman,2008)。目前尚未有研究证明肿瘤干细胞是否存在肿瘤休眠这一现象,且其内在的机制也不清楚。本课题研究旨在利用本课题组已经建立起来的3D(软叁维胶体外扩增培养肿瘤再生细胞)技术,来探究以下叁个问题:IFNγ能否诱导肿瘤的休眠;IFNγ可具体诱导哪群肿瘤细胞休眠;IFNγ诱导肿瘤细胞休眠的机制。本论文分为三部分:1.IFNγ体外诱导肿瘤干细胞的休眠的探究;2.IFNγ诱导肿瘤干细胞休眠的机制探究;3.运用相关分子的抑制剂逆转肿瘤休眠对肿瘤细胞影响的探究第一部分:IFNγ体外诱导肿瘤干细胞的休眠的研究目的:研究IFNγ是否可诱导肿瘤干细胞休眠,并区别于传统2D培养肿瘤细胞;且探究IFNγ诱导的肿瘤干细胞是否存在对化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate)和紫杉醇(Paclitaxel)的耐药性。方法:该研究选用本实验组之前使用过的小鼠黑色素瘤细胞系B16及叁文鱼来源的纤维蛋白原建立的3D肿瘤干细胞培养方法(Liu et al.,2012),来建立体外模型。1.IFNγ处理小鼠来源的B16黑色素瘤细胞、H22肝癌细胞系及CT26结肠癌细胞系:1)1OOng/ml IFNγ分别作用于传统2D培养的B16细胞、H22细胞及CT26细胞72h;2)100ng/ml IFNγ作用于3D培养的B16细胞、H22细胞及CT26细胞72h,检测其对两种不同培养模式的叁种肿瘤细胞增殖及凋亡代谢情况。2.化疗药物甲氨蝶呤(MTX)和紫杉醇(Paclitaxel)分别处理3D培养的B16细胞:1)细胞对照组:2D培养B16细胞+PBS;2D培养B16细胞+IFNγ;2D培养B16细胞+MTX;2D培养B16细胞+IFNγ+MTX;2)实验细胞组:3D培养B16细胞+ MTX;3D培养B16细胞+IFNγ+MTX;IFNγ预处理72h的3D培养B16细胞+MTX+ IFNγ;IFNγ预处理72h后3D培养B16细胞+MTX。紫杉醇分组同甲氨蝶呤。结果:1.用不同浓度的IFNγ处理传统2D培养皿和3D培养的B16细胞、H22细胞和CT26细胞96h后,2D肿瘤细胞的凋亡明显,3D细胞未见明显凋亡。3D细胞主要表现为克隆变小,细胞周期变慢,葡萄糖消耗量下降,及增殖相关基因下调。2.本研究选用常规化疗药物甲氨蝶呤和紫杉醇处理IFNγ诱导的休眠的肿瘤细胞和正常培养的2D细胞和3D细胞,发现休眠的肿瘤细胞有更强的耐药性。第二部分:IFNγ在诱导肿瘤细胞休眠的机制目的:在已经建立的IFNγ体外诱导肿瘤休眠模型的条件下探究其内在机制方法:在已经建立IFNγ体外诱导肿瘤休眠的模型中,我们运用PCR,Western-blot,质粒构建,病毒包装,CRISPR-Cas9,免疫荧光,流式分析、分选等分子生物学、细胞生物学的手段来鉴定并验证相关信号通路及机制。结果:1.根据文献报道及PCR验证,我们确定了吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在被IFNγ处理过的B16肿瘤细胞中发生了很大的改变(Takikawa et al.,1990),并且TRCs被IFNγ处理后IDO上调相较于普通2D细胞更为明显,说明IDO在TRCs的休眠的过程中具有重要作用;2.我们将过表达IDO的TRCs进行分析,发现其细胞克隆大小及细胞周期均发生较明显的变化,出现了克隆变小及周期变慢的现象;3.IDO是一种催化酶,主要催化色氨酸(Tryptophan,Trp)的代谢,使其代谢成为犬尿氨酸(kynurenine,Kyn),我们用200uM到500uM浓度的Kyn处理TRCs也得到了克隆变小及周期减慢的结果,说明Kyn在TRCs的休眠中扮演着重要的角色;4.我们从文献中得知,Kyn为多环芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,Ahr)的配体,可以导致Ahr诱导下游基因的表达(Opitz et al.,2011),其中可能包括细胞周期抑制相关的蛋白,我们通过免疫荧光、western-blot及荧光素酶实验确定了 Ahr在TRCs中得到激活;5.同时我们用western-blot筛选相关周期蛋白,发现在IFNγ处理后,Cdknlb(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B,P27kip)出现了 很明显的变化,而其他周期蛋白没有较为明显的变化,说明P27可能在休眠中扮演重要的角色;6.我们用Kyn处理TRCs72小时后用western-blot检测P27的表达水平,发现其出现了明显上调,并同时调取P27基因的启动子,构建荧光素报告质粒,并同时联合AHR基因行瞬时转染后,用Kyn处理后检测,发现荧光素信号在AHR、Kyn及IFNγ处理后有明显增强,说明IFNγ对P27的调控主要是通过IDO-Kyn-AHR这一信号通路;7.经典的 IFNγ 信号主要通过 STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)发挥作用,并且主要对肿瘤细胞引起凋亡的作用,我们通过western-blot及免疫荧光及流式证实了这一信号通路在普通培养的B16中存在,但在休眠的细胞中,这一通路被明显抑制,而且我们通过Ip-western发现IFNy-Stat1这一信号通路与IFNγ-IDO-AHR-P27这一信号通路存在交互作用,即P27结合p-STAT1蛋白阻止其入核;8.我们也在后来建立的IDO、AHR、P27敲低敲除细胞系中进一步验证了这一结论。第叁部分:在体外实验中运用相关分子的抑制剂逆转肿瘤休眠目的:通过运用相关分子的抑制剂联合IFNy看能否打破肿瘤细胞的休眠,并对肿瘤治疗提出新的想法方法:运用3D培养、western-blot及流式检测等相关手段检测相关分子抑制剂联合IFNγ处理后的肿瘤细胞的增殖凋亡情况。结果:1.我们联合 IDO 抑制剂 1-MT(1-Methyl-L-tryptophan)及 IFNγ 处理3D培养的B16细胞后,其出现克隆数减少,克隆大小变小的表现,并在整体细胞水平及分子水平出现了凋亡的增加,说明IFNγ联合IDO抑制剂可以有效的打破休眠,杀伤肿瘤;2.我们联合AHR抑制剂DMF(3',4'-Dimethoxyflavone)及IFNγ处理3D培养的B16细胞后,得到了与IDO抑制剂相同的结果,即休眠打破凋亡增加。说明这两个抑制剂在今后的免疫治疗中可能有较好的前景。总结:肿瘤休眠这一现象在肿瘤的发生、发展、转移及治疗预后中均有重要的意义,免疫所引起的休眠,更是这一现象的很好的体现,我们通过运用3D培养肿瘤再生细胞这一方法,很好的在体外模拟了肿瘤休眠这一过程,即用IFNγ在体外处理3D培养的细胞72小时,就会诱导其进入休眠,并在进一步的研究中我们发现,在诱导肿瘤体外休眠的过程中,吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO),犬尿氨酸(kynurenine,kyn),芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)即IDO-kyn-AhR这一代谢调控的转录因子信号通路发挥着重要的作用。IFNγ作用于肿瘤再生细胞后,可诱导其进入休眠,具体表现为IFNγ诱导肿瘤再生细胞内IDO与AHR的表达上调,IDO的表达上调继而产生大量的内源性的Kyn,Kyn与AhR结合并激活AhR,AhR进入细胞核并结合到相应基因的启动子上,导致相关周期阻滞基因的表达,从而产生细胞周期的阻滞。我们通过进一步的筛选,发现在这一现象休眠之中,细胞周期阻滞蛋白P27出现了很明显的变化,并且受到AhR基因的转录调控。IFNγ-IDO-AhR-P27这一信号通路对肿瘤再生细胞的休眠具有巨大的作用,我们同时通过运用相关抑制剂联合IFNγ,发现肿瘤的休眠可以被打破,并取得了较好的治疗效果,为今后临床上对肿瘤的治疗提出了新的思路。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2017-05-01）
尹晓南[8]（2017）在《IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠模型的建立及其机制初探》一文中研究指出恶性肿瘤是现代社会人类常见的死亡原因之一,研究肿瘤的生物学特性对于攻克肿瘤有着重要的意义。2011年Weinberg提出恶性了肿瘤10大特征,在原有的6个特征的基础上,新增了避免免疫摧毁、促进肿瘤相关炎症、细胞能量代谢异常和基因组不稳定和突变4大特征。其中避免免疫摧毁是恶性肿瘤和免疫系统不断博弈的结果,也是肿瘤生物治疗的核心。肿瘤和免疫系统的之间关系错综复杂,1970年Burnet提出了“肿瘤免疫监视”假说,2002年Schreiber等人又在此基础上不断完善,提出了“肿瘤免疫编辑学说”。肿瘤免疫编辑学说更加全面准确的阐述了肿瘤和免疫系统的相互作用,将整个肿瘤免疫监视的过程分为3个主要阶段:清除阶段、平衡阶段和逃逸阶段。其中平衡阶段是3个阶段中最关键的部分,与后续的肿瘤复发有着直接的关系,在平衡阶段,免疫系统有可能将肿瘤细胞限制在休眠状态。肿瘤休眠是一个临床概念,主要是指经过手术治疗的肿瘤患者,残余的肿瘤细胞在体内长期存在而又没有明显生长的一种状态。肿瘤休眠是肿瘤发生发展过程中的重要组成部分,也是肿瘤复发的根本原因,因此将休眠的肿瘤细胞成为“恶魔的种子”。虽然这一概念已经提出很长时间,但是其机制却不清楚,原因可能在于:研究模型比较匮乏,至今为止没有很理想的肿瘤休眠模型去模拟这一临床行为;而且由于肿瘤的异质性的存在,使得研究必须要深入到肿瘤细胞群体的各个亚群;再者免疫系统中发挥作用的免疫细胞及细胞因子更是错综复杂,大大提高了研究的难度。本研究采用体外共培养肿瘤特异性CTL和肿瘤细胞,观察CTL对不同亚群肿瘤细胞的作用效果,发现了特异性CTL不能杀伤TRCs,但是可诱导TRCs进入休眠。在此基础上筛选出了 IFN-γ这一细胞因子,以IFN-γ为切入点,建立了体内体外肿瘤休眠的模型,在一个新的层次证明了肿瘤免疫监视的存在,具有重要的免疫学和生物学价值。本课题的研究内容主要包括叁个部分:(1)IFN-γ体外诱导肿瘤再生细胞休眠;(2)IFN-γ体内诱导肿瘤再生细胞休眠;(3)IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠机制初探。目的:IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠模型的建立及机制初探方法:取共培养上清(CM)、PBS培养TRCs,比较TRCs克隆数目、大小的变化,FCM分析CM对TRCs的杀伤以及对TRCs细胞周期的影响;利用ELISA检测CM中各种因子的含量,使用中和抗体筛选导致TRCs的增殖受到影响的细胞因子;小鼠皮下接种OVA-B16黑色素瘤TRCs,FCM分析不同组瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs细胞的细胞周期;5d、10d分别取相应位置小鼠皮肤进行免疫组化、HE染色,统计肿瘤大小;体外3D纤维蛋白软凝胶培养B16 TRCs,接种至小鼠皮下,构建小鼠荷瘤模型,待肿瘤长至5 X 5mm时,给予小鼠皮下注射IFN-γ,取瘤组织固定切片,WB、Confocal分析IDO1、AhR蛋白表达水平及表达变化;取肿瘤组织,将细胞进行3D纤维蛋白软凝胶培养,5d后,统计各组克隆形成数目;联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂,分析肿瘤组织中TRCs的比例以及细胞周期水平变化。长时间联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,观察小鼠肿瘤生长情况以及生存期变化。结果:1.经过CM培养后的TRCs在2d和4d克隆体积大小比较没有统计学差异(P>0.05),且与PBS组培养后的TRCs相比,克隆数目比较没有统计学差异(P>0.05),但是CM培养的TRCs克隆体积远远小于PBS组培养的TRCs,两组间比价具有统计学差异(P<0.01)。FCM细胞周期分析显示,相对PBS组(G0/G1:47.21%),CM组TRCs处于G0/G1期的比例提高至77.98%,两组间比较具有统计学差异(P<0.01)。2.ELISA 检测 CM 显示上清中存在 IFN-γ(680.25 pg/mL)、TNF-a(170.40 pg/mL)、IL-2(15 pg/mL)、IL-10(32 pg/mL)。而使用 IFN-γ 中和抗体后,FCM分析,OT-I CTL对OVA-B16黑色素瘤细胞的杀伤明显降低,由30.62%下降至12.88%,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01),而对OVA-B16黑色素瘤TRCs的杀伤两组数据比较无统计学差异(P>0.05)。FCM细胞周期分析显示,相对CM组(G0/G1:77.65%),anti-IFN-γ 组 TRCs 处于 G0/G1 期的比例下降至 52.81%,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01)。3.FCM分析显示相对于PBS组(G0/G1:30.12%),CTL组处理后瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至76.53%,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01);相对于 CTL 组(G0/G1:75.98%),anti-IFN-γ/CTL 组处理后瘤块内OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期下降至51.94%,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01);相对于PBS组(G0/G1:17.20%),IFN-γ组处理后瘤块内B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至66.80%,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01)。4.免疫组化、HE染色显示PBS组肿瘤大小20d明显大于5d,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01);而IFN-γ组肿瘤大小20d与5d变化不明显,两组间数据比较没有统计学差异(P>0.05);IFN-γ组肿瘤大小10d与5d变化不明显,两组间数据比较没有统计学差异(P>0.05),而IFN-γ/anti-IFN-γ组肿瘤大小l0d明显大于5d,两组间数据比较具有统计学差异(P<0.01)。5.Confocal、Western Blot 结果显示,经过 IFN-γ处理之后,Confocal、Western Blot检测得IDO1水平明显上调,AhR明显入核;与正常组相比,IFN-γ组的TRCs克隆形成数目无明显变化(P>0.05),联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT、DMF)组的TRCs克隆形成数目明显减少(P<0.01);FCM分析显示,与正常组相比,IFN-γ组细胞大多数(34%)处于G0/G1期,而联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT、DMF)后,大多数TRCs处于sub-GO期。各组之间相比具有统计学差异(P<0.01);动物实验结果显示,长时间联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,可以明显减小肿瘤体积、延长荷瘤小鼠生存期,各组间数据比较具有统计学差异(P<0.01)。小结:肿瘤特异性OT-ICTL可以明显杀伤OVA-B16黑色素瘤细胞,但是总有一部分细胞不能被杀伤,而这群没有被杀伤的细胞经证实即为TRCs。虽然CTL不能杀伤TRCs,但是CTL可以分泌大量的IFN-γ,利用IFN-γ将TRCs诱导至休眠状态。体外结果进一步证实,IFN-γ的确能够诱导TRCs进入休眠状态,使得TRCs的克隆大小维持不变、细胞周期阻滞在G0/G1期。肿瘤特异性OT-I CTL在体内也可以将OVA-B16黑色素瘤TRCs诱导至休眠,这一作用可以被anti-IFN-γ所阻断,说明CTL是通过INF-γ来诱导TRCs进入休眠的,进一步的体内实验证实,INF-γ的确也可以诱导TRCs至休眠状态。IFN-γ可以显著上调TRCs的IDO1表达,通过上调IDO1,诱导AhR入核使得TRCs进入休眠状态,而联用IFN-γ以及IDO信号通路的抑制剂(1MT/DMF)治疗荷瘤小鼠,可以明显减小肿瘤体积、延长荷瘤小鼠生存期。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2017-05-01）
郇蕾,王旭旭,刘文海,李玲,高东升[9]（2017）在《油桃花芽自然休眠诱导期FAR1/FHY3基因的表达分析》一文中研究指出FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3(FHY3)和它的同源基因FAR-RED-IMPAIREDRESPONSE 1(FAR1)参与远红光、脱落酸(Abscisic acid,ABA)对拟南芥种子休眠的调节,然而FHY3/FAR1在木本植物花芽休眠中的表达尚不清楚。本研究以八年生‘中油四号’油桃花芽为材料,利用NCBI找出桃树上的FAR1/FHY3同源基因,测定了同源性最高的5个基因在休眠诱导期的表达,并在休眠诱导期分别用脱落酸及远红光处理桃树,荧光定量检测了基因的表达量变化。结果表明,桃中同源性最高的Prupe.3G186100、Prupe.3G186200、Prupe.4G115100、Prupe.3G186000 4个基因在休眠诱导期均有上调,且受ABA诱导表达上调,受远红光诱导表达下调,而Prupe.2G327900在休眠诱导期表达下调,受ABA诱导下调,受远红光诱导上调。我们推测,Pp FRSs基因可能通过不同的模式参与油桃花芽休眠诱导的调控。(本文来源于《山东农业大学学报(自然科学版)》期刊2017年02期）
李兰芝,吴坤鑫,张家明[10]（2016）在《紫萍休眠体的萌发诱导研究》一文中研究指出以紫萍DW2501-4和HB0301产生的休眠体为材料,利用单因子试验和正交试验研究不同蔗糖含量、不同的GA3浓度、不同的温度和光照条件诱导紫萍休眠体萌发的最适条件。结果表明,在1%~5%质量浓度蔗糖范围内,高的蔗糖质量浓度会抑制休眠体的萌发,质量浓度为1%、2%的蔗糖对DW2501-4和HB0301休眠体萌发诱导效果最好。在20~32℃,DW2501-4休眠体在32℃下萌发效果最佳,HB0301休眠体在28℃下萌发效果最佳。在0~10 mg/L范围内GA3能促进DW2501-4和HB0301休眠体的萌发,最佳浓度为0.1 mg/L。DW2501-4和HB0301在光—暗周期为24 h—0 h和16 h—8 h下萌发势最高,叶状体数量最多。3种日照时间下萌发率差异不显着,但长日照可缩短休眠体萌发时间,促进叶状体繁殖。DW2501-4和HB0301-4休眠体的最佳萌发诱导条件是0.5倍Hoagland’s培养基中添加1%蔗糖和0.1 mg/L的GA3,在28℃,光—暗周期为16 h—8 h的条件下培养。(本文来源于《江苏农业科学》期刊2016年12期）
休眠诱导论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肿瘤休眠是恶性肿瘤的生物学特征之一,也是肿瘤难以根治、复发转移的主要原因。在无法根除肿瘤细胞的情况下,可通过诱导肿瘤细胞休眠减缓生长、防止肿瘤复发或通过靶向存活机制、耐药机制诱导残留休眠细胞死亡。血管性休眠作为肿瘤休眠的一种类型,通过抑制内皮细胞增殖和血管生成,调节促血管生成因子和抗血管生成因子间的平衡,可以使肿瘤细胞退出生长周期,维持休眠状态,能显着抑制肿瘤的复发和转移。中医"久病入络"理论与西医肿瘤血管生成理念相似,通过中医药抑制促血管生成因子可诱导肿瘤血管性休眠,从而防止肿瘤复发。本研究对中医药诱导血管性休眠的相关机制进行综述,以期为中医药对肿瘤的精准治疗提供理论依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
休眠诱导论文参考文献
[1].庄梦玮.M1型巨噬细胞诱导肝癌细胞休眠[D].山东大学.2019
[2].刘超敏,王涛,郭亚楠,王玉洁,苏海翔.中药诱导血管性休眠防治肿瘤的研究进展[J].甘肃医药.2019
[3].文滨滨,张新昊,陈修德,高东升,朱翠英.叁种不同需冷量桃品种休眠诱导期生理变化[J].山东农业大学学报(自然科学版).2019
[4].曾鹏,陈天及,申江.使用麻醉剂及低温诱导休眠对鲫生理抑制作用影响的比较[J].水产科技情报.2017
[5].张紫晋,王威,付青平,陈静.高温诱导对小麦种子休眠及相关基因表达的影响[C].第八届全国小麦基因组学及分子育种大会摘要集.2017
[6].郇蕾.油桃花芽休眠诱导期PpFAR1/PpFHY3的表达分析及PpABI5上游调控因子的筛选[D].山东农业大学.2017
[7].梁晓雨.γ干扰素诱导肿瘤再生细胞休眠的机制及相关应用的研究[D].北京协和医学院.2017
[8].尹晓南.IFN-γ诱导肿瘤再生细胞休眠模型的建立及其机制初探[D].北京协和医学院.2017
[9].郇蕾,王旭旭,刘文海,李玲,高东升.油桃花芽自然休眠诱导期FAR1/FHY3基因的表达分析[J].山东农业大学学报(自然科学版).2017
[10].李兰芝,吴坤鑫,张家明.紫萍休眠体的萌发诱导研究[J].江苏农业科学.2016