一、培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究（论文文献综述）
王新娜[1]（2021）在《醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究》文中认为目的:明确醒脑健神方对缺血性中风（痰热腑实证）患者的临床疗效、复方中的化学成分以及明确其体外的抗缺氧机制,为临床用药提供客观依据和指导。方法:第一章是入组缺血性中风（痰热腑实证）的临床患者,应用非随机对照的临床试验方法评价治疗前后NIHSS、BI、mRS、中医证候（内风、痰湿、内火及血瘀）积分及便秘疗效的变化情况,明确临床治疗效果的相关结论。第二章是应用网络药理学的分析方法构建“药物—成分—疾病”的靶点集合及生物信息预测,探索醒脑健神方在缺血性中风病中可能发挥作用的机制通路与潜在靶点。第三章是应用HPLC-MS/MS的方法进行醒脑健神方的全谱分析,明确方中所含化学成分。第四章是应用PC12细胞在体外进行神经细胞的形态功能模拟,并进行化学缺氧造模,分组干预后应用蛋白质组学4D lable free等方法检测,明确醒脑健神方的体外抗缺氧机制。结果:1.临床结果。通过比较试验组与对照组的NIHSS、BI与mRS的治疗前后变化,可以说明联用醒脑健神方的干预方法优于单纯使用西医基础治疗;通过对两组患者的中医证候要素积分变化情况的统计,可以说明联用醒脑健神方的干预方法优于单纯使用指南推荐的西医基础治疗,较为明显地改善痰湿、内火、血瘀证候表现,但在改善内风证候方面的疗效无明显差异;试验组的首次通便时间要长于对照组的西医对症治疗、便秘症状积分在第3天、第7天改善情况较对照组有统计学差异,便秘疗效的总有效率高于对照组。2.网络药理学预测结果。本研究将醒脑健神方中的药物成分与缺血性中风疾病的靶点进行网络互作,经过KEGG等生物信息分析后发现其主要调控的通路Apoptosis、HIF-1信号通路等,而且这些通路均与缺血性脑血管病有着密切联系,同时也确定了NF-κBp65、Bcl-2、Caspase 3等目标蛋白,且应用蛋白印迹实验进行了验证,可确定其为药效作用的具体靶点。3.全谱分析结果。醒脑健神方中共检测出398种成分,正离子模式293种、有64类（含暂不能归类的）;负离子模式105种、有24类。其中,正、负离子取交集发现成分种类吻合的是黄酮类化合物,也是复方中相对浓度表达较高的成分。黄酮类化合物共有46种化学成分,浓度高度突出的是黄酮榕碱和槲皮素-3,4’-二-O-葡糖苷等。4.体外抗缺氧机制实验结果。缺氧后PC12细胞的存活能力有所下降,在造模基础上应用醒脑健神方预孵育后可以显着增加因缺氧而损伤的细胞活力。蛋白质组学的结果发现醒脑健神方的抗缺氧机制主要富集在凋亡、调控细胞各类代谢等方面,具体的机制通路富集到了PPAP、PI3K/AKT、HIF-1、Steroid biosynthesis、Metabolic pathways等;根据关联强度与差异倍数确定兴趣蛋白并进行了PRM的蛋白验证,发现Perilipin、CoA synthase蛋白的变化趋势与蛋白组学的结果一致,说明醒脑健神方确实具有抗缺氧的作用机制。根据PC12各组细胞处理后使的抗体与抗原识别结合,可以发现醒脑健神方干预后可以使细胞样本发生三甲基化、乙酰化、乳酸化及泛素化的修饰变化。结论:临床研究的结论是醒脑健神方对缺血性中风（痰热腑实证）患者确实具有临床治疗效果,联合应用可比对照组的疗效更明显。网络药理学的结论是醒脑健神方在本病中确实有调控作用,经过western验证发现其可调控凋亡标志蛋白。LC/MS的结论是醒脑健神方中有多种化学成分,很有可能的药效物质成分是黄酮类化合物,当然这需要实验来进行后续验证。体外实验的结论是醒脑健神方对PC12具有抗缺氧调控作用,主要的机制通路富集在凋亡、调控细胞糖脂及产物的代谢等,且在组蛋白修饰层面可能对蛋白基团具有三甲化、乙酰化、乳酸化及泛素化的调控作用。
李百川[2]（2021）在《脑白质脱髓鞘性损伤在慢性缺氧致抑郁发生中作用及其调控机制研究》文中提出背景抑郁症是世界上最主要的致残原因,在不同国家其发病率约为15-18%,严重影响着患者的社会心理功能和生活质量。目前有大量关于抑郁症病理生理学机制方面的研究,主要有单胺类等神经递质异常、下丘脑-垂体-肾上腺素轴改变、神经可塑性失调、遗传基因、环境因素等,但并没有单一机制能较好诠释抑郁症的发病机理。慢性缺氧是重要的环境因素之一,目前研究较少。然而,我国约有1/6的高海拔地区,超过1000万人常年生活在缺氧环境中;此外,由于职业和工作需要,部分人群需长期处于氧浓度相对较低的密闭空间,因氧浓度不足导致的抑郁高发生率、高死亡率不容忽视。因此,深入探究慢性缺氧致抑郁发生的原因,完善相关病理生理学机制具有十分重要的意义。慢性缺氧会引起脑萎缩、脑白质体积减少等中枢神经系统损伤,白质区最主要的成分是髓鞘,主要由成熟少突胶质细胞形成。研究发现,压力等因素导致的抑郁症患者其大脑内存在髓鞘脱失和少突胶质细胞异常的情况,提示了脱髓鞘损伤在抑郁症发生发展中的重要地位。但是慢性缺氧引起的抑郁发生是否与脱髓鞘损伤有关却不得而知。RhoA/ROCK通路在中枢神经系统具有重要的调节作用,该通路激活与众多神经精神疾病发生密切相关。然而,RhoA/ROCK通路在抑郁症中是否具有调控作用却鲜有报道。此外,RhoA能调控细胞骨架的重组,这对髓鞘膜形成和损伤后的再髓鞘化具有重要意义。因此,我们推测慢性缺氧引起的抑郁发生可能与脱髓鞘损伤有关,RhoA/ROCK通路对该过程可能起到一定的调节作用。目的本研究旨在探究脑白质脱髓鞘损伤在慢性缺氧后抑郁发生中的作用,以及通过抑制RhoA/ROCK通路活性在保护髓鞘完整性及改善抑郁症状中的意义,以求进一步阐明慢性缺氧导致抑郁症的发病机理,为其预防和治疗提供研究证据。方法本研究分两部分进行。第一部分,探究慢性缺氧后是否会出现脑白质脱髓鞘损伤和抑郁样行为。首先确立最适缺氧时间。将8周龄C57BL/6黑色小鼠（18-25g）随机分为正常组和缺氧组。利用10%氧浓度的缺氧箱连续性缺氧30 d构建慢性缺氧模型。观察并记录不同时间点小鼠的体重变化情况和存活天数,计算生存率;分别于缺氧后1 d、3 d、7 d、14 d取材,利用qPCR检测缺氧诱导因子HIF-1α的表达、ELISA法检测神经损伤标志性蛋白S100β的表达。接着,观察缺氧后的行为和髓鞘变化情况。通过行为学实验（强迫游泳实验、糖水偏好实验、旷场试验）对比观察两组行为差异,并记录抑郁样行为的发生率;通过额叶区的脑电记录比较两组神经元放电活性,通过快蓝染色和免疫荧光染色比较两组髓鞘完整性情况。第二部分,探究抑制RhoA/ROCK通路活性对改善脱髓鞘损伤和抑郁样行为的影响。药物干预选择RhoA/ROCK通路阻滞剂Y-27632,并利用经典抗抑郁药氟西汀进行对照。首先在慢性缺氧的同时,分别对各组小鼠行腹腔注射Y-27632溶液（5 mg/kg）、氟西汀（10 mg/kg）和生理盐水,1次/d,注射14 d。接着,在14 d的缺氧和药物干预后,利用行为学实验观察各组行为变化,采用脑电记录比较各组神经元放电活动情况,通过免疫荧光染色、电镜染色和Western blot观察各组髓鞘完整性的变化情况,利用Western blot和免疫荧光染色观察髓鞘生长负性调节蛋白LINGO-1的变化,并利用Ed U染色和免疫荧光染色观察各组少突胶质细胞增殖分化情况、通过Western blot检测凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达变化情况。结果第一部分结果如下:1.小鼠的体重随缺氧时间延长呈进行性降低,在缺氧14 d时体重趋于稳定;缺氧14 d时小鼠的存活率为100%,缺氧30 d时小鼠的存活率仅为40%。qPCR结果显示缺氧1 d时HIF-1α表达比正常组明显增高,并持续升高至14 d;ELISA检测结果显示S100β浓度在缺氧1 d时开始升高,并持续至14 d。提示缺氧14 d时模型最稳定且神经损伤较重,可将此作为最适缺氧时间。2.缺氧14 d后,小鼠抑郁样行为的发生率为66.7%。在强迫游泳实验中,缺氧组的不动时间（193.50±6.22 s）明显高于正常组（72.67±10.74 s）（P<0.0001）。在糖水偏好实验中,缺氧组的糖水摄入率（52.54±3.32%）比正常组（87.18±2.65%）低,两组相比差异显着（P<0.0001）。在旷场实验中,缺氧后的小鼠运动速度及运动总距离均明显减少,两组穿过中央区域距离与总距离的比值分别为（0.16±0.01和0.06±0.01）（P<0.0001）。EEG情况,小鼠的脑电频率和幅度均出现明显改变,其振幅范围是-105.52～101.12μV、频率是73 Hz;而正常组的脑电波振幅范围是-45.19～45.92μV,频率是16 Hz,提示了与抑郁相关脑区的神经元活动异常。4.缺氧14 d后,快蓝染色可见脑白质区髓鞘颜色深浅不均,大部分区域染色变浅,正常组和缺氧组的染色光密度值分别为（0.53±0.04和0.23±0.03）,结果相比有统计学意义（P<0.001）。通过免疫荧光染色观察髓鞘碱性蛋白MBP的表达情况,发现缺氧后大脑内海马和胼胝体等多处出现了MBP+区域的面积减少。第二部分结果如下:1.qPCR显示,缺氧后RhoA、ROCK1的表达明显高于对照组（P<0.0001）。在缺氧时运用ROCK抑制剂Y-27632进行阻断,我们发现RhoA、ROCK1蛋白的表达量明显降低。在缺氧时运用抗抑郁药氟西汀,也得到了类似的效果,蛋白的水平也有所降低,但比ROCK抑制剂组略高。2.在药物干预后,ROCK抑制剂组在强迫游泳实验中的小鼠不动时间明显低于缺氧组,糖水偏好实验中的糖水摄入率明显高于缺氧组,但均未达到正常组水平。抗抑郁药组与ROCK抑制剂组呈现出相同的趋势,但两组结果无统计学意义（P>0.05）。在旷场试验中,运动速度和运动总距离方面,两药物干预组均有明显改善,结果与缺氧组相比均有明显统计学意义;而在旷场中中心距离与总距离的比值情况,药物干预后和缺氧组无明显差异（P>0.05）。3.在药物干预后,ROCK抑制剂组和抗抑郁药组小鼠胼胝体处MBP的荧光强度明显高于缺氧组,且表达范围更广。电镜染色发现,ROCK抑制剂组和抗抑郁药组的髓鞘厚度明显改善,但仍比正常组薄。缺氧后,有髓轴突数目减少,约为正常组的20%,而在ROCK抑制剂和抗抑郁药干预后,有髓轴突数目明显恢复（分别是97.20±6.13和91.60±7.31）,与缺氧组（26.60±5.09）相比差异显着均有统计学意义,而两药物干预组相比却无明显差异（P>0.05）。G-ratio值（轴突直径/轴突+髓鞘的总直径）情况,ROCK抑制剂组的G-ratio值为0.71±0.01,明显低于缺氧组的0.86±0.01（P<0.0001）,抗抑郁药组与ROCK抑制剂组趋势一致,但两药物干预组G-ratio值无明显差异（P>0.05）,提示了在缺氧同时运用ROCK抑制剂能恢复髓鞘厚度,减少有髓轴突降解。4.髓鞘生长负性调节蛋白LINGO-1,在缺氧后表达明显升高,而在通路阻断剂Y-27632干预后出现明显降低（P<0.001）,但仍高于正常组;而两药物干预组的LINGO-1表达水平相比结果却无明显差异（P>0.05）。5.在探究脱髓鞘损伤的机制研究中,增殖方面,ROCK抑制剂组的PDFGR-α+Ed U+的细胞数（22.58±1.55%）明显高于缺氧组（10.09±1.36%）（P<0.001）;ROCK抑制剂组PCNA+的细胞数（47.62±3.63%）也明显高于缺氧组（23.05±2.61%）（P<0.001）;抗抑郁药组呈现出与ROCK抑制剂组一样的趋势。分化方面,ROCK抑制剂阻断RhoA/ROCK通路后,PDFGR-α+和O4+的细胞数明显高于缺氧组,抗抑郁药组的阳性细胞数也明显增高。在凋亡方面,缺氧组少突胶质细胞的凋亡蛋白（cleaved caspase-3）明显升高,在运用ROCK抑制剂和抗抑郁药进行干预后,其蛋白相对表达量明显降低。结论1.慢性连续性缺氧14 d可引起脑白质脱髓鞘损伤及抑郁样行为,并伴有RhoA/ROCK信号通路激活。2.在缺氧早期抑制RhoA/ROCK通路活性,能有效缓解慢性缺氧引起的抑郁样行为、改善脑白质脱髓鞘损伤并保护轴突以防降解。3.在缺氧早期抑制RhoA/ROCK通路活性,能有效解除LINGO-1对脱髓鞘损伤后再髓鞘化修复的抑制效应,促进少突胶质细胞祖细胞的增殖分化,并抑制少突胶质细胞凋亡。4.阻断RhoA/ROCK通路的活性可能调控慢性缺氧致抑郁发生发展的手段之一,其机制可能与保护髓鞘完整性有关。
陈莎[3]（2021）在《β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究》文中提出急性缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一,具有发病率高、致死率高、致残率高和复发率高的特点,但迄今为止,其病理生理机制还尚不完全清楚,还未找到其治疗行之有效的方法。因此,深入阐明急性缺血性脑卒中的发病机制,寻找治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物具有很高的经济意义和社会价值。大量研究表明脑缺血后细胞间隙谷氨酸过量释放引起兴奋性毒性在脑缺血刺激后神经元细胞死亡过程中起着非常的作用。过量释放的谷氨酸主要激活两种突触后膜受体,NMDARs和AMPARs。AMPARs亚基Glu A2抑制钙离子通透,决定了AMPARs对钙离子通透性,依据AMPARs是否含有Glu A2,将AMPARs分为CI-AMPARs和CP-AMPARs。脑缺血损伤后,大量钙离子经过通透性已改变的AMPARs进入相对脆弱的海马CA1区锥体神经元,使胞内钙超载,引发神经元细胞发生致死性反应。另外,AMPARs介导了中枢神经系统（CNS）绝大多数快兴奋性突触传递,在学习记忆和认知等方面具有重要作用。研究发现脑缺血后神经元细胞内钙离子内流增加还加剧了脑缺血后神经退行性病变进程。长时程增强（long term potentiation,LTP）和长时程抑制（long term depression,LTD）调控的突触可塑性被认为是学习和记忆的生理基础。近期文献报道,CI-AMPARs从突触外和/或细胞内向海马突触膜表面转运募集,因而改变钙离子流,影响突触胞膜上电流变化,调控LTP和LTD过程进而影响认知相关的学习记忆过程。但目前,CI-AMPARs在急性缺血性脑卒中后认知障碍中是否发挥作用还不清楚。内源性大麻系统最早被发现在调节神经行为功能中发挥重要作用,如成瘾,焦虑,摄食等,后来研究发现大麻系统在脑缺血再灌注和一些神经退行性疾病的病理生理机制中发挥重要作用。本课题组在前期工作中筛选到一与大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid receptor type 2,CB2）结合的CB2受体完全激动剂β-石竹烯（β-Caryophyllene,BCP）,初步发现其具有保护神经损伤和提高脑缺血动物的学习记忆能力,但其具体发挥作用的明确机制不详。鉴于有CB2受体激动剂可以调节啮齿类动物内侧前额叶皮质锥体神经元中Ca2+流,即CB2受体可能调节离子稳态和神经元兴奋性的文献报道,为此,我们推测CB2受体β-石竹烯（BCP）具有的保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用可能与其调节与钙离子通透性相关的CI-AMPARs膜转运相关。基于这一科学假说,我们以小鼠神经元细胞糖氧剥夺复氧模型OGD/R及小鼠急性缺血性脑卒中模型MCAO为研究对象,通过MTT增殖实验、流式凋亡检测、细胞形态学观察、神经行为学评分、转棒实验、TTC染色、H&E染色、MWM水迷宫、物体辨别实验、免疫荧光双标、流式检测钙离子流、膜片钳电生理技术等实验,并初步分析临床急性脑梗病人临床样本与临床资料,从细胞、动物和临床标本水平,在验证与分析CB2受体β-石竹烯（BCP）具有保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用基础之上,研究了BCP调节CI-AMPARs膜转运与保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的关系,并探讨了BCP调节CI-AMPARs膜转运的分子机制。研究方法与结果:1.β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）以小鼠神经元细胞HT-22为研究对象,建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,分组:Control组、Control+10μM BCP组（正常对照组）、OGD/R+5μM BCP组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+20μM BCP组,作用时间24h、48h及72h,运用MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,从细胞水平验证与分析,BCP对OGD/R模型作用的剂量依赖及时间依赖关系,实验结果在细胞水平明确BCP对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）具有保护作用。（2）（1）选用C57BL/6,雄性,6～8周龄小鼠,随机分为假手术组（sham组）、sham+BCP 72mg/kg组（正常对照组）、模型+溶剂组、模型+BCP 36mg/kg治疗组、模型+BCP 72mg/kg治疗组和模型+144mg/kg治疗组,每组6只C57BL/6小鼠,连续灌胃给药6天,第6天采用大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立急性缺血性脑卒中模型。（2）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分（Modified Neurological Severity Score:m NSS）和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测各组小鼠脑梗死体积,苏木精-伊红（H&E）染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,从动物水平验证与分析BCP具有保护急性缺血性脑卒中小鼠的作用,结果发现BCP有明显剂量依赖性保护急性缺血性脑卒中小鼠模型脑神经损伤的作用。（3）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验的空间定位航行实验、空间探索实验检测逃避潜伏期、经过目标平台的次数及目标现象活动时间,物体识别实验（Object Recognition Task,ORT）检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,验证与分析BCP保护急性缺血性脑卒中后学习记忆障碍,结果发现BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的逃避潜伏期、经过目标平台的次数、目标现象活动时间及物体识别指数,即BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的认知功能障碍。2.β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运（1）运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中CI-AMPARs关键蛋白AMPARs亚基Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,结果发现BCP可以促进氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加。（2）运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现OGD/R细胞模型中,细胞内钙离子流增多,而BCP处理的OGD/R细胞,细胞钙离子内流减少,即BCP可以抑制氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中钙离子内流。（3）收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,制作冰冻切片,应用免疫荧光双染共定位方法（共染突触标志物Synaptophysin及Glu A2）检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,结果发现急性缺血性脑卒中模型MCAO中Glu A2在神经突触膜表面聚集减少,而BCP给药后可以增加MCAO后Glu A2在神经突触膜表面的聚集表达,该研究结果提示,BCP可以促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加。（4）应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现BCP给药后可以缓解急性缺血性脑卒中MCAO模型AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率增加影响LTP和LTD进程。3.β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）采用ELISA技术、Western Blot技术检测氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型、急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中及BCP给药后,与神经保护和学习记忆过程、CI-AMPARs转运密切相关的c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,发现BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（2）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22,分为Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加和抑制钙离子内流的作用,即BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜转运是PKA依赖形式的。（3）C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,免疫荧光双染共定位方法检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现,PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加,可以逆转BCP抑制MCAO模型中AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率,即BCP促进MCAO动物模型中CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程是PKA依赖形式的。（4）Western Blotting同时监测（2）和（3）的各组中c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,证实BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（5）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22分组:Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型发挥保护作用。（6）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。TTC染色检测各组小鼠脑梗死体积,H&E染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对MCAO动物模型神经功能损伤的保护作用。（7）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验、物体识别实验检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程改善急性缺血性脑卒中后认知学习记忆障碍。（8）收集30例临床急性缺血性脑卒中病人取栓治疗前后血清样本,ELISA法检测c AMP的浓度变化,结合病人临床病例资料分析统计c AMP的浓度变化与治疗前后缺血性脑卒中临床指征的关系,发现急性缺血性脑卒中病人取栓后c AMP浓度上调。研究结果表明:（1）明确了BCP具有保护急性缺血性脑卒中神经损伤及卒中后认知功能障碍的作用;（2）首次发现BCP具有促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运的作用;（3）发现BCP可通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运抑制神经元细胞钙离子内流,调节神经突触可塑性发挥保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用。本研究结果为进一步阐明BCP在保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用和分子机制奠定基础,为寻找急性缺血性脑卒中治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物提供了新思路。
段晨阳[4]（2020）在《Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究》文中认为线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是缺血缺氧后较早发生损害的细胞器之一。以往针对线粒体的治疗措施主要以抗氧化应激、抗凋亡等线粒体功能障碍发生后的效应为靶点,缺乏针对线粒体质量调控过程中关键环节的防治措施,治疗效果有限。近年研究表明,线粒体质量失衡如线粒体过度分裂、融合受损、自噬和代谢紊乱等关键环节异常与缺血缺氧损伤后多器官功能障碍和机体物质能量代谢紊乱的发生密切相关。Drp1作为经典线粒体动力蛋白,主要影响了线粒体质量调节中的线粒体分裂过程。以往研究认为Drp1只有在内质网和线粒体接触（ER-Mito接触）引起线粒体预收缩后才会被招募到线粒体上参与线粒体分裂过程,但招募机制还有待深入研究。并且正常情况下转位到线粒体上参与线粒体分裂的Drp1仅占总Drp1含量的6%,还有大量Drp1存在于胞浆中。那么大量存在的细胞质Drp1具有哪些功能?在被招募到线粒体之前是否已经开始参与线粒体分裂过程?对于ER-Mito接触形成及线粒体预收缩是否有调控作用?对除了线粒体分裂的其他线粒体质量调控环节比如线粒体自噬、线粒体代谢等是否也有影响呢?此外,目前研究认为Drp1被招募到线粒体上后主要是通过其GTPase活性切割线粒体膜介导分裂的,但是Drp1介导线粒体分裂结束后下一步如何发展一直是困扰大家的问题。近年来在多种疾病模型中发现Drp1参与了线粒体和细胞功能调节,但具体调控机制尚不清楚。有研究表明,线粒体mPTP通道过度开放是线粒体膜电位改变、细胞坏死等发生的先决条件,而ROS大量堆积可能是引起上述线粒体和细胞功能障碍的重要诱因。那么缺血缺氧后线粒体Drp1除了介导线粒体分裂外,是否对线粒体外膜mPTP通道开放和ROS的产生及清除也有影响?为此,本研究利用整体失血性休克和细胞糖氧剥夺方法复制急性缺血缺氧损伤模型。首先我们了解了缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。其次我们探究了Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制,重点研究了细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制以及线粒体Drp 1对mPTP和ROS等线粒体功能的调控机制。最后,我们观察了使用Drp 1抑制剂Mdivi-1或者Drp 1敲除干预等措施对缺血缺氧损伤后多器官功能的保护作用,为从维持线粒体质量平衡角度调整急性缺血缺氧损伤临床救治方案提供了新思路和新靶点。[研究内容]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点（0.5h、1h、2h、3h、4h）血管组织、肠组织、心肌组织及其对应细胞线粒体形态和数量变化以及ATP产生、ROS含量、线粒体膜电位等线粒体功能变化,以了解急性缺血缺氧损伤多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺血管平滑肌细胞（VSMC）模型,观察缺血缺氧不同时相点线粒体动力蛋白表达、分布情况;观察缺血损伤后血管和肠组织Drp1修饰变化。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用利用Drp1干扰/过表达腺病毒转染的VSMC细胞,观察干预线粒体Drp1对正常情况下和缺氧后线粒体形态和数量变化的影响,以明确Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用。（2）细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制利用失血性休克SD大鼠和Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型、糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点ER-Mito接触情况;观察干预细胞质Drp1对ER-Mito接触和线粒体预收缩的影响;观察干预Drp1-Shroom4复合体对肌动蛋白束化、ER-Mito接触以及线粒体预收缩的影响,以阐明细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白启动ER-Mito接触形成的机制。（3）细胞质Drp1加速线粒体转位的发生机制利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血不同时相点Calnexin、Fundc1表达及分布情况;观察干预内质网蛋白Calnexin对缺氧早期Drp1和Fundc1的线粒体转位、线粒体预收缩和线粒体分裂的影响,以了解细胞质Drp1在ER-Mito接触位点Calnexin-Fundc1环的招募作用下加速线粒体转位的发生机制。（4）Drp1介导线粒体自噬对破损线粒体的清除机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺Drp1干扰腺病毒转染的VSMC细胞模型,基因组学分析生理和缺血损伤情况下Drp1可能参与的调控通路;观察干预Drp1对缺血缺氧后线粒体自噬小体和自噬溶酶体形成的影响;观察干预Drp1对自噬相关蛋白表达及分布的影响,以阐明Drp1通过Clec16a-Parkin途径介导线粒体自噬的机制。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体mPTP通道开放中的作用及调控机制利用失血性休克SD大鼠、Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺氧不同时相点mPTP开放情况;观察缺血缺氧不同时相点mPTP结构蛋白表达和分布情况;观察干预mPTP结构蛋白HK2表达活性对缺氧后mPTP开放的影响;观察干预线粒体Drp1-LRRK2结合对HK2活性、分布和mPTP开放的影响,以阐明线粒体Drp1对缺血缺氧损伤mPTP过度开放的调控机制。（2）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体ROS堆积中的作用及调控机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察机体能量代谢变化;代谢组学检测干预Drp1对缺血损伤后线粒体代谢的影响;观察干预Drp1介导谷胱甘肽代谢对线粒体功能的影响,以阐明Drp1通过影响线粒体代谢参与ROS生成和清除的潜在调控通路。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究使用Drp1抑制剂Mdivi-1以及Drp1敲除干预观察缺血缺氧损伤后（1）血管反应性、血管管径变化、血管平滑肌细胞收缩张力以及动态血压维持情况;（2）肝肾血流灌注、肝功、肾功、心输出量、心损和心肌细胞收缩力;（3）肠上皮紧密连接情况、肠道菌群组成及肠屏障功能;（4）血流动力学指标（LVSP、±dp/dt max）、血气指标（Lac、HCO3-、BE、pH等）以及72h存活情况,以阐明干预Drp1对急性缺血缺氧损伤后重要器官功能的保护作用及其临床意义。[研究结果]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究1.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体形态和数量均发生明显变化,但变化时间、变化程度和变化形式存在差异。血管组织变化起始于缺血缺氧后1h并逐渐加剧。肠组织在缺血缺氧后0.5h即发生明显变化,但后续并没有进一步加重。心脏组织变化不如血管和肠组织明显,缺血缺氧后2h才有稍许增加,并且不同于血管和肠组织线粒体缺血缺氧后表现为线粒体过度分裂和碎片化线粒体数量增多,缺血缺氧损伤对心肌线粒体的影响主要体现在心肌线粒体排布紊乱和内部嵴结构的破坏。2.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体功能均发生明显变化,且缺血缺氧损伤后相同组织线粒体功能变化均晚于线粒体形态和数量的变化。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化（1）缺血缺氧损伤1h后Drp1发生从细胞质到线粒体转位,且其时相变化规律与线粒体碎片化程度呈正相关,提示Drp1线粒体转位在缺血缺氧早期线粒体过度分裂中发挥了重要作用。进一步发现转位到线粒体上的Drp1主要富集在线粒体预收缩位点,对于线粒体分裂的发生具有重要意义。（2）缺血损伤后Drp1的磷酸化、苏木化、亚硝基化修饰明显增高,泛素化修饰轻度减低。缺血缺氧损伤后活跃的Drp1修饰变化对于线粒体质量调控具有重要意义。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）缺血缺氧后线粒体碎片化的发生是由于Drp1线粒体转位后介导线粒体过度分裂导致的。干扰Drp1后线粒体Drp1减少的同时伴随线粒体碎片数量减少。正常情况下过表达Drp1会导致线粒体过度分裂和线粒体数量的增加。上述结果明确了 Drp1线粒体转位介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的决定作用。（2）缺血缺氧损伤初期Drp1发生大量线粒体转位之前,过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过激活细胞骨架调节蛋白Shroom4并与之结合形成Drp1-Shroom4复合体。Drp1-Shroom4复合体如“卡扣”一样将内质网周围散乱分布的F-肌动蛋白束化,增强了内质网与线粒体之间的牵引力和有效接触面积。随后内质网在束化F-肌动蛋白锚定端INF2的牵引下,缠绕在线粒体周围,形成ER-Mito接触并进一步引起线粒体预收缩。（3）缺血缺氧损伤ER-Mito接触引起大量线粒体预收缩后,内质网Calnexin会迁移到ER-Mito接触位点并与细胞质中Fundcl结合形成功能环,加速细胞质Drp1沿内质网轨迹向ER-Mito接触位点的线粒体转位过程。（4）缺血缺氧损伤后活化Drp1可上调线粒体Clec16a表达,一方面抑制了 Parkin的线粒体募集,导致线粒体碎片形成自噬小体受阻;另一方面也加速了自噬小体向自噬溶酶体的转变,促进了缺血缺氧损伤后的自噬流过程。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）缺血缺氧晚期,线粒体收缩位点大量富集的Drp1除了介导线粒体分裂外,还会通过结合mPTP结构蛋白BAX,识别线粒体收缩位点附近的mPTP通道。然后通过招募线粒体LRRK2到线粒体收缩或分裂位点形成Drp1-LRRK2复合体引起mPTP通道结构蛋白HK2失活及其线粒体分离,破坏mPTP通道结构,导致mPTP通道过度开放,线粒体CytC释放增多,影响线粒体功能和细胞功能。（2）缺血缺氧后活化Drp1会造成ROS的过度堆积,进而破坏线粒体功能,引起细胞能量代谢异常。其潜在发生机制包括:（a）活化Drp1通过抑制辅酶Q的生物合成破坏线粒体呼吸链,导致线粒体ROS生成增加;（b）活化Drp1抑制线粒体谷氨酸-谷胱甘肽代谢,导致ROS清除减少;（c）活化Drp1通过阻断神经递质途径（包括酪氨酸-多巴胺代谢和维生素E相关通路）进一步降低ROS清除率。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究1.急性缺血缺氧损伤后合并使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏可以明显提高血管反应性及其收缩张力。干预Drp1可以很好地维持缺血缺氧损伤后的动态血压。2.干预Drp1可以改善缺血损伤后肝肾血流灌注和肝肾功能,对于缺血损伤后心肌细胞收缩力也有一定的影响。3.Drp1敲除干预可以通过影响肠道菌群中拟杆菌门的组成、恢复短链脂肪酸（SCFA）的产生,从而保护缺血损伤后的肠屏障功能。4.干预Drp1介导的线粒体质量失衡可以很好地改善缺血缺氧损伤后血流动力学、血气和存活情况。[结论]1.Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中发挥了重要作用。其中“Drp1的过度激活（磷酸化、苏木化、亚硝基化）”和“大量细胞质Drp1的线粒体转位”是急性缺血缺氧后线粒体形态数量和功能发生变化的重要原因。2.缺血缺氧后大量存在的细胞质Drp1在被招募到线粒体之前已经开始参与线粒体分裂过程。具体表现为过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白,增强内质网和线粒体之间牵引力,启动大量ER-Mito接触并引起大量线粒体预收缩,为后续细胞质Drp1转位到线粒体收缩位点介导线粒体过度分裂奠定了结构基础。3.缺血缺氧后细胞质Drp1加速线粒体转位是由于ER-Mito接触位点Calnexin-Fundcl功能环大量形成,促进了细胞质Drp1沿内质网向ER-Mito接触位点的大量迁移。4.缺血缺氧晚期Drp1介导线粒体分裂结束后下一步会进一步影响线粒体功能。线粒体Drp1一方面在线粒体收缩或分裂位点通过识别并破坏线粒体mPTP通道结构引起mPTP过度开放,CytC释放增加;另一方面还可通过多种线粒体代谢途径影响ROS的清除和生成,导致ROS过度堆积,最终加重了缺血缺氧后线粒体和细胞功能损伤。5.急性缺血缺氧损伤后使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏或者Drp1敲除干预可以保护血管收缩张力、改善肝肾血流灌注以及肠屏障功能,弥补了常规林格液体复苏“虽然可以快速扩容但难以长时间维持血压”的缺陷,对于延长急性缺血缺氧损伤患者的临床救治时间、提高患者救治率和存活率具有重要临床意义。
陈甲[5]（2020）在《慢性缺血缺氧条件下p75神经营养素受体在神经损害中的作用研究》文中提出血管性认知损害（vascular cognitive impairment,VCI）是仅次于阿尔茨海默病的能够导致认知损害和痴呆的疾病,包括了从轻度认知损害（mild cognitive impairment,MCI）到痴呆的整个阶段。特别是在全球快速老龄化的社会进程中,血管性认知损害的患病率将显着上升。根据我国2010年第六次人口普查结果,我国仅60岁以上人口就已达1亿8千万之巨,占人口总数的13.3%。因此,整个社会将面临着包括血管性认知损害和痴呆在内的威胁老年人群健康的疾病挑战。慢性脑低灌注性认知损害（chronic cerebral hypoperfusion-induced VCI,CCH-VCI）是血管性认知损害临床类型中容易被忽视的重要类型,主要是由于各种原因导致大脑半球或全脑持续性缺血低灌注而引起,本质上其发展过程为持续脑低灌注-慢性缺血缺氧-进展性神经损害-神经网络结构和功能破坏-认知损害和痴呆。在中老年人群中,除了少数心脏泵血功能衰竭等原因外,更多的是长期存在高血压、糖尿病等脑血管危险因素的人群中,无明显卒中发作的脑血管病变逐渐增多,如颅内单侧或双侧的脑供血动脉硬化和渐进性狭窄,可造成大脑半球或全脑的持续性缺血低灌注,神经损害逐渐加重并引发记忆、执行能力等功能损害,虽然这种损害在早期可能是可逆的,但是长期的、持续性的脑组织缺血缺氧可伴随反复卒中的发生认知损害加重,最终导致痴呆。值得注意的是,与急性缺血导致的突发性神经损伤不同,慢性脑低灌注性认知损害往往有一个相对隐匿和逐渐发展的过程,因此起始认知损害症状往往不够典型,即使被发现其严重性也容易被忽视,因此需要引起注意。而对于那些不能够或暂不适合进行血管成形等外科治疗的患者,持续的缺血低灌注带来的神经损害将破坏神经网络结构和功能的完整性,导致认知损害甚至痴呆。遗憾的是,除了少数改善痴呆症状的药物,目前尚无明确的针对这种慢性脑低灌注条件下神经缺血缺氧损伤的药物,因此,寻找能够在慢性缺血缺氧条件下避免或改善神经损害这一重要环节的治疗靶点和干预策略值得我们探索。神经损害的重要机制通常包括氧化应激、神经炎症反应、神经细胞死亡以及神经突触可塑性破坏等环节。与常见的神经组织突然缺血或缺血再灌注损伤（如缺血性卒中）不同,中枢神经系统（central nervous system,CNS）可因长期的慢性低灌注而导致持续缺血缺氧,在这种不利环境下,神经细胞代谢受到损伤的同时还可能发生适应性调整,基因转录和表达出现变化,而这种变化可能是暂时有利的,但也可能从长时间来看是有害的,比如持续过度的神经炎症反应将带来自身损害。有证据就显示,血清白细胞介素6、C反应蛋白等与老年人群认知功能下降相关。因此,我们需要明确在这种情况下神经损害的特点以及可能干预的靶点。p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）是肿瘤坏死因子受体超家族成员,多表达于与认知功能有关的脑内胆碱能神经元上,被认为是多种神经营养素前体的受体。既往研究表明,在缺血性脑卒中、阿尔茨海默病患者血清中,被蛋白酶水解脱落的p75NTR细胞外段（p75NTR extracellular domain,p75NTR-ECD）含量增高且可能与疾病的严重程度相关,间接提示p75NTR可能在神经系统疾病的发生或进展中发挥作用。鉴于脑缺血低灌注同时存在于上述神经系统疾病中,可以推测p75NTR可能在CCH-VCI中起到作用。但是,对于在慢性脑低灌注引发的持续性缺血缺氧条件下,p75NTR在中枢神经系统中的表达和在神经损害过程中的作用尚不清楚。另一方面,在上述慢性中枢神经系统疾病中,多个研究均报告了炎症因子的异常升高,并被认为可能与脑内缺血低灌注导致神经损害有关。基于此,本研究通过以下实验环节逐步深入探索,来寻找p75NTR在慢性缺血缺氧引发神经损害过程中发挥作用的证据。首先我们研究了慢性脑低灌注认知损害患者血清中p75NTR-ECD及多种炎症因子的水平,并寻找两者的相关性,通过其受体胞外段的研究,间接证明慢性脑低灌注性认知损害患者脑内p75NTR很可能出现了相应的变化。为进一步证实缺血缺氧条件下p75NTR在神经细胞损伤中的作用,我们通过三气培养箱和无糖培养在体外构建人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）模型,来模拟体内缺血缺氧环境下p75NTR表达的变化及其在细胞损伤中的作用。这里我们使用了一种小分子2-氨基-3-甲基-戊酸酰胺（LM11A-31）,它能通过胃粘膜和血脑屏障并能作为竞争性配体与p75NTR结合,从而一定程度上阻断其介导效应。最后,我们通过双侧颈总动脉不完全结扎（残留内径0.22mm）制作慢性低灌注性认知损害的小鼠模型,来研究持续性缺血缺氧条件下脑内p75NTR的表达变化,以及其在神经炎症反应、神经凋亡及突触可塑性破坏等环节中的作用。各部分研究内容摘要如下:第一部分慢性脑低灌注性认知损害患者血清p75神经营养素受体细胞外段水平及其与炎症因子的关系目的:检测慢性脑低灌注性血管性认知损害（CCH-VCI）患者血清p75神经营养素受体胞外段（p75NTR-ECD）水平,并探讨其与肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）的关系。资料和方法:选择海军军医大学长海医院脑血管病中心2018年8月至12月收治的34例CCH-VCI患者,以及同期相同年龄段的36名中老年健康人和34例缺血性脑卒中患者作为研究对象。采用酶联免疫吸附试验测定并比较3组研究对象的血清p75NTR-ECD、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。采用Spearman相关分析研究CCH-VCI患者血清p75NTR-ECD水平与TNF-α、IL-1β、IL-6水平的相关性。结果:CCH-VCI组血清p75NTR-ECD水平高于健康对照组和缺血性脑卒中组[(544.36（440.88,628.50）pg/m L vs 276.49（262.59,313.87）pg/m L、366.87（337.09,450.43）pg/m L],差异均有统计学意义（U=87.500、335.500,p均<0.05）。CCH-VCI组患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平分别为196.02（141.20,280.35）pg/m L、68.23（60.79,91.94）pg/m L、51.04（40.24,65.26）pg/m L,缺血性脑卒中组分别为218.67（143.76,281.28）pg/m L、76.87（59.10,99.91）pg/m L、64.45（43.13,86.76）pg/m L,均分别高于健康对照组[分别为73.71（56.94,79.81）pg/m L、42.98（34.52,51.34）pg/m L、14.97（11.76,21.19）pg/m L],差异均有统计学意义（U=4.000、31.000,132.000、106.000,13.000、48.000;p均<0.05）。CCH-VCI患者血清p75NTR-ECD水平与TNF-α水平存在相关性（r=0.391,p=0.022）,但与IL-1β和IL-6水平均无明显相关性（r=0.032、0.164,p=0.855、0.355）。结论:慢性脑低灌注损伤后p75NTR可能与TNF-α等炎症因子有关,并共同参与了CCH-VCI的发病。第二部分氧糖剥夺条件下p75神经营养素受体在人神经母细胞瘤细胞中的表达和作用目的:探讨氧糖剥夺（OGD）条件下p75神经营养素受体（p75NTR）在人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中的表达变化和作用。材料和方法:SH-SY5Y细胞OGD模型的建立采用三气培养箱无糖无血清培养方法。模型成功建立后设立3组:无血清常规培养组（对照组）、OGD组和OGD+p75NTR竞争性阻断剂LM11A-31处理组（OGD+LM11A-31组）。在细胞培养12h时用利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测3组细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）活力检测试剂盒测定LDH释放活力,流式细胞术检测凋亡细胞比例,蛋白质印迹法检测p75NTR的蛋白表达。结果:成功构建SH-SY5Y细胞OGD模型。细胞培养12h时,OGD组细胞存活率（%）显着低于对照组,（50.34±5.55 vs.94.80±4.06,P<0.05）;OGD+LM11A-31组细胞存活率同样低于对照组（64.68±4.59 vs.94.80±4.06,P<0.05）,但高于OGD组（64.68±4.59 vs.50.34±5.55,P<0.05）。OGD组LDH释放活性（U/L）显着高于对照组（353.09±30.67 vs.46.93±5.49,P<0.05）;OGD+LM11A-31组LDH释放活性同样高于对照组（282.20±25.60 vs.46.93±5.49,P<0.05）,但低于OGD组（282.20±25.60 vs.353.09±30.67,P<0.05）。OGD组细胞凋亡比例（Q2+Q4,%）明显高于对照组（14.98±2.59 vs.1.82±0.45,P<0.05）;OGD+LM11A-31组凋亡细胞比例也高于对照组（7.36±1.98 vs.1.82±0.45,P<0.05）,但低于OGD组（7.36±1.98 vs.14.98±2.59,P<0.05）。OGD组p75NTR相对表达水平高于对照组（0.41±0.02 vs.0.06±0.01,P<0.05）;OGD+LM11A-31组p75NTR表达也高于对照组（0.19±0.03 vs.0.06±0.01,P<0.05）,但是低于OGD组（0.19±0.03 vs.0.41±0.02,P<0.05）。结论:氧糖剥夺条件下p75NTR在SH-SY5Y细胞中表达增加,可能促进了神经细胞损伤和凋亡。第三部分p75NTR在慢性脑低灌注性认知损害模型小鼠神经损伤中的作用目的:研究p75NTR在慢性脑低灌注性认知损害模型小鼠脑内的表达和在这种慢性脑缺血缺氧条件下对神经损伤的影响。材料和方法:采用双侧颈动脉不完全结扎的方法建立慢性脑低灌注性认知损害（CCH-VCI）小鼠模型（均为5月龄雌性c57BL/6小鼠）。设置正常对照组（Control）、假手术组（Sham）、手术模型组（CCH-VCI）和模型药物干预组（CCH-VCI+LM11A-31）,采用ELISA检测外周血中炎症因子水平,组织化学和Western blotting方法检测各组小鼠脑内NF-κB表达和磷酸化水平、神经凋亡和JNKs表达及磷酸化水平、树突棘数量密度和PSD-95表达情况,以及p75NTR在各组的表达。结果:通过双侧颈动脉不完全结扎成功建立CCH-VCI小鼠模型。分组实验显示,CCH-VCI组与假手术组比较其小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平增高（TNF-α:129.17±5.42 vs.29.64±4.27;IL-1β:40.67±3.69 vs.16.13±2.41;IL-6:50.59±8.88vs.14.43±2.93;pg/ml,P均<0.05）、脑内p75NTR相对表达上调（0.400±0.037 vs.0.053±0.005,P<0.05）、NF-κB p65表达和磷酸化水平增高（p65/β-Actin:0.349±0.033 vs.0.073±0.003,P<0.05;p-p65/p65:0.587±0.055 vs.0.310±0.018,P<0.05）、JNKs表达和磷酸化水平增高（JNKs/β-Actin:0.348±0.009 vs.0.057±0.001,P<0.05;p-JNKs/JNKs:0.463±0.015 vs.0.282±0.049,P<0.05）、神经凋亡增加（TUNEL阳性染色面积比%:1.587±0.128 vs.0.363±0.021,P<0.05）、PSD-95表达降低（0.144±0.004 vs.0.495±0.019,P<0.05）、树突棘数量密度降低（0.160±0.055 vs.0.480±0.084,P<0.05,个/μm）,而p75NTR被阻断后上述变化程度降低,且正常对照组和假手术组之间均无统计学差异。结论:p75NTR在慢性低灌注性认知损害中对神经炎症反应、神经凋亡、突触可塑性破坏等环节起到介导和调节作用,是有效干预的潜在靶点。通过以上结果,本课题研究得出以下结论:1.p75NTR参与了慢性脑低灌注性认知损害的发病基础,其本质是p75NTR参与介导了慢性缺血缺氧条件下的神经损害过程。2.在慢性缺血缺氧条件下p75NTR表达上调并促进与神经损伤有关的病理过程,如神经炎症反应、神经凋亡。3.在慢性缺血缺氧条件下,p75NTR通过促进神经炎症反应、神经凋亡和神经突触可塑性等机制环节从而促进了神经损伤的发生,并破坏神经网络和结构的完整性,这也是慢性脑低灌注性认知损害的重要病理机制之一,有希望成为其有效的干预靶点。
许位[6]（2020）在《新型AMPA受体拮抗剂对大鼠脑梗死再灌注损伤的脑保护作用的实验研究》文中指出目的探讨新型AMPA受体拮抗剂对大鼠脑梗死再灌注损伤的脑保护作用及其作用的治疗时间窗。方法选取90只SD雄性大鼠,体重250～300g。采取改良Longa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion）模型。实验组分为:假手术组（Sham组）15只,模型组（MCAO组）15只,他仑帕奈组（Talampanel,TAL组）60只,其中治疗组（TAL组）又分为四个亚组即:TAL0h组、TAL1h组、TAL3h组、TAL5h组,各组15只。Sham组将大鼠成功麻醉后不插入线栓至右侧大脑中动脉,只将其分离;MCAO组将大鼠成功麻醉后将线栓插入至右侧大脑中动脉,堵塞血管,60min后撤线栓恢复血流,Sham组和MCAO组均经尾静脉给予等量生理盐水。成功制备MCAO模型后,TAL组大鼠分别在血流复灌注后0h、1h、3h和5h经尾静脉注射他仑帕奈（12mg/kg）。在MCAO制备成功后的第1h内,维持大鼠核心体温在36-37℃。24h后对各组大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测脑梗死体积;HE染色观察海马CA1区神经元的形态变化;免疫组化染色检测各组大鼠梗死周围区半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达及梗死皮质区神经元的存活数量。结果1各组大鼠脑梗死病灶体积及神经功能缺损比较:Sham组大鼠神经功能表现正常,未出现神经缺损症状,未见脑梗死病灶。TAL各治疗亚组及MCAO组大鼠均出现不同程度的神经功能缺损症状,不同大小的脑梗死病灶可见于右侧大脑中动脉供血区。与MCAO组相比,TAL各治疗亚组中神经细胞受损程度明显有所减轻,神经功能损伤评分及脑梗死体积明显降低（P<0.05）。其中,TAL各治疗亚组中,0h组、1h组、3h组相比于5h组,神经缺损评分及梗死病灶体积有明显降低（P<0.05）。2HE染色观察大鼠海马CA1区神经元:Sham组中,形态完整,神经元细胞紧密排列,胞质透明,核仁清晰可见;其中TAL各治疗亚组和MCAO组中海马CA1区神经细胞排列紊乱,胞核固缩甚至坏死,组织间均出现不同程度的水肿变性,与MCAO组相比,在TAL各治疗亚组中,组织水肿及神经元细胞变性程度明显减轻。3免疫组化:在各组实验大鼠中,Sham组大脑皮质区可见大量存活神经元,排列致密,只可见极少量的细胞表达caspase-3。而在MCAO组中,缺血半暗区细胞凋亡数量显着增加,可见大量细胞caspase-3表达阳性,同时脑梗死皮质区神经元数量显着减少。而TAL各治疗亚组相比于MCAO组,缺血半暗区细胞表达caspase-3的数量明显减少,梗死皮质区存活神经细胞的数量均增加明显,差异均具有统计学意义（P<0.05）,在TAL各治疗亚组,相比于TAL5h组,0h组、1h组及3h组凋亡细胞数减少明显,同时梗死皮质区存活神经元数量明显增加,其结果均具有统计学差异（P<0.05）。结论1 AMPA受体拮抗剂他仑帕奈对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的脑保护作用,能够减少神经功能缺损评分及脑梗死体积,降低神经元caspase-3的表达。2当缺血再灌注后5h时给药,他仑帕奈对大鼠脑组织缺血复灌引起的损伤脑保护作用明显减弱。图10幅;表4个;参137篇。
孔婷婷[7]（2020）在《Orexin-A/OX1R系统通过调控ERK1/2信号通路抑制脑缺血-再灌注损伤的机制研究》文中研究表明研究目的缺血性脑卒中（Ischemic stroke）是严重威胁人类身心健康的脑血管疾病,发病率一直高居不下,目前仍处上升趋势。众所周知,缺血性脑卒中除溶栓外无特异有效的预防以及治疗方法,而溶栓后会进一步造成脑缺血-再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）,其机制非常复杂。研究发现在 CIRI过程中存在ERK1/2信号通路的激活。另报道Orexin-A是主要由下丘脑分泌的一种神经肽,通过其与G-蛋白偶联受体结合抑制脑梗死体积,对CIRI具有神经保护作用,然其作用机制尚需进一步研究。因此,本课题将探讨Orexin-A如何通过影响ERK1/2信号通路对CIRI发挥神经保护作用,为探索延缓或阻止CIRI神经损伤提供有效策略,为临床应用提供理论依据和实验基础,以期减弱缺血-再灌注损伤,挽救缺血半暗带神经元,从而改善行为和认知功能。研究方法选用SPF级wistar大鼠制备大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型以及体外培养SH-SY5Y细胞制备氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型。采用随机数字法将大鼠分为假手术组（Sham）、模型组（I/R）、建模后Orexin-A单独干预组（OXA）、建模后Orexin-A和SB334867共同干预组（SB+OXA）以及建模后PD98059单独干预组（PD）。SH-SY5Y细胞体外实验分组:对照组（Control）、模型组（OGD/R）及建模后Orexin-A干预组（OXA）、Orexin-A 和 SB334867 共同干预组（SB+OXA）和 U0126 干预组（U0126）。大鼠造模前需禁食12小时,造模并干预完成后取皮层组织进行检测。首先对建模后p-ERK1/2的表达差异进行检测,以验证CIRI的发生发展过程确实伴有ERK1/2的激活;利用Orexin-A对于模型组进行干预,验证其神经保护作用以及对p-ERK1/2的表达影响;利用SB334867先于Orexin-A对模型组进行干预,检验Orexin-A的保护作用是否减弱或者消失,以验证Orexin-A通过OX1R发挥作用;选择p-ERK1/2的抑制剂对于模型组进行单独干预,检测p-ERK1/2的表达受到抑制对于CIRI的影响。采用逆转录PCR、蛋白质印迹等技术检测各处理组p-ERK1/2和OX1R在基因以及蛋白水平的表达差异;采用TTC染色实验检测各组大鼠脑梗死体积的差异;Tunel染色实验检测细胞凋亡情况;贴条实验和平衡木行走实验检测各处理组大鼠运动和感觉的差异。研究结果1.大鼠MCAO再灌注损伤和氧糖剥夺后复氧处理后均可诱导p-ERK1/2的高表达（p＜0.01,p＜0.05）,表明 ERK1/2 的激活参与了 CIRI。2.Orexin-A干预可降低大鼠脑梗死体积（p＜0.05）,降低细胞凋亡率（p＜0.01,p＜0.05）,表明Orexin-A具有神经保护作用;同时Orexin-A可以降低p-ERK1/2的高表达（p＜0.01,p<0.05）。3.基于OX1R在大鼠MCAO再灌注损伤和氧糖剥夺后复氧处理后在基因和蛋白水平表达均增高,选择OX1R拮抗剂SB334867进行干预,与Orexin-A单独干预组相比,SB334867共同干预后,大鼠脑梗死体积变大（p＜0.01,p＜0.05）,细胞凋亡率增高（p＜0.05）,p-ERK1/2的表达增高（p＜0.01,p＜0.05）,结果表明SB334867阻断或者部分阻断了 Orexin-A的神经保护作用。4.ERK1/2的抑制剂PD98059和U0126对体内外模型组进行干预,与模型组相比,干预后大鼠脑梗死体积变小（p＜0.05）,细胞凋亡率降低（p＜0.05）,结果表明ERK1/2活性的降低具有保护作用。研究结论CIRI可以激活ERK1/2通路,Orexin-A通过与OX1R的结合,降低ERK1/2磷酸化,降低大鼠脑梗死体积和细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。ERK1/2抑制剂阻断ERK1/2通路后,大鼠脑梗死体积和细胞凋亡率均降低。本研究有助于探讨Orexin-A/OX1R系统对脑卒中的调控作用和干预机制,为研究脑卒中的发病机制和治疗方法奠定理论与实验基础,为探寻新的药物靶点和新的治疗策略提供实验依据。
赵楠[8]（2018）在《脂质运载蛋白-2对小鼠缺血性卒中引起的星形胶质细胞功能极化的作用》文中提出背景与目的:星形胶质细胞在中枢神经系统广泛分布,具有多种重要的功能。既往研究表明星形胶质细胞可以在不同的条件下被激活,成为不同的表型,具有不同的功能,这个过程被称为星形胶质细胞的极化现象。经典激活的星形胶质细胞可以产生促炎症的细胞因子,从而具有加重炎症和损伤的作用;与之相对的,替代激活的星形胶质细胞,会产生抑制炎症促进组织修复的作用。在过去的研究中,中枢神经系统感染性疾病是星形胶质细胞激活的重要条件,但在缺血性卒中的病理条件下星形胶质细胞激活的研究甚少,而关于星形胶质细胞功能极化的问题更是没有涉及。脂质运载蛋白2（Lipocalin-2,LCN2）是一种与炎症相关的急性期蛋白。它在肺,肾,乳腺,脑等多种疾病中被广泛研究,被证明具有多种调控作用。在中枢神经系统的许多疾病中,LCN2都起到了重要的调控作用。但目前为止,关于LCN2对卒中后神经恢复是利是弊,仍存在许多争议,有研究认为其具有信号传递,促进恢复的功能,也有研究认为其具有介导炎症,加重损伤的作用。有研究认为LCN2对于神经胶质细胞的表型具有一定的调控作用,但对于卒中后的星形胶质细胞功能极化的作用并不清楚。本研究希望通过小鼠的体内和体外实验,探究在缺血性卒中过程中星形胶质细胞的功能极化现象,和LCN2在其中所起的作用。并希望能够通过影响星形胶质细胞的功能极化进而影响缺血性卒中的神经功能预后。方法:在体外实验中我们使用糖氧剥夺实验来模拟缺血性卒中,在元代培养的星形胶质细胞中研究其不同的细胞的因子的表达情况,从而反映星形胶质细胞的表型。此外,活化后的星形胶质细胞与缺氧神经元的共培养可以反映不同活化方式的星形胶质细胞对神经元的功能情况。在体内实验中,C57小鼠的大脑中动脉栓塞（MCAO）模型用来模拟缺血性卒中的病理过程。为了研究LCN2的作用,我们使用了 LCN2基因敲除的小鼠和慢病毒转染过表达的小鼠,将它们与野生型小鼠进行比较。我们对小鼠的脑冰冻切片进行了免疫荧光的方法对相关蛋白进行共定位染色,通过7.0T的小动物核磁共振确定梗死体积,并使用小鼠的mNSS评分量表来评估小鼠的行为学,以观察神经损伤的情况。结果:（1）星形胶质细胞在缺氧后会出现多种炎症因子的高表达,说明其参与炎症应答反应;（2）缺氧条件下激活的星形胶质细胞中经典激活通路中的代表蛋白INOS的表达明显升高,经分选可见部分星形胶质细胞表达iNOS,另一部分不表达iNOS,并且两种星形胶质细胞对缺氧损伤的神经元具有不同的作用,iNOS阳性的星形胶质细胞对神经元具有加重损伤的作用,而iNOS阴性的星形胶质细胞对神经元具有保护作用,这种现象可以被称为功能极化现象;（3）无论在体内实验中还是体外实验中,LCN2的敲除均会导致星形胶质细胞的经典激活不能发生,而过表达LCN2对星形胶质细胞的经典激活有促进作用;（4）敲除LCN2的小鼠与野生型相比具有较小的梗死体积和较低的mNSS评分,过表达LCN2的小鼠则具有相反的结果。结论:星形胶质细胞在缺血性卒中后可以发生功能性极化,并对神经元的损伤产生影响,LCN2可以通过对星形胶质细胞的经典激活通路的促进作用,加重小鼠卒中后神经功能的损伤。
叶治[9]（2009）在《线粒体ATP敏感性钾离子通道及活性氧介导七氟醚迟发型脑保护作用机制探讨》文中研究指明临床上常见的严重颅脑外伤手术、控制性降压、颅内动脉瘤夹闭术和冠状动脉旁路移植术以及颈动脉内膜剥脱术等的病人都具有潜在脑缺血的可能。例如:为便于脑动脉瘤手术实施和减少术中出血,常将脑动脉血管短暂夹闭,然而随着受阻血管血流的恢复,往往会导致局部性脑组织缺血/再灌注（ischemic-reperfusion injury,I/R）损伤。而在实际工作中,临床医生不仅关心术中的神经系统的保护,更关心术后神经功能的恢复。探求脑缺血损失的发病机制、减轻脑缺血性损伤、降低脑缺血性疾病的致残率和死亡率,已成为近年来神经科学领域广大工作者致力的研究目标。与脑缺血预处理相似,吸入麻醉药预处理与缺血损伤之间也有短暂的重要联系,包括两个重要时期:预处理早期阶段,即中断预处理刺激后5 min～2 h出现;第二个保护时期,延迟预处理期,出现在预处理刺激停止后12～24 h,并可持续24至72 h。已有研究证实七氟醚具有早期预处理的脑保护效应,在大鼠海马脑片模型中,反复吸入七氟醚（每天一次持续30 min,连续4天）能够诱导迟发型脑保护作用。目前,仍未知单次给予七氟醚是否能够诱导迟发型脑保护效应,值得进一步研究。大量研究证实,线粒体内膜ATP敏感钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mitoKATP),是吸入麻醉药预处理产生心肌保护作用的重要机制之一。而脑组织的mitoKATP通道蛋白浓度是心肌含量的6～7倍。因此我们有理由推测mitoKATP通道参与了七氟醚的迟发型脑保护作用。开放后的mitoKATP通道如何进一步介导脑保护作用?现在认为活性氧（reactive oxygen species,ROS）可能作为一种关键的细胞内信息物质,介导缺血缺氧预处理和mitoKATP开放剂预处理的心肌及脑保护作用。因此本课题探讨脑遭受缺血再灌注损伤前24 h,单次给予60 min七氟醚预处理是否产生迟发型脑保护效应,以及mitoKATP通道及ROS的作用。本课题首先通过观察缺血后大鼠的神经功能及测定脑梗塞容积百分比,并通过HE染色评定CA1区神经元形态学改变,明确不同浓度的七氟醚对SD大鼠产生迟发型的脑保护作用;其次第二部分通过加入特异性mitoKATP通道阻断剂及ROS清除剂,观察缺血后大鼠的神经功能及测定脑梗塞容积百分比和缺血侧项叶皮层神经元PKC-ε和-δ两种同功酶的膜转位变化,探讨七氟醚迟发型脑保护作用可能是通过mitoKATP通道和ROS所介导的,且PKCε和δ是否作为mitoKATP通道的下游靶点参与了七氟醚迟发型脑保护效应;之后,进一步研究和探讨p38MAPK信号通路可能也为mitoKATP通道的下游蛋白信号分子,参与了七氟醚诱导迟发型脑保护中的作用;随后,通过检测缺血后胞浆细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）的释放和Caspase-3活性变化,以及TUNEL染色等证实七氟醚迟发型预处理可以通过mitoKATP通道及ROS介导,抑制缺血再灌注损伤后神经元的凋亡,明确七氟醚迟发型脑保护机制;最后通过用紫外分光光度计测定各组缺血侧皮层神经元线粒体通透转运通道（MPTP）开放程度,Western-blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达情况,探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响及可能机制,证实了激活和开放mitoKATP通道在七氟醚抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护效应中起到重要作用。结果证实:（1）缺血前24h,短暂的予以2.4%及4.0%的七氟醚预处理可增强大鼠耐受局灶性脑缺血损伤,产生显着的迟发型脑保护效应,但短时间高浓度（4.0%）吸入七氟醚有引起动脉血pH值及MAP降低的趋势。（2）mitoKATP通道和活性氧介导七氟醚对局灶性脑缺血再灌注损伤的迟发型保护作用,其机制可能与调控PKC-ε转位激活有关,但PKC-ε转位激活仅发生于脑保护的早期相,提示可能有其他的信号通路机制参与七氟醚迟发型脑保护作用。（3）七氟醚可以诱导大脑皮层磷酸化p38MAPK表达的增加,且p38MAPK可能做为线粒体ATP敏感性钾离子通道抗脑缺血再灌注损伤中的下游通路,参与了七氟醚预处理的迟发型脑保护作用。（4）七氟醚通过抑制缺血后细胞色素c释放、Caspase-3的激活以及神经元的凋亡发挥迟发型脑保护作用,其作用可能与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoKATP)以及活性氧有关。（5）七氟醚预处理能通过激活mitoKATP通道上调bcl-2蛋白的表达,抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护作用。总之,脑缺血缺氧所致的神经元损伤并非是单一的病理生理过程,而是一系列复杂的生化级联反应。七氟醚的脑保护作用也并非单一作用于上述的某一环节,而是多位点、多途径、交互作用的结果。第一部分七氟醚对大鼠缺血再灌注损伤的迟发型脑保护作用目的观察缺血前24 h单次予以2.4%或4.0%的七氟醚（sevoflurane,Sevo）60 min是否产生迟发型的脑保护作用。方法健康SD雄性大鼠60只,体重250～280 g,随机分为4组:假手术组（S组）,单纯缺血再灌注组（IR组）,2.4%七氟醚组（Sevol组）,4.0%七氟醚组（Sevo2组）。七氟醚预处理组在制备MCAO模型前24h,吸入浓度为2.4%或4.0%七氟醚+氧气60 min;而S组和IR组在制备MCAO模型前24 h,吸入浓度为100%氧气60 min。24 h后用10%水合氯醛（300～350mg/kg）麻醉大鼠后,分离右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,结扎颈外动脉和颈总动脉近端,经颈总动脉向颈内动脉插入栓线,放置到大脑前动脉起始部,阻断大脑中动脉。S组只分离血管,不阻断大脑中动脉的血流。缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,用神经功能缺陷评分观察动物神经行为学改变、TTC染色法测大鼠脑梗死容积百分比。额外取12只雄性成年SD大鼠随机分为IR组,Sevo1组,Sevo2组。均用4.0%七氟醚（氧流量4.0 L/min）动物麻醉面罩吸入诱导麻醉,2.4%七氟醚（氧流量1.5～2.0 L/min）面罩持续吸入维持麻醉深度。分离、暴露右侧股动脉,动脉置管后缝合局部皮肤。停用七氟醚,待大鼠清醒后,放入七氟醚麻醉预处理箱内,接好持续动脉测压,体温测量装置。Sevo1组,Sevo2组通过麻醉气体挥发罐持续输入含有2.4%或4.0%七氟醚的O2（4L/min）,而IR组持续输入100%的纯氧。三组大鼠均保留自主呼吸。在七氟醚或氧气预处理前5 min以及结束时抽取动脉血检测动脉血气、血糖并记录平均动脉压（MAP）,心率（HR）,体温（T）等参数。结果IR组缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,神经功能缺陷评分分别为4（2～6）,4（3～6）及4（3～6）,脑梗死容积百分比分别为22.6±4.0%,33.7±4.3%,31.1±3.4%。与IR组相比,缺血2 h,再灌注6,24,72h后,Sevo1组和Sevo2组均明显改善神经功能及显着减少脑梗死面积（P＜0.05）,神经功能缺陷评分Sevo1组分别为2（1～5）,3（1～4）,3（2～5）,Sevo2组分别为2（1～4）,3（2～4）,3（1～5）。脑梗死容积百分比Sevo1组分别为:14.3±3.5%,23.4±4.7%,25.7±3.0%;Sevo2组分别为:15.6±4.5%,23.8±3.7%,27.1±4.0%。但Sevo1组与Sevo2组之间神经功能缺陷评分及脑梗死容积差异无统计学意义（P＞0.05）。与IR组相比较,Sevo1组,pH值,动脉血二氧化碳分压（PaCO2）,动脉血氧分压（PaO2）,血糖（BS）以及血流动力学参数（MAP,HR）,体温（T）均无显着差异;但Sevo2组pH值较IR组及Sevo1组有所降低,差异有统计学意义。结论缺血前24 h,短暂的七氟醚预处理可增强大鼠耐受局灶性脑缺血损伤,产生显着的迟发型脑保护效应。短时间高浓度吸入七氟醚有引起动脉血pH值及MAP降低的趋势。第二部分PKCε参与七氟醚预处理诱导的迟发型脑保护作用及mitoKATP通道和ROS的影响目的探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性缺血再灌注损伤的迟发型脑保护作用和对PKC-ε,δ转位激活的影响以及与mitoKATP通道和活性氧（ROS）生成的关系。方法健康雄性SD大鼠,体质量220～300 g,采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型（middle cerebral arteryocclusion,MCAO）并随机分为7组:假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、七氟醚预处理组（Sevo组）、mitoKATP通道阻断剂5-羟葵酸盐（5-HD）+七氟醚（5-HD+Sevo组）、ROS清除剂2-硫基丙酰氨基乙酸（2-MPG）+七氟醚（MPG+Sevo组）和单纯5-HD组及MPG组。除假手术组外,其余各组大鼠阻闭右侧大脑中动脉2 h,再灌注6,24和72 h。假手术组（S）;缺血再灌注组（I/R）:吸入100%纯氧60min,24 h后行大脑中动脉阻闭（MCAO）,缺血2 h,再灌注6,24,和72 h;七氟醚组（Sevo）:制备MCAO模型前24 h,吸入浓度为2.4%七氟醚+97.6%氧气60 min;5-HD+Sevo组:七氟醚预处理之前30 min,腹腔内注射mitoKATP通道阻断剂5-羟葵酸盐（5-HD）40mg/kg,余同七氟醚组;MPG+七氟醚组（MPG+Sevo）:七氟醚预处理之前30 min,经尾静脉予以ROS清除剂MPG 20 mg/kg,余同七氟醚组;单纯5-HD组:吸入氧气前30 min,腹腔内注射mitoKATP通道阻断剂5-羟葵酸盐（5-HD）40 mg/kg,余同I/R组;单纯MPG组（MPG）:吸入氧气前30 min,尾静脉给予MPG 20 mg/kg,余同I/R组。缺血2h,再灌注6,24和72 h后进行神经功能缺陷评分（NDS）并取脑组织,运用TTC染色测算脑梗死容积百分比,再灌注6,24 h后运用Western-Blot法测定PKC-ε,δ膜转位水平。结果I/R组相比,七氟醚能明显改善缺血后的神经功能,减小脑梗死面积,而发挥迟发型脑保护作用（P＜0.05）,七氟醚预处理前30 min腹腔内注射mitoKATP通道阻断剂5-羟葵酸盐（5-HD）（40 mg/kg）或尾静脉给予ROS清除剂2-硫基丙酰氨基乙酸（2-MPG）（20 mg/kg）能拮抗七氟醚迟发型脑保护效应（P＜0.05）,单独使用5-HD及MPG则无明显影响（P＞0.05）。I/R组,MPG+Sevo组,MPG组之间脑梗死容积以及神经功能评分差异无统计学意义（P＞0.05）。此外,与I/R组相比,七氟醚显着促进PKC-ε,而非PKC-δ的膜转位激活,且仅发生于再灌注后6 h（P＜0.05）,七氟醚的此效应同样可以被mitoKATP通道阻断剂5-羟葵酸盐（5-HD）或ROS清除剂2-MPG所废止。结论mitoKATP通道和活性氧介导七氟醚对局灶性脑缺血再灌注损伤的迟发型保护作用,其机制可能与调控PKC-ε转位激活有关。第三部分p38MAPK参与七氟醚预处理迟发型脑保护效应及线粒体ATP敏感性钾离子通道的作用目的研究七氟醚迟发型预处理对大鼠皮层脑组织p38蛋白磷酸化激活的影响以及线粒体ATP敏感性钾离子通道的作用。方法实验分两部分,A)40只SD实验大鼠结束七氟醚预处理前0 h及七氟醚预处理后2 h、6 h、12 h、24 h、3 d,7d通过Western-bolt法检测p-p38MAPK表达情况;B)50只SD大鼠随机分为6组:缺血再灌注组（I/R）、七氟醚组（Sevo）、5-HD+七氟醚组（5-HD+Sevo）、SB 203580+七氟醚组、单纯SB 203580（SB）和单纯5-HD组（5-HD）。缺血2 h,再灌注24后进行神经行为学评分,TTC法检测脑梗死容积百分比以及Western-bolt法检测缺血侧顶叶皮层神经元磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）的水平。结果A):与对照组（七氟醚预处理前,即0 h）相比较,吸入七氟醚后2 h,p38MAPK磷酸化（p-p38MARK）明显增加,随着再灌注时间延长,p-p38MARK表达也逐渐增强,于再灌注后24 h达到高峰,并可至少持续3 d,再灌注7 d后基本回落至初始水平。B)与I/R组相比较,七氟醚预处理组能显着改善大鼠缺血后神经功能和明显减小脑梗死面积,但是七氟醚预处理前使用5-HD及SB203580干预,可以取消七氟醚预处理的脑保护作用。而与I/R组相比较,单独使用5-HD及SB203580对实验结果无明显影响。结论七氟醚可以诱导大脑皮层磷酸化p38MAPK表达的增加,且p38MAPK可能做为线粒体ATP敏感性钾离子通道抗脑缺血再灌注损伤中的下游通路,参与了七氟醚预处理的迟发型脑保护作用。第四部分七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤神经元凋亡的影响及机制目的探讨七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡、Caspase-3激活以及细胞色素c释放的影响。方法利用MACO法建立大鼠局灶性脑缺血模型,以酶活性测定、Western Blot免疫组化和TUNEL法对Caspase-3活性变化和激活、细胞色素c释放以及神经元凋亡进行规律性观察。结果缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,假手术组（Sham）胞浆未见明显的细胞色素C释放及活性Caspase-3。与Sham组相比较,缺血再灌注组（I/R）细胞色素C胞浆释放及活性Caspase-3明显增加。与I/R组相比较,七氟醚预处理显着减少细胞色素C的胞浆释放及活性Caspase-3增加。七氟醚预处理前给与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoKATP)抑制剂5-HD以及活性氧（ROS）清除剂2-MPG,可以废除七氟醚抑制细胞色素C释放及活性Caspase-3增加的效应（P＜0.05）,但与I/R组相比较,单纯给与5-HD及2-MPG,对缺血后各时点细胞色素C的胞浆释放无明显影响。缺血2 h,再灌注24 h后使用TUNEL法检测凋亡神经元显示,与I/R组相比,七氟醚能明显减少缺血后神经元的凋亡,同样线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoKATP)抑制剂5-HD以及活性氧（ROS）清除剂2-MPG,可以废除七氟醚抑制神经元凋亡的效应。结论七氟醚通过抑制缺血后细胞色素c释放、Caspase-3的激活以及神经元的凋亡发挥迟发型脑保护作用,其作用可能与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoKATP)以及活性氧有关。第五部分七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响目的探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响及可能机制。方法雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组（Sham组）;缺血损伤组（I/R组）:吸入纯氧60 min,24h后行大脑中动脉阻塞2 h,再灌注24 h造成局灶性脑缺血再灌注;七氟醚预处理组（Sevo组）:缺血前24 h吸入2.4%七氟醚60 min;5-HD+Sevo组:腹腔内注射5-HD 40 mg/kg,30 min后同Sevo组。5-HD组:腹腔内注射5-HD 40 mg/kg,30 min后同I/R组,用紫外分光光度计测定各组缺血侧皮层神经元线粒体通透转运通道（MPTP）开放程度,Western-blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达情况。结果I/R组线粒体(max A520—min A520)呈现快速下降,且比假手术组更为显着（P＜0.05）;与I/R组相比较,七氟醚预处理组（Sevo）能缓解Ca2+诱导的(maxA520—minA520)的下降（P＜0.05）;但七氟醚预处理前腹腔内注射线粒体ATP敏感性钾离子通道特异性抑制剂5-HD 40mg/kg,可取消七氟醚的此作用,而单独使用5-HD则无影响。同样,与I/R组比较,七氟醚可明显增加bcl-2蛋白表达（P＜0.05）;七氟醚预处理前使用5-HD,可以取消七氟醚增加bcl-2蛋白表达的效应（P＜0.05）;除假手术组外,各组间Bax的表达差异无统计学意义。结论七氟醚预处理能通过激活mitoKATP通道上调bcl-2蛋白的表达,抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护作用
徐智[10]（2006）在《缺氧对大鼠TNF-α、IL-1β表达的影响及其调控机制的研究》文中研究指明临床和实验研究表明,急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）与多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）的发生密切相关,多数ARDS患者不同程度合并有肺外器官功能障碍。在MODS发生发展过程中,ARDS出现最早、发生率最高。ARDS实质上是一种以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为特征的急性呼吸衰竭。顽固性低氧血症不仅是ARDS的重要特征,也是继发多脏器损害的重要发病机制。缺氧导致器官功能损害除与细胞能量代谢障碍、代谢性酸中毒有关外,还可能与炎症细胞被激活,炎症因子大量释放有关。本研究观察缺氧对大鼠血浆中TNF-α、IL-1β浓度的影响,探寻血浆中TNF-α、IL-1β的组织或细胞来源,并进一步探讨缺氧诱导单核细胞产生TNF-α、IL-1β的信号途径和调控机制,从新的角度探讨缺氧在MODS肺启动机制中的作用,以期为MODS的临床防治提供理论依据和新策略。方法:1.采用低氧混合气（8% O2, 5% CO2, 87% N2）吸入法复制缺氧大鼠模型,检测缺氧0、1、3、6、9、12、24 h血浆、肺、心、肝、肾组织中TNF-α、IL-1β的蛋白含量（ELISA）及外周血单个核细胞TNF-α、IL-1β的mRNA表达量（RT-PCR）。2.分离纯化大鼠外周血单核细胞（peripheral blood monocyte, PBMC ）,随机分为缺氧组、缺氧+Chelerythrine组、缺氧+Forskolin组,各组又分为0、1、3、6、9、12、24 h 7个时相点。缺氧组直接行低氧培养（3% O2, 5% CO2, 92% N2）,后两组分别在培养基中加入10μM Chelerythrine溶液、50μM Forskolin溶液再行低氧培养（3% O2,5% CO2, 92% N2）。检测各组单核细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达量及PKC、Raf-1、MAPK、IKK、NF-κB活性（采用RT-PCR法和相应试剂盒）;观测缺氧组单核细胞膜PKCα、PKCε蛋白含量及活性（采用Western-blot法和相应试剂盒）。3. 60只缺氧大鼠模型分为缺氧组、缺氧+Chelerythrine组,各组又分为0、3、6、9、12、24 h 6个时相点。两组均吸入低氧混合气（8% O2, 5% CO2, 87% N2）。缺氧+Chelerythrine组于缺氧前静脉注射Chelerythrine （5 mg/Kg体重, 1次/12 h）。检测血浆
二、培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究（论文提纲范文）
（1）醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 醒脑健神方治疗缺血性中风(痰热腑实证)的临床研究 |
| 1 试验目的 |
| 2 试验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 网络药理学预测及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 HPLC-MS/MS法成分测定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 基于蛋白质组学的醒脑健神方对PC12的抗缺氧机制研究 |
| 第一节 4D Lable Free定量蛋白质组学检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二节 PRM定量蛋白质组学检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第三节 修饰预筛选 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（2）脑白质脱髓鞘性损伤在慢性缺氧致抑郁发生中作用及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 脱髓鞘损伤与慢性缺氧致抑郁发生的相关性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 RhoA/ROCK通路在慢性缺氧引起抑郁发生中的调控作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 下一步工作方向 |
| 参考文献 |
| 文献综述 精神疾病与脱髓鞘损伤相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 AMPARs转运调节与突触可塑性之间的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Drp1在缺血缺氧损伤中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 创伤休克血管低反应性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）慢性缺血缺氧条件下p75神经营养素受体在神经损害中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性低灌注性认知损害患者血清P75神经营养素受体细胞外段水平及其与炎症因子的关系 |
| 一、引言 |
| 二、资料与方法 |
| (一)研究对象 |
| (二)材料和仪器 |
| (三)方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)三组研究对象基本资料情况 |
| (二)三组研究对象血清p75NTR-ECD、炎症因子水平比较 |
| (三)CCH-VCI组血清p75NTR-ECD与炎症因子相关性分析 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 氧糖剥夺条件下P75神经营养素受体在人神经母细胞瘤细胞中的表达和作用 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| (一)材料 |
| (二)方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)SH-SY5Y细胞OGD模型的建立 |
| (二)LM11A-31干预浓度的确定 |
| (三)分组实验中细胞存活率和LDH释放活性 |
| (四)细胞凋亡检测 |
| (五)p75NTR蛋白表达 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 p75神经营养素受体在慢性脑低灌注性认知损害模型小鼠神经损伤中的作用 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| (一)材料 |
| (二)方法 |
| 三、实验结果 |
| (一)慢性脑低灌注性认知损害小鼠模型的建立 |
| (二)p75NTR表达变化 |
| (三)神经炎症反应 |
| (四)神经细胞凋亡 |
| (五)神经突触可塑性 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 血管性认知损害的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 p75NTR 与神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 论文发表及参加科研情况 |
| 致谢 |
（6）新型AMPA受体拮抗剂对大鼠脑梗死再灌注损伤的脑保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验试剂及药品 |
| 1.1.3 主要仪器和器材 |
| 1.1.4 主要试剂的配置 |
| 1.1.5 实验动物分组和处理 |
| 1.1.6 制备模型方法 |
| 1.1.7 神经功能评分 |
| 1.1.8 脑梗死体积测定 |
| 1.1.9 制备石蜡切片 |
| 1.1.10 HE染色海马CA1区脑组织 |
| 1.1.11 免疫组织化学检测caspase-3 阳性细胞及皮质区存活神经元数量 |
| 1.1.12 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠脑梗死体积比较 |
| 1.2.2 大鼠Longa评分比较 |
| 1.2.3 大鼠海马区神经元形态变化 |
| 1.2.4 大鼠梗死周围区Caspase-3 阳性细胞情况比较 |
| 1.2.5 大鼠梗死皮质区神经元存活情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 脑缺血再灌注损伤相关机制及治疗进展 |
| 2.1 脑缺血再灌注损伤发病机制 |
| 2.2 缺血性脑卒中的药物治疗及其机制 |
| 2.2.1 抗兴奋性毒性剂 |
| 2.2.2 自由基清除及抗氧化剂 |
| 2.2.3 抗炎剂 |
| 2.2.4 抗细胞凋亡剂 |
| 2.2.5 多效制剂 |
| 2.2.6 组合剂 |
| 2.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（7）Orexin-A/OX1R系统通过调控ERK1/2信号通路抑制脑缺血-再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ERK_(1/2)信号通路在缺血否灌注损伤中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附件 |
（8）脂质运载蛋白-2对小鼠缺血性卒中引起的星形胶质细胞功能极化的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 卒中概况 |
| 1.2 星形胶质细胞的在缺血性卒中过程中的多种功能 |
| 1.3 星形胶质细胞的极化 |
| 1.4 LCN2在中枢神经系统疾病中的多种功能 |
| 第二章 缺血缺氧后星形胶质细胞的功能极化现象 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 实验动物及细胞 |
| 2.2.5 实验设计与分组 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 星形胶质细胞缺血模型的建立 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 缺血缺氧后脂质运载蛋白2 (LCN2)对星形胶质细胞功能极化的重要作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 实验细胞 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 星形胶质细胞功能极化对缺血性卒中预后的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.2.4 实验动物和细胞(同上) |
| 4.2.5 实验设计与分组 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 论文总结 |
| 5.2 论文创新之处 |
| 5.3 论文的待改进之处 |
| 参考文献 |
| 已发表与待发表的论文 |
| 致谢 |
（9）线粒体ATP敏感性钾离子通道及活性氧介导七氟醚迟发型脑保护作用机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照说明 |
| 第一部分 不同浓度七氟醚预处理对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤的迟发型保护作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PKCε参与七氟醚预处理诱导的迟发型脑保护作用及mitoKATP通道和ROS的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 p38MAPK参与七氟醚预处理迟发型脑保护作用及线粒体敏感性钾离子通道的作用 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 七氟醚迟发型预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤神经元凋亡的影响及机制 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（10）缺氧对大鼠TNF-α、IL-1β表达的影响及其调控机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 缺氧对大鼠 TNF—α、IL 一1β表达的影响及其调控机制的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠缺氧模型血浆、器官、外周血单个核细胞中TNFα、IL-1β表达变化规律的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 缺氧诱导大鼠：PBMC 产生 TNF—α、IL-1β信号通路的研究 |
| 分题一 缺氧对大鼠PBMC PKC、Raf-1、MAPK、IKK 及 NF-κB 活性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分题二 PKC、Raf 抑制剂对缺氧条件下大鼠 PBMC TNF—α、IL-1β mRNA表达量及 PKC／Raf-1／MAPK／IKK／NF-KB 信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分题三 缺氧对大鼠 PBMC 膜 PKCa、PKCε含量及其活性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PKC 抑制剂对大鼠缺氧模型器官保护作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述一 ARDS 与 MODS 肺启动机制 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 核因子－κB 的激活调控机制与 SIRS |
| 参考文献 |
四、培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究（论文参考文献）
- [1]醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究[D]. 王新娜. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]脑白质脱髓鞘性损伤在慢性缺氧致抑郁发生中作用及其调控机制研究[D]. 李百川. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究[D]. 陈莎. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究[D]. 段晨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [5]慢性缺血缺氧条件下p75神经营养素受体在神经损害中的作用研究[D]. 陈甲. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]新型AMPA受体拮抗剂对大鼠脑梗死再灌注损伤的脑保护作用的实验研究[D]. 许位. 华北理工大学, 2020(02)
- [7]Orexin-A/OX1R系统通过调控ERK1/2信号通路抑制脑缺血-再灌注损伤的机制研究[D]. 孔婷婷. 山东大学, 2020(02)
- [8]脂质运载蛋白-2对小鼠缺血性卒中引起的星形胶质细胞功能极化的作用[D]. 赵楠. 南京大学, 2018(01)
- [9]线粒体ATP敏感性钾离子通道及活性氧介导七氟醚迟发型脑保护作用机制探讨[D]. 叶治. 中南大学, 2009(02)
- [10]缺氧对大鼠TNF-α、IL-1β表达的影响及其调控机制的研究[D]. 徐智. 第三军医大学, 2006(11)