海南欣安生物制药有限公司海南澄迈571924
摘要
本实验就含羞草多糖成分对?OH和?O2-的清除率进行了测定，研究其抗氧化能力。方法：采用水提醇沉法提取多糖，采用Fenton反应体系模式和邻苯三酚自氧化法对多糖的抗氧化活性进行了研究。结果表明，多糖对?OH和?O2-两种自由基均有一定的清除效果。
关键词：含羞草；多糖；抗氧化；?OH；?O2-
1前言
含羞草为豆科含羞草属植物含羞草MimosapudicaL.的全草[1]，现广泛分布于世界热带地区，我国各地均有栽培，主要分布在华南、华东、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁，植物资源丰富。
目前国内外对含羞草的研究仍然较少，国外曾有报道从含羞草中分离得到游离黄酮、黄酮苷、酚酸类等成分[2]，在抗氧化方面，既无测定方法文献报道，也无人做出对其有利的研究，其相关内容未见列出。
近年来的研究表明，许多疾病的发生和发展与自由基有着密切的关系。?OH和?O2-是生物体内主要的活性氧自由基，其中，?OH对细胞危害最大，当人体内的自由基产生过多或清除过慢，由它所引起的体内脂质过氧化就会造成机体疾病发生和衰老。人类的许多疾病如肿瘤、血管硬化以及衰老现象都涉及脂质过氧化作用[3]。因此，清除过量活性氧自由基具有重要的生理意义。
2实验部分
2.1实验材料
含羞草取自于海南大学校园，经晒干、粉碎后备用。
2.2药品与试剂
95%乙醇、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸等。
2.3实验方法
2.4.1含羞草多糖的制备
称取300g含羞草干粉，用800mL95%乙醇加热回流1h，抽滤，从乙醇浸提后的残渣中称取50g含羞草渣，用装有水（pH=7）的烧杯中浸泡1h，过滤，接着将滤液浓缩，离心，取其上清液浓缩，加其5倍体积的95%乙醇沉淀、静置至明显分层，弃去上清液，再离心，得白色晶体，即为含羞草水溶性多糖。用蒸馏水分别配制不同浓度的多糖溶液。
2.4.2含羞草多糖对?OH的清除能力
参考Fenton反应体系模式，利用H2O2与Fe2+混合产生?OH，但由于?OH具有很高的反应活性，存在时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉?OH，并产生有色产物。该产物在510nm处有强吸收，若在反应体系加入具有清除?OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争?OH，而使有色产物生成量减少。采用固定反应相同法，在相同体积的反应体系（1.5mL4.4mol/LH2O2，1.5mL4.5mmol/LFe2+，1.5mL1mmol/L水杨酸-乙醇溶液）加入一系列不同浓度的样品溶液。样品浓度梯度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL。以蒸馏水做空白组，利用紫外可见分光光度计对各浓度在510nm处的吸光度进行测量，便能测定被测物对?OH的清除作用。
2.4.3含羞草多糖对?O2-的清除能力
采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下，生成有色中间产物和?O2-，?O2-对自氧化有催化作用。具体操作：Tris-HCl缓冲溶液的配制：三羟甲基氨基甲烷1.211g溶于100mL水中，再加入5mL水、45mL0.1mol/LHCl，溶液的pH为8.2；邻苯三酚溶液的配制：将0.063g邻苯三酚溶于10mL水中，得到50mmol/L的邻苯三酚溶液。
取0.05mol/LTris-HCl（pH=8.2）缓冲液4.5mL，置于25℃水浴预热20min，加0.1mL不同浓度的样品，2.5mmol/L邻苯三酚0.4mL，混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用8mol/LHCl溶液终止反应。样品浓度梯度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL，以蒸馏水做空白组，利用紫外可见分光光度计对各浓度在299nm处的吸光度进行测量。按下式计算清除率。
清除率=（A空白－A样品）/A空白×100％
式中A空白、A样品分别为试剂空白液和样品液的吸光度。
3结果与讨论
3.1含羞草多糖的提取结果
称取含羞草干粉用95%乙醇加热回流，抽滤，将从乙醇浸提后的残渣用水（pH=7）浸泡，浓缩，离心，加入95%乙醇使之沉淀，再离心得到白色晶体，即含羞草水溶性多糖。
3.2含羞草多糖在510nm处的吸光度
采用固定反应相同法，在相同体积的反应体系加入一系列不同浓度的样品溶液，以蒸馏水做空白组，在510nm处测量各浓度的吸光度。浓度由小到大的吸光度分别为0.832（空白）、0.816、0.784、0.758、0.732、0.687。
3.3含羞草多糖对?OH的清除效果
向Fenton反应体系中加入一定量的样品溶液，引起吸光度一定程度的变化，说明样品可对?OH的生成产生抑制作用，能抑制或清除?OH的产生。含羞草多糖对?OH的清除率分别为1.92%、5.77%、8.89%、12.02%、17.43%。由此可见，含羞草多糖对?OH清除能力呈增长趋势。
3.4含羞草多糖在299nm处的吸光度
取Tris-HCl（pH=8.2）缓冲液置于25℃水浴预热20min，加入不同浓度的样品、邻苯三酚，混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用HCl溶液终止反应。以蒸馏水做空白组，在299nm处测量各浓度的吸光度。浓度由小到大的吸光度分别为0.755（空白）、0.651、0.618、0.597、0.586、0.550。
3.5含羞草多糖对?O2-的清除效果
在碱性条件下，邻苯三酚迅速发生自氧化，生成红色物质，同时释放出超氧阴离子，其自氧化速率与?O2-浓度有关。加入样品溶液后，体系红色变浅，邻苯三酚的自氧化速率降低，说明含羞草提取液具有清除?O2-的作用。各浓度的含羞草多糖对?O2-的清除率分别为13.77%、18.15%、20.93%、22.38%、27.15%。由此可见，含羞草多糖对?O2-清除能力呈增长趋势。
4小结
由以上实验可知，含羞草多糖对?OH和?O2-两种自由基均有一定的清除效果，且清除率与浓度存在剂量依赖关系，在浓度为0.0625—1mg/mL的范围内，清除率随着浓度的增加而增强。但体外模拟实验对体内自由基的清除起一定参考作用，并不能完全真实反映含羞草各组分在体内的抗氧化效果。植物各组分在体内有一定的协同作用，以及体内复杂的生理环境，有待于进一步采取动物实验进行活体研究。
参考文献
[1]袁珂,贾安,吕洁丽等.含羞草中新黄酮碳苷的结构鉴定[J].分析化学,2007,(05).
[2]KirkLF,MollerMV,ChristensenJ,etalA5-deoxyflavonolderivativeinMimosapudica[J].BiochemSystEcol,2003,31：103.