劳燕霞
（广州王老吉药业股份有限公司广东广州510450）
【摘要】目的优化克感利咽口服液挥发油提取工艺，并对挥发油进行薄层鉴别和高效液相含量测定。方法采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，以挥发油收得率和挥发油中胡薄荷酮含量的综合得分为考察指标，选择提取前浸泡温度、浸泡时间及提取时间为考察因素，运用正交试验优选工艺条件；采用薄层色谱法对挥发油中薄荷脑进行定性鉴别，高效液相色谱法对挥发油中胡薄荷酮进行定量测定。结果优化的工艺条件是浸泡温度60℃、浸泡时间60分钟、提取2.5小时；薄层色谱鉴定薄荷脑特征性强；色谱条件：色谱柱：PhenomenexLuna（250mm×4.6mm×5μm），流动相：甲醇：水(70∶30)，流速：1ml/min，柱温：35℃，检测波长为252nm，胡薄荷酮在2.9212～186.955μg之间呈良好的线性关系，回收率为99.10%。结论提取工艺合理、可行；建立的薄层鉴别方法及HPLC定量方法准确、简便。
【关键词】克感利咽口服液挥发油提取工艺薄荷脑胡薄荷酮薄层鉴别高效液相色谱法
【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）10-0048-02
StudiesontheextractionprocessandqualityofvolatileoilofKeganLiyanOralLiquid
LAOYan-xia
(GuangzhouWangLaoJiPharmaceuticalCompanyLimited,Guangzhou510450,China)
【Abstract】ObjectiveTooptimizetheextractiontechnologyofvolatileoilofKeganLiyanOralLiquid,andthenqualitativeandquantitativeanalysisofvolatileoilweremeasuredbythinlayerchromatography(TLC)andhighperformancethinlayerchromatography(HPLC)respectively.Methodssteamdistillationwereusedintheexperiment,whichwasperformedwithvolatileoilyieldandpulegonecontentastheindexandthesoakingtemperature,thesoakingtime,thetimeofimmersionasaffectingfactors,thenoptimizingprocessconditionbyorthogonaltest.ThequalitativeidentificationofmentholwasperformedbyTLC,andthequantitativedeterminationofPulegonebyHPLC.ResultsOptimalconditionsweresoaktemperatureof60℃,soaktimeof60minutes,extractiontimeof2.5hours;identificationofmentholbyTLCwascharacteristicstrong;theseparationwasperformedonPhenomenexLuna（250mm×4.6mm×5μm）.Themobilephaseconsistedofmethanol-water(70:30)attheflowrateof1mL/min.Thecolumntemperaturewas35℃andwavelengthwassetat252nm.therewasagoodlinearrelationshipinthescopeof2.9212～186.955μgforpulegone,Therecoverywas99.10%.Conclusions:Theextractiontechnologyisreasonableandfeasible,andthedevelopedTLCandHPLCmethodsareaccurateandsimple.
【Keywords】KeganLiyanOralLiquidvolatileoilextractionprocessmentholPulegoneTLCidentificationHPLCdetermination
克感利咽口服液是我公司独家生产的中药保护品种之一，1999年正式投产上市。具有疏风清热，解毒利咽的功能。为病毒性感冒之良药[1～4]。处方中薄荷、荆芥、金银花、防风四味药材采用水蒸气蒸馏提取挥发油。由于挥发油提取受多种因素的影响，导致挥发油收得率不稳定，影响产品的质量。本研究通过优化完善克感利咽口服液挥发油提取工艺，选定可控的工艺参数，提高挥发油的提取收得率，并将挥发油中所含薄荷脑进行薄层色谱法鉴别，也因荆芥和薄荷药材同时含有胡薄荷酮，采高效液相色谱法测定挥发油中胡薄荷酮总含量。从而更有效地对提取的挥发油质量进行控制。
1仪器与试剂
YC-020实验型多功能提取罐(上海雅程仪器设备有限公司)；高效液相色谱仪：安捷伦1100；色谱柱：PhenomenexLuna（4.6mm×250mm，5μm）；电子天秤：Sartorius-CPA225D，十万分之一；甲醇：色谱纯，MerckKGaA；水为超纯水；其余试剂均为分析纯；薄层板：Merck薄层板德国进口；胡薄荷酮、薄荷脑（用于含量测定，批号：111706-201205，110728-200506，中国药品生物制品检定所购进）；克感利咽口服挥发油及缺荆芥、薄荷药材的阴性样品（由本公司提供）。
2方法与结果
2.1挥发油提取工艺研究
2.1.1提取方法按处方比例取薄荷、荆芥、金银花、防风饮片约1kg，称定重量，至提取罐内，按预设的技术参数进行提取，在油水分离器分段收集挥发油，称定重量，计算收得率，平行3次实验，结果见表2。
2.1.2正交试验根据预试结果，并结合生产实际情况，以挥发油提取收得率和挥发油中胡薄荷酮含量的综合得分为考察指标，对提取时间、浸泡温度、浸泡时间等三素三水平，选用L9(34)正交表进行优化实验。因素水平及实验安排与结果见表1-2。根据克感利咽口服液提取挥发油药物的数量及挥发油中胡薄荷酮的相对含量，确定挥发油收得率的权重为0.6，胡薄荷酮含量的权重为0.4，综合得分X3=(X1j&pide;0.42)×100×0.6＋(X2j&pide;2.61)×100×0.4。
表1因素水平
F0.01(2,2)=99；F0.05(2,2)=19。**P﹤0.01，*P﹤0.05。挥发油收得率与胡薄荷酮只列出均方和F值。
由直观和方差分析可知，因素A对综合得分及挥发油收得率有极显著的影响(P<0.01)，因素A对胡薄荷酮含量有显著的影响(P<0.05)，因素B对综合得分、挥发油收得率及胡薄荷酮含量有显著的影响(P<0.05)，因素C对考察指标无显著影响(P>0.05)。三个因素对考察指标影响的顺序为：A>B>C，各因素不同水平的影响顺序，对挥发油收得率的影响顺序为：A2>A3>A1、B3>B2>B1、C1=C2>C3；对胡薄荷酮的影响顺序为：A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C2>C1；对综合得分的影响顺序为：A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2。由于因素C对考察指标无显著影响，考虑实际生产情况，经综合分析，拟定最佳工艺条件为A2B3C1，即提取时间2.5h，浸泡温度60℃，浸泡时间60分钟。为适应生产实际，取同批药材，5倍试验量，对优选的工艺条件进行5批验证试验，挥发油提取收得率分别为0.46%、0.42%、0.44%、0.41%、0.45%，平均为0.44%；胡薄荷酮含量分别为21.804mg?ml-1、20.615mg?ml-1、21.721mg?ml-1、21.242mg?ml-1、22.217mg?ml-1，平均为21.52mg?ml-1%。随即进行3批生产试验，挥发油提取收得率分别为0.43%、0.42%、0.45%，平均为0.43%；胡薄荷酮含量分别为21.524mg?ml-1、20.723mg?ml-1、22.046mg?ml-1，平均为21.431mg?ml-1。说明优选的工艺条件重现性好、可操作性强。
2.2挥发油中薄荷的薄层色谱鉴别：取挥发油样品0.1ml，置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，同法制成缺薄荷药材的阴性对照溶液。另取薄荷脑对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录ⅥB）试验[5]，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。结果见附图1。
图1：薄荷药材的薄层色谱图
2.3.2检测波长的确定：Agilent1100高效液相色谱仪，DAD检测器，对胡薄荷酮对照溶液进行光谱扫描，波长范围为200～400nm，结果胡薄荷酮在252nm处有最大吸收，故确定胡薄荷酮测定波长为252nm。结果见图5。
2.3.3溶液配制
2.3.3.1对照品溶液的配制：取胡薄荷酮对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1ml含20μg的溶液，即得。
2.3.3.2供试品溶液的配制：精密量取挥发油样品0.1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，摇匀，即得。
2.3.3.3阴性对照溶液的制备：取缺荆芥和薄荷药材的双阴性样品，同法制成阴性对照溶液。
2.3.4线性关系考察：取胡薄荷酮对照品适量，分别配制成每ml各含2.9212μg，5.8423μg，11.6847μg，23.3694μg，46.7387μg，93.4775μg，186.9550μg，进样量为10μl。以对照品量（μg）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线；胡薄荷酮的线性方程：Y=30.925x＋21.431，R2=0.9998。结果胡薄荷酮在2.9212～186.9550μg范围内呈良好的线性关系。
2.3.5重复性试验：精密称取同一批号样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份，并测定，计算。胡薄荷酮含量的RSD为0.98%。
2.3.6稳定性试验：取同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、12、24h分别进样，测定，计算，结果胡薄荷酮含量的RSD为1.88%。说明制备的供试品溶液至少在12h内稳定。
2.3.7加样回收率考察：精密量取本品0.05ml（已知含量：20.6348mg?ml-1），再分别精密加入一定量胡薄荷酮对照品溶液，测定，并计算回收率，结果见表4。
表4：加样回收率考察结果
3讨论
3.1实验通过对克感利咽口服液挥发油提取收得率与挥发油中胡薄荷酮含量的综合分析评价，在不同提取条件下采用正交法进行优化研究，发现提取时间（P<0.01）是影响提取效率主因素，提取前浸泡温度（P<0.05）是影响提取效率的重要因素，而浸泡时间（P﹥0.05）的影响较小，根据各因素水平影响的关键性，结合实际生产成本控制等情况，确定的较佳提取工艺技术参数为：浸泡温度为60℃，浸泡时间为60分钟，提取时间为2.5小时。按此工艺条件进行验证与试产，结果表明该工艺稳定可行，收得率高。
3.2由实验结果可见，挥发油提取收得率、挥发油中胡薄荷酮含量、综合得分在主要因素提取时间与浸泡温度不同水平的变化趋势一致，经相关分析，其相关系数R=0.9252，说明挥发油提取收得率与胡薄荷酮含量有较高的正相关程度。
3.3挥发油提取的药材主要有薄荷和荆芥，许多文献也报道了检测薄荷和荆芥的方法[6-8]。本实验采用薄层色谱法和高效液相色谱法对克感利咽口服液挥发油中主要有效成分进行了研究，建立了挥发油中薄荷脑的薄层色谱鉴别方法和胡薄荷酮的定量分析方法，该定性定量检测方法准确简便，为该品种质量标准完善提高提供了一定的依据。
参考文献
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