导读:本文包含了发形霞水母论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:水母,抗菌蛋白,Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂,杀菌,通透性增加蛋白
发形霞水母论文文献综述
周永红[1]（2016）在《基于发形霞水母触手转录组分析的抗菌活性蛋白的筛选、克隆表达与活性研究》一文中研究指出海洋微生物种类丰富,不仅有陆地常见的病原微生物,也有海洋特有的致病微生物。长时间与海水接触的皮肤和软组织创面极易出现弧菌感染,可在较短时间内引发严重的损伤,甚至危及生命。此外,随着滨海旅游业和海洋渔业的迅猛发展,海洋微生物引起感染的病例也越来越多见。常用抗生素对海洋致病微生物的感染治疗效果欠佳,亟需开发新型特异性抗海洋致病微生物的活性物质。水母是一种常见的海洋浮游动物,体腔开放浸泡于海水中,其口腕及伞部外沿生有细长的触手,与海水接触面积大,体表及机体组织长期接触多种致病性细菌和真菌。由于水母缺乏获得性免疫系统,因此其先天免疫防御系统功能强大,这对于生存在复杂海水表层环境中的水母抵御外界细菌、病毒入侵具有重要意义。尽管如此,目前对水母体内先天免疫防御系统的组成、重要抗菌蛋白的序列信息、表达情况、活性水平等尚不清楚。第一部分:基于Illumina Hi Seq?2000平台成功构建了发形霞水母(Cyanea capillata)触手组织转录组,共获得了50,536条有效Unigenes序列。其中21,357条Unigenes在公共数据库中得到同源注释。通过对其进行分析筛选和功能分类,我们发现该转录组中存在大量免疫防御功能相关的编码序列,如蛋白酶抑制剂、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、凝集素和热休克蛋白等。此外,还筛选出多种毒性作用相关分子、疾病相关分子、抗氧化活性因子和胶原蛋白等具有重要功能的编码序列。为今后深入研究水母免疫防御的物质基础和其他重要活性分子奠定了坚实的基础。第二部分:结合文献报道,从C.capillata转录组中筛选出两个重要抗菌活性蛋白编码序列,分别命名为CcKPI1(Cyanea capillata Kazal-type proteinase inhibitor 1)和CcBPI1(Cyanea capillata bactericidal/permeability-increasing protein 1),利用生物信息学分析软件对序列进行深入分析,发现CcKPI 1含176个氨基酸残基,预测分子质量为19.02kDa,为分泌蛋白。CcKPI1含有叁个高度保守的Kazal结构域。多重比对和进化树分析显示,CcKPI1和其他物种来源的Kazal型丝氨酸蛋白酶(KPI)相似度较高,表明该分子为水母来源的KPI家族新成员。CcBPI1含478个氨基酸残基,预测分子质量53.66 kDa,为分泌蛋白。CcBPI1含有两个典型的BPI结构域。多重比对和进化树分析显示,CcBPI1和其他物种来源的BPI相似度较高,表明该分子为水母来源的BPI家族新成员。成功构建了CcKPI1原核表达重组质粒CcKPI1-p ET24a、CcKPI1-p ET28a、CcKPI1-pET32a和CcKPI1-pGEX-6P-1,对比分析后确定最适合表达的重组质粒为CcKPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)pLysS中高效、稳定且以可溶性形式表达,获得与预期分子量一致的重组蛋白。通过?KTA蛋白分离纯化系统得到高纯度和高浓度的r CcKPI1融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳及GST抗体检测鉴定为目的蛋白。同时成功构建了CcBPI1原核表达重组质粒CcBPI1-pET24a、CcBPI1-pET28a、CcBPI1-pET32a和CcBPI1-pGEX-6P-1,对比分析后确定可以正确表达的重组质粒为Cc BPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)p LysS中少量表达,获得与预期分子量一致的重组蛋白。但由于rCcBPI1在原核系统中的表达量过低,不易纯化,因此进一步选择毕赤酵母表达体系对其进行诱导表达。将重组表达质粒CcBPI1-pPIC9成功转入毕赤酵母GS115中,但尚未获得正确表达的重组融合蛋白,表达条件还需进一步摸索和优化。第叁部分:实时定量PCR分析表明,CcKPI1与CcBPI1在检测的所有组织中均有表达。CcKPI1在性腺中表达量最高,其他依次是触手、伞盖和口腕。CcBPI1在口腕中表达量最高,其他依次是伞盖、性腺和触手。rCcKPI1重组蛋白的活性检测:(1)通过比色法测定rCcKPI1蛋白抑制丝氨酸蛋白酶的能力和抑制动力学参数,发现rCcKPI1蛋白能明显抑制枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K和弹性蛋白酶的活性,抑制常数分别为0.014、0.015和1.538μM,均为竞争性抑制。(2)通过免疫印迹实验和免疫共聚焦实验检测r CcKPI1蛋白和微生物结合的活性。结果表明,rCcKPI1蛋白能有效地结合多种微生物,包括金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、单胞霉菌和多种常见海洋致病性弧菌(创伤弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、需钠弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌),但未检测到其与鳗弧菌和霍利斯弧菌的结合活性。(3)通过微量液体稀释法检测rCcKPI1蛋白抑制微生物生长的能力,发现rCcKPI1蛋白可以显着抑制大部分与其有结合活性的微生物(细菌、真菌、常见的海洋致病弧菌等)的生长。结论:本研究成功构建了发形霞水母触手组织转录组,首次获取了发形霞水母的触手转录谱。通过对其进行分析筛选和功能分类,发现该转录组中存在大量重要生物学活性相关的编码序列,包括免疫防御相关因子、毒性效应分子、与疾病相关的分子、抗氧化相关蛋白和胶原蛋白等,为深入研究水母免疫防御的物质基础和其他重要活性分子奠定了坚实的基础。对筛选出的重要抗菌活性蛋白编码序列(CcKPI1和CcBPI1)进行了完整的生物信息学分析,通过重组克隆和诱导表达,纯化得到了两个序列明确、功能单一的重要抗菌功能蛋白。活性功能检测发现,CcKPI1具有明显的抑制丝氨酸蛋白酶的活性,抗菌功能研究发现,该分子能结合多种致病微生物并显着抑制微生物的生长。以上结果表明,CcKPI1具有明显的抗菌活性,能有效对抗常见致病细菌、真菌和常见海洋致病弧菌,推测CcKPI1可能在C.capillata免疫防御中发挥重要作用。本研究也为开发具有抗菌功能的新型海洋药物提供了科学依据和新的资源途径。(本文来源于《第二军医大学》期刊2016-05-01）
刘丹[2]（2016）在《一种发形霞水母来源多肽生长因子的生物学活性研究》一文中研究指出本课题组致力于发形霞水母(Cyanea capillata,C.capillata)来源的活性物质及相关机理研究多年。以往研究中,我们发现水母触手表现出超强创伤修复能力,且触手中刺细胞具有快速增殖的特点,提示水母触手中可能存在高活性促生长因子。在分析C.capillata触手提取物(tentacle extract,TE)的细胞活性时也观察到一个有趣现象,即低浓度的T E可以诱发细胞增殖。结合相关文献报道,我们推测TE中含有类似促增殖活性物质。本课题组前期建立了C.capillata触手组织c DNA文库,分析发现其中有四条血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)类似序列,为我们从TE中提取促生长活性物质提供了重要理论依据。组合应用多种分离技术,我们成功从TE中分离得到具有促生长活性的一个颗粒蛋白样多肽生长因子并命名为Cc GRN-1(Cyanea capillata granulin-1,Cc GRN-1)。因此,本课题将重点研究TE和Cc GRN-1的促生长活性及其作用机制。通过本课题的研究,我们希望可以为将来某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况提供新的治疗思路。方法第一部分:TE的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测TE对HUVECs细胞活力的影响。然后,通过流式细胞术检测TE对HUVECs细胞周期进程的影响;并检测其对细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1表达的影响。随后,采用Western Blotting检测TE对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK,p38 MAPK和NF-κB通路以及下游caspase-3,8,9和Cyto C蛋白的表达水平;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况进一步验证。随后,选择TE激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测TE对细胞迁移能力的影响。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测Cc GRN-1对HUVECs的细胞活力的影响。其次,通过流式细胞术检测Cc GRN-1对HUVECs细胞周期进程的影响,并检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表达变化情况。然后,采用Western Blotting检测Cc GRN-1对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,主要包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK和NF-κB通路;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况做进一步的验证。随后,选择Cc GRN-1激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测Cc GRN-1的促细胞迁移能力。同时,选取商品化血管内皮生长因子VEGF作为对照,并行分析其与Cc GRN-1的生物学活性及作用机制。结果第一部分:TE的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,高剂量TE抑制细胞生长,使HUVECs细胞活力呈剂量依赖性降低;而低剂量TE可以促进细胞活力明显升高。此外,流式细胞术结果显示,TE可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;TE还可以促进细胞周期蛋白的表达明显增加。在信号通路方面,TE可以激活HUVECs中PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路,而对p38 MAPK和NF-κB通路以及下游信号通路中包括caspase-3,8,9以及Cyto C蛋白表达没有影响;免疫荧光检测结果证实TE确实可以激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002和SP600125对其没有影响,说明TE主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,TE可以诱导HUVECs发生细胞迁移。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,Cc GRN-1和VEGF均对HUVECs活力具有时间和剂量依赖性促进作用。流式细胞术结果显示,两者均可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;此外,两者还可以促进细胞周期蛋白表达增加。在信号通路激活方面,Western Blotting结果显示Cc GRN-1和VEGF均可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而对JNK MAPK和NF-κB通路没有影响;免疫荧光检测结果证实了Cc GRN-1和VEGF确实可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002没有影响,说明Cc GRN-1主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,Cc GRN-1和VEGF均可以诱导HUVECs发生细胞迁移。结论低浓度TE可以提高细胞活力,加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,提示TE具有促细胞增殖效应;在作用机制方面,TE可以磷酸化激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK和JNK MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关,提示其可能与促细胞增殖有关;最后,细胞划痕修复实验表明TE可以诱导细胞迁移。另一方面,Cc GRN-1具有与VEGF类似的细胞活力效应,可以加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,表明Cc GRN-1具有与VEGF类似的促细胞增殖效应;在作用机制方面,Cc GRN-1也与VEGF类似,主要激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关;最后,通过细胞划痕修复实验表明Cc GRN-1与VEGF均可以诱导细胞迁移。基于Cc GRN-1和VEGF在促进细胞增殖方面具有很大的共性,我们认为Cc GRN-1作为一种海洋生物来源的多肽,对某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况可能具有良好的应用前景。(本文来源于《第二军医大学》期刊2016-05-01）
周永红,张慧,成熙,柳国艳,张黎明[3]（2015）在《发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族原核表达载体的构建及其表达》一文中研究指出目的获得发形霞水母丝氨酸蛋白酶,为深入研究发形霞水母丝氨酸蛋白酶的功能奠定基础。方法综合运用生物信息学分析发形霞水母丝氨酸蛋白酶分子的序列特征和活性功能。通过设计带有特异性酶切位点的引物,将编码发形霞水母丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列(CcSP1,CcSP2和CcSP3)从cDNA文库中扩增出来,利用pET-24a(+)载体构建重组表达质粒(pET24a-Cc SP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3),经过筛选和鉴定正确后转入表达菌Rosetta(DE3).plysS。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下表达,利用SDS-PAGE电泳和Western-blot分析表达的重组蛋白。结果 SDS-PAGE电泳结果可见重组质粒转化的表达菌分别在34、42和30kDa处有蛋白条带,Western-blot检测显示,这些蛋白可特异性与抗His抗体反应,分别与预测重组蛋白分子量一致,鉴定为正确表达的目的重组蛋白。结论本研究成功构建了发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族原核表达载体,获得了目标蛋白,为进一步研究水母丝氨酸蛋白酶的活性和功能奠定基础。(本文来源于《中国生化药物杂志》期刊2015年12期）
周永红,柳国艳,成熙,张黎明[4]（2015）在《发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族的原核表达载体的构建及其表达》一文中研究指出水母属刺胞动物门,是一类分布广泛、生物总量非常庞大的海洋浮游动物。近年来,全球许多海域多次出现了大规模水母暴发现象,并且范围在不断扩大。水母的暴发对海洋渔业、海滨旅游、沿岸工业和涉海人员安全等造成很大威胁,是继有害藻华之后最大的海洋生态灾害。事实上,水母也是对人类伤害最大的海洋动物,水母蜇伤是最常见的海洋生物伤。水母触手上密布刺丝囊,当触及人体或动物体时,发射刺丝进行袭击,同时释放出毒液,引起剧烈疼痛、恶心、麻痹、红疹等症状,严重时可以导致呼吸、循环衰竭甚至死亡。研究表明,水母毒素是一类主要存在于触手组织中,包含多种毒性组分的蛋白质与多肽类毒素。水母毒素毒性大,活性强,具有溶血性、心血管毒性、酶活性、神经毒性、肌肉毒性以及肝脏毒性等多种生物活性。为探究与水母毒素生理活性密切相关的功能活性基因的表达情况,深入研究水母毒素蛋白的结构、性质及生物学活性,前期我们构建了我国东南海域的主要致伤水母发形霞水母(Cyanea capillata)触手组织cDNA文库,利用大规模测序及生物信息学分析等手段获得了一系列包括金属蛋白酶、离子通道蛋白、凝集素、抗氧化酶类等活性因子的编码序列。其中,我们发现有叁条序列的开放阅读框所编码的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶家族高度同源,均包含一个典型的丝氨酸蛋白酶样结构域,表明该叁条序列所编码的蛋白同属丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶,在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用,它们通过对蛋白酶原的激活或抑制而发挥调节因子作用。丝氨酸蛋白酶类已被证实广泛存在于蛇类、蜘蛛等有毒动物的毒液中,作为毒素组分发挥重要作用,可能参与其他毒素组分的翻译后修饰和扩散。(本文来源于《第12届生物毒素研究及医药应用学术大会论文集》期刊2015-10-09）
常银龙,肖良,郑杰民,王倩倩,张黎明[5]（2014）在《发形霞水母触手提取物的蛋白稳定性及其溶血活性》一文中研究指出目的探讨不同环境因素和处理方法对发形霞水母(Cyanea capillata)触手提取物(tentacle extract,TE)蛋白稳定性及其溶血活性的影响。方法结合蛋白浓度测定、溶血活性检测和SDS-PAGE分析等方法研究不同环境因素和处理方法对TE蛋白稳定性及其溶血活性的影响。结果 TE溶血活性呈明显的剂量依赖关系,其半数溶血分数HU50=226μg/ml;40℃水浴1 h,能去除TE中大量杂蛋白,但仍保持显着溶血活性;TE在4℃放置28 d,其溶血活性保持稳定,25℃下3 d内其溶血活性变化不明显;p H值对TE溶血活性的影响呈钟形曲线,在p H 6.0~11.0之间活性相对稳定,p H 8.0是TE保持溶血活性的最优p H条件;不同缓冲液对TE稳定性及其溶血活性影响显着,浓度大于26%的硫酸铵溶液对TE溶血蛋白具有良好的盐析作用。结论 40℃水浴1 h预处理可显着减少TE中非活性蛋白组分,并降低样品黏性;4℃和p H 8.0是TE保持蛋白稳定性和溶血活性的最适条件;浓度大于26%的硫酸铵盐析有利于溶血蛋白组分富集。(本文来源于《药学实践杂志》期刊2014年06期）
贺茜[6]（2014）在《发形霞水母毒素的溶血活性及其分离纯化》一文中研究指出目的:探讨发形霞水母(Cyanea capglata)毒素制备方法、不同处理方法对毒素溶血活性的影响以及溶血活性蛋白的分离纯化。方法:采用剧烈机械振荡和离心相结合的方法快速制备水母毒素样品,显微观察制备过程中口腕部触手上刺丝囊的发射情况;分析脱盐、冻干、超滤等处理方法对毒素溶血活性的影响,分别利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法定向分离其中的溶血活性蛋白。结果:口腕部触手上的刺丝囊主要有梭形、椭圆形和球形叁种类型,毒素的半数溶血分数(HU_(50))为95μg/mL;直接冻干处理再复溶的毒素溶血活性保持不变,但脱盐后,冻干再复溶,其溶血活性消失;用100 kDa超滤管浓缩毒素样品,浓缩液有溶血活性,浓缩后的滤液没有溶血活性;阴离子交换层析的穿透峰和洗脱峰组分都没有溶血活性,凝胶过滤层析前毒素用3 kDa超滤管浓缩,超滤过程中析出的沉淀有溶血活性,层析后的5个洗脱峰组分都没有溶血活性。结论:剧烈机械振荡能有效刺激刺丝囊发射,并释放毒液,减少了组织蛋白或非毒素蛋白的混入;冻干处理不影响毒素的溶血活性,盐溶液环境有利于毒素溶血活性的保持;发形霞水母毒素溶血活性蛋白的分子量大于100 kDa,溶解性弱,易聚集形成沉淀,并且在纯化过程中溶血活性降低或丧失。(本文来源于《全国中西医结合卵巢功能调控专题学术会议论文及摘要集》期刊2014-10-24）
吴元琳[7]（2014）在《血管内皮细胞抗发形霞水母触手提取物缩血管反应的作用及机制研究》一文中研究指出目的：探讨血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）在抗发形霞水母（Cyanea capillata）触手提取物（tentacle extract，TE）缩血管反应中的保护作用，为防治C.capillata蜇伤提供新思路和新靶点。方法：1、验证TE对人奇静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的毒性作用：1.1MTT法测细胞存活率：收集我国沿海C. capillata并经鉴定后提取C.capillata TE样品。①以浓度梯度为控制因素，加入不同浓度（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml）TE孵育细胞密度为4×105个/ml的HUVEC细胞6h，MTT法检测经HUVEC细胞的存活率。②另一方面以不同浓度（1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE不同时间（6h，12h，24h，48h）孵育细胞密度为4×105个/ml的HUVEC细胞，MTT法检测HUVEC细胞的存活率。1.2流式细胞术测TE作用后HUVEC细胞凋亡坏死：加入不同浓度（0μg/ml、1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE处理HUVEC细胞6h后，采用流式细胞分析检测HUVEC细胞的凋亡。2、血管舒缩因子前列环素（Prostacyclin，PGI2）、血栓素（Thromboxane，TXA2）、血管紧张素（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）含量检测：2.1加入不同浓度TE（0μg/ml，1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml）作用HUVEC细胞6h，采用ELISA检测不同浓度TE作用HUVEC细胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。2.2浓度为5μg/ml TE加入HUVEC细胞后，分别作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后，采用ELISA检测TE不同孵育时间HUVEC细胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。3、观察SD大鼠股动脉血压（Blood pressure，BP）变化：SD大鼠（280～320g）麻醉后，行股主动脉插管及颈静脉插管法，分别予①对照组（0.9%生理盐水组）；②1.4mg/ml TE组；③10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组；④10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/ml TE组药物干预。观察1h内股动脉BP的变化情况，以明确药物干预效果及VECs在TE缩血管毒性过程中的保护作用，并为临床治疗水母蜇伤筛选出有效的治疗药物。4、SD大鼠心脏、肾脏功能的影响：在整体动物检测BP变化情况实验结束后，迅速从股动脉插管处抽取实验动物动脉血，检测心肌酶、肾功能（LDH、CK、sCr及BUN）。结果：1、TE对HUVEC细胞存活率的影响：①当TE浓度小于2.5μg/ml时，HUVEC细胞存活率为100%，细胞活性与正常对照组（TE浓度0μg/ml）相比无明显统计学意义（P＞0.05）；当TE浓度大于5μg/ml时，HUVEC细胞开始出现死亡，TE浓度为5μg/ml时细胞存活率为97.55%，TE浓度为10μg/ml时细胞存活率为50%，当TE浓度为320μg/ml时HUVEC细胞已几乎全部死亡，细胞存活率仅为4.83%，以上结果均有统计学意义。因此在浓度为5～320μg/ml范围内时TE对HUVEC细胞的毒性作用具有浓度依赖性，随着TE浓度的增加其对HUVEC细胞毒性增强。②同一浓度TE随着预孵时间的延长，对HUVEC细胞产生的毒性作用不断增强，TE的毒性作用具有时间依赖性(P<0.05)；当TE浓度为1μg/ml时，分别预孵HUVEC细胞6h和12h可见细胞存活率大于100%，由此可知TE在低浓度（≤1μg/ml）短时间（≤12h）内对HUVEC细胞具有促生长的作用，当TE浓度为2.5μg/ml时，预孵6h时细胞存活率100%，TE浓度为5μg/ml时，预孵6h时细胞开始出现死亡，TE浓度10μg/ml时HUVEC细胞大量死亡，细胞存活率小于50%(P<0.05)。由以上实验可知，浓度为5μg/ml的C.capillata TE预孵HUVEC细胞6h可引起细胞死亡,因此选择浓度为5μg/ml的TE做后续的实验；10μg/mlTE预孵6h可引起细胞明显死亡。2、TE致HUVEC细胞凋亡与坏死：TE浓度在1～10μg/ml浓度时，导致的细胞坏死不明显（P＞0.05），在1μg/ml和2.5μg/ml浓度时TE导致的细胞凋亡尚不明显（P＞0.05），当TE浓度5μg/ml时可有部分细胞凋亡，当TE浓度10μg/ml时可有大量细胞凋亡（P＜0.05）。3、血管舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量检测：①PGI2随TE作用浓度增加分泌量逐渐增大，TXA2随TE作用浓度增加分泌量无明显变化，PGI2/TXA2随TE作用浓度增大比值增大，AngⅡ随TE浓度增大分泌量增大，以上结果均有统计学意义。故HUVEC细胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可发生变化，且具有剂量依赖性，随TE浓度增大而增大。②TE（5μg/ml）预孵HUVEC细胞一定时间内（0min～12h）可引起HUVEC细胞舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量改变，PGI2随着TE刺激时间的延长分泌量逐渐增加，5min时分泌量达高峰，6h分泌量开始下降，但分泌量仍高于正常水平，12h与6h分泌量无明显差别；TXA2随着TE刺激时间的增加分泌量逐渐增高，在6h到达高峰，12h与6h分泌量无明显差别； AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平，在2h达最高值，6h分泌量又下降，但分泌量仍高于正常水平，分泌量6h与12h分泌量无明显差别，以上结果均具有统计学意义。4、SD大鼠股动脉BP变化在观察时间（60min）内，与对照组（0.9%生理盐水组）相比，1.4mg/ml TE组SD大鼠股动脉BP在前10min内明显下降，10min时达最低值，后逐渐升高，60min时恢复至起始BP水平，整个观察时间内BP平均值均低于对照组；10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组在观察时间内BP值较对照组无明显变化；10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/mlTE组在前10min内BP先下降后升高，在20～30min内恢复至对照组水平，后BP继续升高，且高于对照组，以上结果均具有统计学意义。5、SD大鼠心、肾功能检测：在整体动物股动脉BP监测实验结束后，从股动脉抽取实验动物动脉血，低温超速离心后取上清，行血生化检测结果显示与对照组（0.9%生理盐水组）相比，1.4mg/ml TE组SD大鼠心肌酶谱（LDH、CK）明显升高，肾功能（sCr、BUN）严重损害；10μmol/L环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE组、10μmol/L血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）+1.4mg/ml TE组心肌酶（LDH、CK）升高较1.4mg/ml TE组低，肾功能（sCr、BUN）损害较较1.4mg/ml TE组轻，以上结果均具有统计学意义。结论：1.证明了TE对HUVEC细胞有直接的毒性作用，一定浓度TE及预孵时间可导致HUVEC细胞坏死与凋亡，降低细胞存活率。2.TE作用HUVEC细胞，HUVEC细胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ含量可发生变化，HUVEC细胞通过对舒缩因子分泌量的调节，以此来拮抗TE引起的血管收缩反应。3. TE可降低动物平均动脉BP及造成严重心肾功能损害，环氧合酶抑制剂（吲哚美辛）、血管紧张素转换酶抑制剂可调节VECs分泌舒缩因子PGI2、TXA2、AngⅡ的含量而拮抗TE特异的缩血管反应及降BP效应，并且减轻了心肾功能损伤。(本文来源于《南昌大学》期刊2014-06-01）
常银龙[8]（2014）在《发形霞水母溶血活性蛋白和多肽生长因子的分离纯化及其活性研究》一文中研究指出水母（Jellyfish）属刺胞动物门（Cnidaria），是一类低等的无脊椎海洋浮游动物，种类繁多，数量极大，分布广泛，在海洋生态系统中占有重要地位。水母的触手和口腕上分布大量刺丝囊，其内含有的毒液成分复杂，除毒素外，还包括多种酶类、组胺、生物活性肽等附属成分，分离纯化和鉴定水母毒素中的生物活性物质是利用水母毒素的重要手段和先决条件。本论文以近年来在我国东南海域经常大规模出现的发形霞水母（Cyanea capillata）为研究对象，主要研究水母毒素的提取制备方法、分离纯化、鉴定及其生物活性等。方法第一章：发形霞水母毒素的溶血活性研究及其分离纯化第一节，以本实验室常规制备的水母粗毒样品触手提取物（tentacle extract，TE）为研究对象，跟踪测定样品的蛋白浓度、溶血活性，并结合SDS-PAGE分析，明确各种理化因素和处理方法对TE蛋白稳定性和溶血活性的影响；利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析两种纯化方法，对经过40℃水浴1h预处理的TE进行定向分离纯化溶血活性蛋白。第二节，采用剧烈机械振荡和离心相结合的方法快速制备水母粗毒样品口腕提取物（oral arms extract，OAE），显微观察制备过程中口腕上刺丝囊的发射情况；研究脱盐、冻干、超滤等处理方法对OAE溶血活性的影响，分别利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析两种纯化方法定向分离OAE中的溶血活性蛋白。第二章：发形霞水母多肽生长因子的分离纯化、鉴定及其活性研究首先，制备两种水母粗毒样品：快速制备的触手提取物（rapid preparation tentacleextract，rpTE）和粗刺丝囊毒素（crude nematocyst venom，cNV），测定两种样品的溶血活性等参数，在制备rpTE和cNV过程中显微观察刺丝囊的发射和破碎情况。其次，利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析，结合MALDI-TOF质谱分析，对rpTE和cNV分别进行分离纯化。再次，测定纯化出多肽的N端序列，利用还原衍生反应、酶解反应等生物化学实验方法，结合MALDI-TOF质谱分析，鉴定5782.9Da多肽的全长氨基酸序列，并作生物信息学分析。最后，采用滤纸片扩散法、分光光度法和CCK-8法分别研究多肽生长因子Cc-GRN-1（5782.9Da多肽）的抗菌活性、抗凝血酶活性和细胞增殖活性。结果第一章：发形霞水母毒素的溶血活性研究及其分离纯化第一节，TE溶血活性的剂量反应曲线呈“S”形，其半数溶血分数HU50=226μg/mL；40℃水浴1h能去除TE中大量杂蛋白，但TE仍保持显着溶血活性；TE在4℃条件下放置28d，其溶血活性保持稳定，25℃条件下3d内其溶血活性变化不明显；pH值对TE溶血活性的影响呈钟形曲线，在pH6-11之间活性相对稳定，pH=8时TE的溶血活性最强；TE被100kDa和10kDa超滤管分别浓缩了1.3倍和1.5倍；不同缓冲液对TE蛋白稳定性及其溶血活性的影响显着，饱和度大于26%的硫酸铵溶液透析TE产生的沉淀有溶血活性。阴离子交换层析后，检测到第一个洗脱峰组分有溶血活性，该组分利用凝胶过滤层析进一步分离纯化，得到两个洗脱峰，都没有溶血活性，SDS-PAGE分析显示在第二个洗脱峰组分的泳道上有四条蛋白条带，其中31kDa条带最明显，20kDa条带次之，36kDa条带和65kDa条带较弱。第二节，OAE的半数溶血分数HU50=95μg/mL，口腕上的刺丝囊主要有梭形、椭圆形和球形叁种类型，梭形刺丝囊最大，长径在26-30μm之间，椭圆形刺丝囊次之，长径为14μm左右，球形刺丝囊最小，直径约为4μm；在数量上，球形刺丝囊最多，椭圆形刺丝囊次之，梭形刺丝囊最少；直接冻干处理再复溶的OAE溶血活性保持不变，但OAE被脱盐后，冻干再复溶，其溶血活性消失；用100kDa超滤管浓缩OAE，浓缩液有溶血活性，浓缩后的滤液没有溶血活性；阴离子交换层析的穿透峰和洗脱峰组分都没有溶血活性，凝胶过滤层析前OAE用3kDa超滤管浓缩，超滤过程中析出的沉淀有溶血活性，层析后的5个洗脱峰组分都没有溶血活性。第二章：发形霞水母多肽生长因子的分离纯化、鉴定及其活性研究首先，触手上的刺丝囊主要有梭形、椭圆形和球形叁种类型，梭形刺丝囊最大，长径在26-30μm之间，椭圆形刺丝囊次之，长径为14μm左右，球形刺丝囊最小，直径约为4μm；在数量上，梭形刺丝囊最多，球形刺丝囊次之，椭圆形刺丝囊最少；rpTE溶血活性的剂量反应曲线呈“S”形，其半数溶血分数HU50=200μg/mL，cNV的半数溶血分数HU50=40μg/mL。其次，从rpTE中纯化出5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da和5747.4Da四个多肽，从cNV中纯化出5805.3Da、5782.9Da、5691.0Da、5861.3Da和5747.4Da五个多肽，其中5805.3Da、5782.9Da和5747.4Da叁个多肽从rpTE和cNV中都能纯化得到。再次，5782.9Da多肽的全长氨基酸序列为NVICPDGTSFCASGQTCCKLSSGSYGCCPLPNAVCCSDGVHCCPSGTTCDVSQGTCL(I)R，由58个氨基酸组成，其中含有12个半胱氨酸；5805.3Da多肽N端序列为NVICPDGTSYCATGQTCCKLSSGGYGCCPL，5747.4Da多肽N端序列为VICPDGTSYCATGQT，5668.3Da多肽N端序列为VICPDGTSFCASGQTCCVLSSGQY，四个多肽的氨基酸序列相似性很高；5782.9Da多肽序列注释显示，它属于生长因子中的颗粒体蛋白家族（命名为多肽生长因子Cc-GRN-1），理论等电点为5.29，分子内有6个二硫键，结构稳定、水溶性强，属于分泌型多肽，含有8个糖基化位点和5个磷酸化位点；多重序列比对提示多肽生长因子Cc-GRN-1有抗菌活性、抗凝血酶活性；功能注释和代谢通路分析显示，多肽生长因子Cc-GRN-1主要发挥蛋白结合和生长因子活性两种分子功能，参与应激反应、蛋白水解作用、信号转导、囊胚孵化、胚胎着床、上皮细胞增殖的正向调控、神经肽信号通路、对细菌的防御反应等多种生物学过程。最后，滴加100g/mL多肽生长因子Cc-GRN-1溶液的滤纸片周围没有出现抑菌圈；浓度为1g/mL、2g/mL、4g/mL、8g/mL、12g/mL、25g/mL、50g/mL和100g/mL的多肽生长因子Cc-GRN-1溶液对凝血酶的抑制率都接近于零；随着多肽生长因子Cc-GRN-1浓度的增加，A549细胞、HUVEC细胞、HaCaT细胞、A9细胞和L-929细胞的细胞增殖率逐渐增大，且与空白对照相比有显着性差异，但NRK-52E细胞的细胞增殖率没有明显的增大或减小。结论1.40℃水浴1h预处理显着减少TE中非活性蛋白组分，并降低样品黏性；4℃和pH8.0是TE保持蛋白稳定性和溶血活性的最适条件；饱和度大于26%的硫酸铵盐析作用可以富集TE中的溶血活性蛋白；冻干处理不影响OAE的溶血活性，盐溶液环境有利于OAE溶血活性的保持；发形霞水母毒素溶血活性蛋白的分子量大于100kDa，可能是多亚基组成的复杂蛋白，结构不稳定、溶解性弱，易受多种理化条件和处理方法的影响而聚集形成有溶血活性的沉淀，并且在纯化过程中溶血活性易于降低或丧失。2.四种水母粗毒样品溶血活性的强弱关系：cNV> OAE> rpTE> TE，制备OAE和rpTE方法中的剧烈机械振荡能有效刺激刺丝囊发射，并释放毒液，较好地减少了组织蛋白或非毒素蛋白的混入和干扰，先分离制备刺丝囊再破碎提取毒素的方法可以大大提高水母粗毒样品的纯度和质量，但制备粗毒样品的量较少。3.利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析，结合MALDI-TOF质谱分析，从rpTE和cNV中纯化出了5805.3Da、5782.9Da、5668.3Da、5747.4Da、5691.0Da和5861.3Da六个分子量相近的多肽，已鉴定的5782.9Da、5805.3Da、5747.4Da和5668.3Da四个多肽的氨基酸序列相似性很高，其中5782.9Da多肽（多肽生长因子Cc-GRN-1）为生长因子中的颗粒体蛋白，这提示我们从发形霞水母触手（特别是刺丝囊）中发现了一组分子量相近、同源性很高的多肽生长因子。4.多肽生长因子Cc-GRN-1没有抗菌活性、抗凝血酶活性，对A549细胞、HUVEC细胞、HaCaT细胞、A9细胞和L-929细胞有显着的促增殖作用，但对NRK-52E细胞没有明显的细胞增殖或毒性作用。(本文来源于《第二军医大学》期刊2014-05-01）
阮增良[9]（2014）在《发形霞水母抗氧化活性蛋白的分析筛选、克隆表达与活性研究》一文中研究指出水母是类生物总量非常庞大的海洋浮游动物。已有大量研究表明，水母体内富含多种生物活性物质，包括水母毒素蛋白和些活性强烈、具有良好开发前景的新功能蛋白。水母主要生存于4-6米深的海水表层环境，直接暴露于阳光紫外辐射之下。氧化损伤是紫外辐射造成机体损伤的重要机制之，已有研究表明，浮游生物为避免或减少紫外辐射造成的损害，经过长期适应性选择，在其机体内产生了种类繁多、结构特异、活性强烈的抗氧化活性物质。抗氧化物质可以清除自由基，具有明显的辐射防护作用。目前在国内外已经开展了不少针对水母抗氧化功能的研究，尽管如此，目前对水母体内抗氧化系统的组成、重要抗氧化酶类的序列信息、表达情况、抗氧化活性水平等情况尚未有系统的了解。研究目的：获得叁种发形霞水母重要抗氧化活性蛋白，并明确其活性水平，为了解水母抗氧化系统的物质基础、充分利用其抗氧化活性组分提供科学依据。研究方法：1、发形霞水母抗氧化活性蛋白序列的获取：构建发形霞水母触手组织cDNA文库，通过对该文库的克隆子进行序列测定和BLAST注释，从中获得个编码1型硫氧还蛋白、个编码4型过氧化物还原酶和个编码铜锌超氧化物歧化酶的全长核苷酸序列，分别命名为CcTrx1、CcPrx4与CcCuZnSOD。2、生物信息学分析：利用多种生物信息学软件及在线工具，确定叁序列的开放阅读框，开展其编码蛋白氨基酸组成、信号肽、结构域、理化性质，二级结构、亲疏水性等生物信息学分析，并进步进行多重序列比对、构建进化树、亚细胞定位及3D结构建模等分析。3、蛋白的重组表达及分离纯化：通过设计叁对带有特异性酶切位点的PCR引物，将编码上述叁个蛋白（不含信号肽区域）的核苷酸序列从cDNA文库克隆子中扩增出来，并利用选择的酶切位点将编码序列连接到pET-24a载体中构建重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta (DE3) pLysS中进行诱导表达。通过诱导条件的摸索后，使叁种重组蛋白最大限度地以可溶形式表达，再利用在重组蛋白N端加上的组氨酸标签，使用镍离子亲和层析柱进行分离纯化。4、重组蛋白的活性检测：对纯化获得的重组蛋白开展多种活性检测（：1）rCcTrx1蛋白的二硫键还原能力检测：1mL反应体系（pH7.0）包含100mM PBS缓冲液，1.25mg/mL牛胰岛素，2mM EDTA，8μg/mL纯化rCcTrx1蛋白，或热失活的纯化rCcTrx1蛋白作阴性对照。往上述体系中加入2μL1M DTT启动反应，持续监测反应液在650nm波长下的光吸收值。（2）rCcPrx4蛋白对过氧化氢的清除能力检测：1mL反应体系包括50mM Hepes（pH7.0），5mM DTT和浓度分别为0,25,50,75,100μg/mL的rCcPrx4蛋白，或热失活后的rCcPrx4蛋白作为阴性对照组。混匀后室温放置10分钟再加入3‰(w/v) H2O2至终浓度为100μM使反应开始。室温下分别反应0,2.5,5,7.5,10min后加入100%(w/v)的叁氯乙酸100μL并充分混匀以终止反应，立即加入200μL10mM Fe(NH4)2(SO4)2及100μL2.5M KSCN，混匀后测量OD475值，根据光吸收值随时间和重组蛋白浓度的变化，计算H2O2清除率并绘制反应曲线图。（3）rCcCuZnSOD蛋白对超氧阴离子自由基的抑制能力：使用Dojindo公司的超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（WST－1法）开展检测，实验流程按产品说明书步骤进行。（4）rCcTrx1与rCcPrx4蛋白对超螺旋构象DNA保护效果：50μL反应体系（pH7.0）中含有50mM的Hepes-HCl、10mM DTT、35μM FeCl3、1μg以超螺旋构象为主的pET-24a质粒DNA及不同浓度的纯化蛋白；另外设置不加入重组蛋白的质粒、质粒与FeCl3、质粒与DTT、质粒与FeCl3及DTT四组对照。反应液在37℃孵育2小时后各取10μL通过琼脂糖电泳观察反应效果。实验结果：经过菌液PCR、质粒酶切及测序验证，证实叁个发形霞水母抗氧化蛋白原核重组表达质粒正确构建。经过诱导条件的摸索后，均能以可溶形式表达。把离心收集的菌体重悬后进行超声裂解，取裂解液的离心上清通过镍离子亲和层析进行纯化，得到较为单的目的条带，分子量均与预测值致。活性检测结果：（1）纯化rCcTrx1蛋白具有较强的二硫键还原能力（。2）纯化rCcPrx4蛋白具有明显的H2O2清除能力，并且反应速度较快。（3）纯化rCcCuZnSOD蛋白对超氧阴离子自由基具有良好的抑制能力。（4）从加有纯化蛋白的各组可以观察到，随着纯化蛋白浓度的增加，质粒的超螺旋构象被保护得越来越好，直至与阴性对照组条带无明显差异。阴性对照组（质粒、质粒与FeCl3、质粒与DTT）以超螺旋构象存在为主；同时存在FeCl3及DTT的阳性对照组中质粒的超螺旋构象几乎被全部破坏，以线性构象为主。结论：通过对本课题组前期成功构建的发形霞水母触手组织cDNA文库进行分析筛选，我们获得个硫氧还蛋白、个过氧化物还原酶和个铜锌超氧化物歧化酶基因序列并进行了相应的生物信息学分析。根据生物信息学分析结果，经过重组克隆、诱导表达与蛋白分离纯化等步骤后，最终获得了叁个序列明确、活性显着的重要抗氧化蛋白。它们具有明显的二硫键还原能力、自由基清除能力、还原酶活性、保护DNA抵抗氧化损伤等作用。本研究为充分发掘利用具有抗氧化活性的新型海洋药物资源提供了实验依据和新的资源途径。(本文来源于《第二军医大学》期刊2014-05-01）
尹慢慢,徐凤,肖良,王倩倩,郑杰民[10]（2014）在《发形霞水母共附生微生物的分离鉴定及其发酵液的抑菌活性研究》一文中研究指出目的对发形霞水母(Cyanea capillata)共附生微生物进行分离鉴定并测定其抑菌活性,以期获得具有较高抑菌活性的菌株。方法利用4种分离培养基从C.capillata各部位分离共附生微生物,首先对挑选的单个菌落进行反复的划线分离,获得各菌株的纯培养;利用形态学观察、生理生化特征检测和16SrDNA序列测定和分析等手段对获得的菌株进行鉴定;以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为指示菌,利用滤纸片扩散法测定菌株发酵液的抑菌活性;通过正交试验方法进一步优化发酵条件,提高菌株发酵产生抑菌活性物质的能力。结果从C.capillata触手、胃囊、伞部、肌肉4个部位共分离出83株菌株,其中放线菌11株,细菌31株,真菌41株;其中菌株cmf-2经鉴定属于假单胞菌属。抑菌活性检测发现,在31株细菌中有14株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抑菌活性,占分离菌株的45.2%;正交试验结果显示,菌株cmf-2发酵液的最优条件为:培养温度35℃,pH 7.3,培养时间7d,蔗糖50g/L,蛋白胨10g/L。结论分离到的发形霞水母共附生微生物中含有较高比例的能产生抑制细菌生长的活性物质的细菌菌株,这些菌株具有较强的研究和开发价值。(本文来源于《中国海洋药物》期刊2014年01期）
发形霞水母论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本课题组致力于发形霞水母(Cyanea capillata,C.capillata)来源的活性物质及相关机理研究多年。以往研究中,我们发现水母触手表现出超强创伤修复能力,且触手中刺细胞具有快速增殖的特点,提示水母触手中可能存在高活性促生长因子。在分析C.capillata触手提取物(tentacle extract,TE)的细胞活性时也观察到一个有趣现象,即低浓度的T E可以诱发细胞增殖。结合相关文献报道,我们推测TE中含有类似促增殖活性物质。本课题组前期建立了C.capillata触手组织c DNA文库,分析发现其中有四条血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)类似序列,为我们从TE中提取促生长活性物质提供了重要理论依据。组合应用多种分离技术,我们成功从TE中分离得到具有促生长活性的一个颗粒蛋白样多肽生长因子并命名为Cc GRN-1(Cyanea capillata granulin-1,Cc GRN-1)。因此,本课题将重点研究TE和Cc GRN-1的促生长活性及其作用机制。通过本课题的研究,我们希望可以为将来某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况提供新的治疗思路。方法第一部分:TE的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测TE对HUVECs细胞活力的影响。然后,通过流式细胞术检测TE对HUVECs细胞周期进程的影响;并检测其对细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1表达的影响。随后,采用Western Blotting检测TE对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK,p38 MAPK和NF-κB通路以及下游caspase-3,8,9和Cyto C蛋白的表达水平;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况进一步验证。随后,选择TE激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测TE对细胞迁移能力的影响。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测Cc GRN-1对HUVECs的细胞活力的影响。其次,通过流式细胞术检测Cc GRN-1对HUVECs细胞周期进程的影响,并检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表达变化情况。然后,采用Western Blotting检测Cc GRN-1对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,主要包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK和NF-κB通路;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况做进一步的验证。随后,选择Cc GRN-1激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测Cc GRN-1的促细胞迁移能力。同时,选取商品化血管内皮生长因子VEGF作为对照,并行分析其与Cc GRN-1的生物学活性及作用机制。结果第一部分:TE的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,高剂量TE抑制细胞生长,使HUVECs细胞活力呈剂量依赖性降低;而低剂量TE可以促进细胞活力明显升高。此外,流式细胞术结果显示,TE可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;TE还可以促进细胞周期蛋白的表达明显增加。在信号通路方面,TE可以激活HUVECs中PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路,而对p38 MAPK和NF-κB通路以及下游信号通路中包括caspase-3,8,9以及Cyto C蛋白表达没有影响;免疫荧光检测结果证实TE确实可以激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002和SP600125对其没有影响,说明TE主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,TE可以诱导HUVECs发生细胞迁移。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,Cc GRN-1和VEGF均对HUVECs活力具有时间和剂量依赖性促进作用。流式细胞术结果显示,两者均可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;此外,两者还可以促进细胞周期蛋白表达增加。在信号通路激活方面,Western Blotting结果显示Cc GRN-1和VEGF均可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而对JNK MAPK和NF-κB通路没有影响;免疫荧光检测结果证实了Cc GRN-1和VEGF确实可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002没有影响,说明Cc GRN-1主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,Cc GRN-1和VEGF均可以诱导HUVECs发生细胞迁移。结论低浓度TE可以提高细胞活力,加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,提示TE具有促细胞增殖效应;在作用机制方面,TE可以磷酸化激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK和JNK MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关,提示其可能与促细胞增殖有关;最后,细胞划痕修复实验表明TE可以诱导细胞迁移。另一方面,Cc GRN-1具有与VEGF类似的细胞活力效应,可以加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,表明Cc GRN-1具有与VEGF类似的促细胞增殖效应;在作用机制方面,Cc GRN-1也与VEGF类似,主要激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关;最后,通过细胞划痕修复实验表明Cc GRN-1与VEGF均可以诱导细胞迁移。基于Cc GRN-1和VEGF在促进细胞增殖方面具有很大的共性,我们认为Cc GRN-1作为一种海洋生物来源的多肽,对某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况可能具有良好的应用前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
发形霞水母论文参考文献
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标签：水母; 抗菌蛋白; Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂; 杀菌; 通透性增加蛋白;