长沙医学院，基础医学院410219
摘要：能量耦合因子转运蛋白是一类新发现的，主要负责微量营养物质转运的蛋白质复合体，隶属于ABC转运蛋白超家族。金黄色葡萄球菌生物素转运蛋白BioY作为能量耦合因子转运蛋白中的底物结合蛋白，能够特异性识别底物生物素。我们通过滤纸片抑菌圈试验，发现表达金黄色葡萄球菌BioY的大肠杆菌细胞对红霉素，链霉素及链霉素的敏感性都显著增加。我们推定是BioY在宿主细胞表面形成了功能性通道以帮助小分子抗菌试剂进入细胞。我们对表达BioY突变体的细胞也进行了试验，发现表达D157K/K160E的大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性与未诱导细胞一致，我们认为产生该现象的原因与D157及K160氨基酸位点起关键性“门控”作用有关，这为我们进一步研究BioY的转运机制奠定基础。
关键词：能量耦合因子转运蛋白，金黄色葡萄球菌，BioY，滤纸片抑菌圈试验，门控
TheIdentificationandFunctionalStudyoftheBiotinTransporterBioYfromStaphylococcusaureus
WeiweiTang,KunTian,ZiqingZhu,MeilingLiu*
ChangshaMedicalUniversity,SchoolofBasicMedicalSciences,410219
Abstract:Energy-couplingfactortransportersareanewlydefinedclassofABCtransporters,mainlyresponsiblefortheuptakeofmicronutrients.TheStaphylococcusaureusbiotintransporterBioYasthesubstratebindingproteincanspecificallyrecognizethesubstratebiotin.Byapplyingafilterdiskdiffusionassay,wesurprisinglydiscoveredthatthesusceptibilityofEscherichiacolitoantimicrobialagenterythromycin,streptomycin,andchloramphenicolweresignificantlyincreasedwhenStaphylococcusaureusBioYwasheterologouslyoverexpressedinthecells.WereasonedrecombinantSaBioYadoptedafunctionalchannelinthemembraneofE.coliforlowmolecularweightantimicrobialagentstodiffusethrough.AlibraryofSaBioYmutantswerealsoscreenedinthisassayandtheoverexpressionofD157K/K160Eshowcasedthesamephenotypewithun-inducedone.WeproposedthatD157andK160playedas“gating”aminoacidresiduesduringthetransportation,whichpavesthewayforfurtherstudyofthetransportmechanismofBioY.
Keywords:energy-couplingfactortransporter,Staphylococcusaureus,BioY,filterdiskdiffusionassay,gating
能量耦合因子（Energy-couplingfactor,ECF）转运蛋白是一类新发现的，隶属于ABC（ATP-bindingcassette）转运蛋白超家族的蛋白质成员[1]。它们广泛存在于原核细菌及古生菌中，主要进行微量营养物质，尤其是水溶性的维生素以及过渡态的金属离子如Ni2+和Co2+的跨膜转运[2]。ECF转运蛋白由两个相同的或高度同源的ATP酶，EcfA和EcfA’，以及两个完整跨膜蛋白EcfT和S蛋白构成。由EcfA，EcfA’以及EcfT构成的能量耦合模块（Energy-couplingmodule）被认为主要发挥水解ATP以及进行能量传递的功能，而S蛋白则被认为主要发挥识别与结合底物的功能[3]。
依据编码ECF转运蛋白复合体各组分基因在基因组的位置，ECF转运蛋白分为两大类。在第一类ECF转运蛋白复合体中，能量耦合模块与单一的S蛋白相互作用，编码EcfA，EcfA’，EcfT以及S蛋白的基因位于同一基因簇上。第二类ECF转运蛋白复合体中，结合不同底物的S蛋白能够竞争性结合同一个能量耦合模块，且编码能量耦合模块EcfA/A’/T的基因位于同一基因簇上，而编码S蛋白的基因则分散在基因组[4]。
到目前为止，有3个ECF转运蛋白复合体的结构被解析，一个以复合体结构为基础的“S蛋白通过在细胞膜上进行交替翻转来实现物质的跨膜转运”的分子模型得到广泛认可[5-6]。在这一分子模型中，在无底物结合状态下，S蛋白的底物结合位点被认为朝向细胞膜内，当能量耦合模块结合并水解ATP后，S蛋白在脂质双层结构上发生翻转，即底物结合位点被暴露在细胞间质一侧，从而发挥捕获底物的作用。而一旦S蛋白捕获底物，S蛋白再一次发生翻转，由细胞间质一侧转向细胞膜内，释放的底物通过细胞膜内的通道进入细胞[6]。S蛋白在这一底物识别和结合过程中被认为发挥核心作用。截至目前为止，有5个结合不同底物来自不同细菌的S蛋白的结构被解析[7-11]。尽管这些结合不同底物的S蛋白在氨基酸序列上差异很大（序列相似性不到15%），但是它们的高级结构非常相似，都具有一个包埋在细胞膜内部由6个α-螺旋构成的核心[6]。它们的N端结构域高度保守，而C端差异性较大。S蛋白高度保守的N端结构域被认为是第二类ECF转运蛋白共享能量耦合模块的结构基础，而C端则被认为是底物结合部位[9]。BioY是ECF转运蛋白复合体中的底物结合蛋白，能特异性结合生物素，是原核细菌中将生物素由胞外转运至胞内的关键蛋白质。阐明其生理功能及关键功能部位对于我们进一步揭示ECF转运蛋白的转运机制有重大理论意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌种
pAra13及pUHA1质粒购自Novagen公司。大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞购自天根生物有限公司。
1.1.2主要试剂
LB肉汤购自青岛海博，琼脂粉，卡那霉素，氨苄青霉素，IPTG，arabinose，红霉素，
氯霉素以及链霉素均购自GenebaseGeneTechCo.,Ltd。Anti-6×His一抗购自Abmart，山羊抗小鼠的二抗购自ProteinTech。预染蛋白质分子量标准购自Fermentas。
1.1.3主要仪器
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，琼脂糖凝胶电泳仪，凝胶成像分析系统以及westernblot
电转槽均购自天能生物有限公司。ChemidocImager显像系统购自BioRad公司。
1.1.4试剂配制
LB液体培养基：1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物，1%（w/v）NaCl，
pH调至7.0。
MSM液体培养基：35mmol/L磷酸钠缓冲液pH7.0，20mmol/LD型葡萄糖，37.5mmol/LNH4Cl，810μmol/LMgSO4,68μmol/LCaCl2,18.5μmol/LFeCl3,400μg/mL酪蛋白氨基酸。
LB固体培养基：LB液体培养基添加1.5%(w/v)琼脂粉。
MSM固体培养基：MSM液体培养基添加1.5%(w/v)琼脂粉。
TBST缓冲液：25mmol/LTrispH8.0，150mmol/LNaCl，0.1%（v/v）Tween20。
1.2方法
1.2.1生物信息学分析
蛋白质序列信息来源于美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库，使用Lasergene公司的DNAStar软件套装中的MegAlign软件进行同源比对，比对方法为CLUSTALW。本研究采用SWISS-MODEL对蛋白质的三级结构进行预测和模拟。
1.2.2构建表达质粒
将编码金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）能量耦合因子SaEcfAA’T的基因构建进低拷贝的pUHA1表达载体中（由SchoolofMolecularandBiomedicalScience,theUniversityofAdelaide,Dr.AlAzhar构建），pUHA1载体含有卡那霉素抗性基因，目的基因SaEcfAA’T由IPTG诱导表达。SabioY-6×His或bioY突变体则构建进低拷贝的pAra13载体中，pAra13载体含有氨苄青霉素抗性基因，目的基因由阿拉伯糖arabinose诱导表达。S85T,L68M/F106C,R75K,R75A,R75E,R75C,F143A,F143C,F29A,Insert，D128A,D128K,D157A,D157K,K160E,K160A以及D157K/K160E的SaBioY突变体通过定点突变构建，其他突变体N38S,F88V,T54S/F81S,I139V/A152P,V80A/E109D,F177S通过随机突变构建。突变体由Dr.AlAzhar先生构建完成。
1.2.3滤纸片抑菌圈试验法
重组质粒pAra13-SabioY（或pAra13-SabioY突变体）单独或和pUHA1-SaEcfAA’T共同转化E.coliBL21(DE3)细胞，挑单克隆接种于添加有抗生素的LB培养基中，在30°C条件下培养过夜。过夜培养的菌液以1:50接种于20mL添加有抗生素的新鲜LB培养基中，在37°C条件下培养，直至菌体生长达到对数期（OD600约为0.8）。取300μL对数期生长的菌液与3mL添加有抗生素及相应诱导剂的溶化的0.7%（w/v）琼脂混合，混合液涂布于事先准备好的MSM（Minimumsupplementedmedium）琼脂平板上。待琼脂混合液凝固后，把浸有相应待测抗菌试剂的6mm滤纸圆片置于平板上，于37°C条件下培养16-18小时。本研究中，我们检测了表达异源SaBioY或其突变体条件下，E.coliBL21(DE3)细胞对三种常见抗菌试剂的敏感性。这三种抗菌试剂分别为红霉素、氯霉素以及链霉素，红霉素及氯霉素溶于无水乙醇中，链霉素溶于去离子水中。大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性表现在在浸有抗菌试剂的滤纸片周围形成抑菌圈。本次实验使用的红霉素浓度为50mg/mL，氯霉素浓度为20mg/mL，链霉素浓度为200mg/mL。浸有无水乙醇的滤纸片被用作阴性对照。实验数据由三次独立实验所得，数据图由GraphPadPrism5绘制。
1.2.4westernblot检测蛋白质的表达
聚丙烯酰胺凝胶电泳采用预染蛋白分子量标准，电泳完后去除浓缩胶取分离胶。PVDF膜先用无水乙醇浸润，后用转膜缓冲液漂洗备用。转膜“三明治”模型按照负极（黑色）→三层滤纸→SDS-PAGE分离胶→PVDF膜→三层滤纸→正极（红色）组装好，在低温恒流200mA的条件下电泳30~60分钟，电泳完毕后标记PVDF膜正反面。转膜完毕后，将PVDF膜浸泡在封闭液中缓慢摇动，室温封闭2小时。一抗孵育采用1:5000的稀释比例，4°C封闭过夜，本研究中所用一抗为鼠源的anti-6xHis。一抗孵育完后，用TBST缓冲液漂洗3次以上，每次10分钟以上，以彻底去除未结合的一抗。二抗孵育采用1:5000的稀释比例室温孵育60分钟，本研究所用二抗为黄红色Cy3标记的山羊抗小鼠的二抗。在显色曝光前需用TBST缓冲液洗去未结合的二抗。观察采用ChemidocImager显像系统。
2结果与分析
2.1SaBioY能增加大肠杆菌宿主细胞对抗菌试剂的敏感性
根据我们的前期实验，大肠杆菌表达的SaBioY能正确定位于细菌细胞膜上，并以高亲
和力结合底物生物素。然而BioY能否形成功能性转运通道帮助底物或底物类似物进入细胞是未可知的。我们通过一个滤纸片抑菌圈试验，检测BioY是否在大肠杆菌细胞表面形成功能性通道帮助亲水性溶质分子穿过细胞膜。用于滤纸片抑菌圈试验的亲水性溶质分子为红霉素（Mw733），链霉素（Mw581）以及氯霉素（Mw323），它们皆为小分子广谱抗菌试剂且都是通过干扰细菌蛋白质合成而发挥作用。表达SaBioY的大肠杆菌对抗菌试剂的敏感性通过测量6-mm滤纸片周围形成的抑菌圈而量化。
如图1A所示，当诱导表达SaBioY时，E.coliBL21(DE3)细胞对三种抗菌试剂的敏感性与未诱导的细胞相比都显著提高，且大肠杆菌对抗菌试剂的敏感性与抗菌试剂分子量的大小呈负相关。诱导表达SaBioY的大肠杆菌细胞与未诱导细胞对分子量最小的氯霉素敏感性都最高，对链霉素及红霉素敏感性依次次之。我们在用红霉素进行滤纸片抑菌圈试验时，普遍表现出较差的重复性，推测可能与红霉素侧链较庞大，分子难以穿过细胞膜屏障有关。为了检测诱导剂0.4%（w/v）arabinose是否影响大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性，我们进行了如图1B所示的实验。pAra13空载转化E.coliBL21(DE3)细胞，并比较添加诱导剂和未添加诱导剂产生的抑菌圈的大小，结果显示大肠杆菌在对氯霉素和链霉素的滤纸片抑菌圈试验中，添加诱导剂与未添加诱导剂相比并无显著差异。这提示我们，诱导剂arabinose本身并不影响大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性。因此，综合两部分数据我们认为SaBioY的表达增加了大肠杆菌宿主细胞对抗菌试剂的敏感性。
此外，我还检测了生物素转运复合体中的能量耦合因子SaEcfAA’T对这一现象的影响。我们发现当用IPTG诱导表达EcfAA’T时，EcfAA’T对宿主细胞毒性非常大而导致细胞死亡。当我们把诱导剂IPTG的浓度降至0.01mmol/L时，如图1C，同时诱导表达BioY和EcfAA’T产生的抑菌圈大小和单独诱导表达BioY产生的抑菌圈大小并无显著差异。这一结果可能是由于EcfAA’T并无表达，或是EcfAA’T的表达对抗菌试剂进入宿主细胞并无显著影响。因此，在后续的滤纸片抑菌圈试验中我们仅以SaBioY作为研究对象。
2.2SaBioY一个点突变能改变大肠杆菌宿主细胞对抗菌试剂的敏感性
2.2.1SaBioY突变体的设计
根据乳酸乳球菌硫胺素转运蛋白ThiT（L.lactisThiT），金黄色葡萄球菌核黄素转运蛋白RibU（S.aureusRibU）和乳酸乳球菌生物素转运蛋白BioY（L.lactisBioY）的已解析的三维结构，我们通过同源建模得到如图2所示的SaBioY三维结构。为研究SaBioY作为底物结合蛋白与底物及其他溶质分子的相互作用，我们设计了一系列SaBioY突变体来筛选作用的关键氨基酸位点。如图2A所示，F29在LlThiT，LlBioY以及SaRibU三类S蛋白中都高度保守；R75包含在GGRGG模体中，该模体被认为在生物素与生物素蛋白连接酶的结合过程中发挥关键作用；而D128，D157，K160则在BioY家族各物种之间都高度保守；F143以及F106被用于鉴定SaBioY的交联实验；S85包含在AXXXA模体中，该模体被认为对SaBioY与EcfT的相互作用非常重要。图2B所示的点突变则来源于随机突变。所有突变体的构建由Dr.AlAzhar完成。
2.2.2与野生型相比SaBioY突变体能改变大肠杆菌宿主细胞对抗菌试剂的敏感性
我们把构建好的SaBioY突变体应用于滤纸片抑菌圈试验中，以比较表达SaBioY突变体的大肠杆菌细胞与表达野生型SaBioY的大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性是否有显著差异。对于筛选的突变体除D157K/K160E外，其他所有突变体诱导组和相应的未诱导组相比都有显著差异，表达SaBioY突变体的大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性都显著增加。而D157K/K160E如图3B，D，F所示，这一突变体展现出与未诱导组相似的表型，与表达野生型SaBioY相比（图3A，C，E），表达D157K/K160E能显著降低宿主细胞对抗菌试剂的敏感性（p<0.001vswt）。为了检测突变体D157K/K160E是否有表达，我进行了anti-6×Hiswesternblot分析，如图4的泳道4所示，D157K/K160E有表达且正确定位到细胞膜上。因此，我们推断D157以及K160氨基酸位点的突变能显著改变SaBioY与溶质分子的相互作用，使之形成阻断小分子抗菌试剂进入细胞的屏障。
a=p<0.05，b=p<0.01，c=p<0.001，ns意指无显著差异。
另一组表达R75C突变体的大肠杆菌细胞与表达wtSaBioY相比，对链霉素以及氯霉素的敏感性都显著降低（图3C，E，p<0.05vswt）。而表达突变体F88V（p<0.05vswt），V80A/E109D（p<0.05vswt）以及T54S/F81S（p<0.01vswt）与表达wtSaBioY相比，都能显著增加宿主细胞对链霉素以及氯霉素的敏感性。值得一提的是，在氯霉素组的实验中，R75A与野生型相比都能显著增加宿主细胞的敏感性，而R75C则显著降低（图3E）。
由以上数据我们可以推定，SaBioY在大肠杆菌宿主细胞表面能形成功能性而又非特异性的通道，以帮助小分子抗菌试剂渗透进入宿主细胞。而在这一过程中，R75，D157，K160位点对于小分子化合物进入细胞扮演重要角色，因为一个氨基酸位点的改变能极大地改变宿主细胞对抗菌试剂的敏感性。
3讨论
近年来由于临床上病原菌多重耐药性（Multi-drugResistant，MDR）案例逐年增加，对
细菌产生耐药性机制的研究也呈井喷趋势。革兰氏阴性细菌具有独特的细胞外膜（Outermembrane，OMs），细胞外膜脂双层中的高疏水烷基链对胞外亲水的溶质分子是高度不透的。外膜蛋白通常形成由β折叠构成的桶装结构，并能转运部分小分子量的溶质分子穿过细胞膜[12]。迄今为止革兰氏阴性细菌中发现的与抗生素外排有关的通道蛋白都属于非特异性的OmpF及OmpC超家族。有研究报道称，这些通道蛋白中一个关键氨基酸位点的改变就能改变细菌抗药的表型[13]。临床上把革兰氏阴性细菌多重耐药性的产生归结为通道蛋白表达水平改变，通道蛋白表达类型的改变以及产生干扰通道蛋白功能的突变等等，甚至有报道指出细菌可能通过合成一种能阻断通道蛋白功能的分子来干扰抗生素进入细胞[14]。了解抗生素如何进入靶向细菌细胞能帮助我们更加合理、有效地开发新的抗生素。
我们通过滤纸片抑菌圈试验发现，表达SaBioY的大肠杆菌细胞对抗菌试剂的敏感性会显著增加。因此，我们提出一个假设即SaBioY在大肠杆菌细胞膜上能形成功能性通道以帮助小分子试剂如红霉素，链霉素和氯霉素进入宿主细胞。为了验证这一假设，同时筛选SaBioY与溶剂分子相互作用的关键的氨基酸位点，我们对SaBioY突变体也进行了筛选。研究发现所有突变体的表达都能增加宿主细胞对小分子抗菌试剂的敏感性，而D157K/K160E双突变体表现出令人惊异的表型。诱导表达的D157K/K160E表型与未诱导表型一致，诱导组与未诱导组产生的抑菌圈大小并无显著差异。与SaBioY野生型相比，D157K/K160E的表达似乎能“抵抗”小分子抗菌试剂进入大肠杆菌细胞。在这一组实验中，R75位点也显示出重要的功能相关性。当然，D157，K160和R75是否是SaBioY与配体相互作用的关键性氨基酸位点仍有待SaBioY三维结构的进一步验证。
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