敬静
(新疆参茸中药饮片有限公司新疆乌鲁木齐830026）
【摘要】目的：研究地锦草的醇提工艺。方法：采用正交试验法，以提取时间、提取次数、溶剂浓度及倍数为研究考察的主要影响因素，每个因素选取三个水平进行实验设计，以没食子酸的含量、槲皮素的含量和出膏率为指标综合进行评分，确定地锦草最佳醇提工艺条件。结果：地锦草最佳醇提工艺为加10倍的60%乙醇溶剂浸泡24小时，回流提取三次，前两次回流提取每次2小时，后一次回流提取1小时。
【关键词】正交试验法地锦草槲皮素没食子酸
【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）34-0340-02
地锦草为大戟科双子叶一年生草本植物，全草入药，具有凉血止血、清热止痢、通乳汁、清热解毒、利湿退黄、凉血止血等功效，用于治疗痢疾、外伤出血、乳汁不足、肠炎、咳血、便血、崩漏等症[1]。地锦草中主要含有槲皮素、没食子酸、没食子酸甲酯及肌醇[2]，药理研究证实槲皮素、等黄酮类化合物是地锦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分[3]，地锦草水提物没食子酸具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等生物活性[4]。已有研究表明，乙醇有利于地锦草中槲皮素的提取，而水则利于没食子酸的提取[5-6]。根据地锦草的性质，结合生产实际，采用回流法进行提取。拟采用正交实验方法，以槲皮素含量、没食子酸含量和浸膏收率为评价指标进行综合评分，优选地锦草的最佳醇提取工艺。现将研究结果报告如下：
1.实验仪器与材料
1.1仪器
日本岛津LC-10ATVP型高效液相色谱仪，梅特勒-托利多AL104型电子天平，上海菁海YP3002N型电子天平。
1.2试剂与药品
地锦草药材为新疆银朵兰维药股份有限公司采购部提供，均符合国家标准。没食子酸(批号110831—200302，供含量测定)，槲皮素（批号：100081-200406，供含量测定），中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2.实验方法
2.1正交试验设计
试验选择乙醇进行回流提取，并对提取的乙醇浓度（A）、时间(B)、溶剂用量(C)、次数(D)等因素进行考察，每个因素选择3个水平，用(L9(34))正交表安排实验。由于地锦草中槲皮素和没食子酸是其中的主要有效成分，因此选择槲皮素和没食子酸为主要评价指标，出膏率作为辅助评价指标，采用综合评分方法对提取条件进行评价。
2.2正交试验方法
称取药材9份，按正交设计方案，进行提取，浓缩至一定体积称重，备用。
2.3含量测定方法
2.3.1槲皮素含量测定[7]
2.3.1.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4%磷酸（50:50）为流动相，检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
2.3.1.2对照品的制备取槲皮素对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1ml含20ug的溶液，即得。
2.3.1.3供试品的制备取提取液约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，精密加入25%盐酸溶液7ml，置85℃水浴水解30min，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.1.4测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3.2没食子酸含量测定[8]
2.3.2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸（7:93）为流动相，检测波长为270nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。
2.3.1.2对照品的制备精密称取没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含5ug的溶液，即得。
2.3.2.3供试品的制备取提取液约0.2g，精密称定，至50ml量瓶中，加甲醇超声处理15min，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取上清液，即得。
2.3.2.4测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4浸膏收率的测定分别精密称取提取液100g于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴浓缩至干，置烘箱中105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，精密称重，计算浸膏收率。
3.实验结果与分析
实验结果与数据分析（见表）。根据试验结果可知：对于槲皮素的含量指标的显著影响因素是提取时间（B），次之的是提取次数（D），而乙醇浓度（A）和加乙醇溶剂的倍数（C）是次要影响因素，但乙醇浓度60%和70%的数据值几乎相同，所以最佳组合是加10倍量的60%或70%的乙醇提取两次，每次2小时。对于没食子酸含量指标的显著影响因素是提取次数（D），次之的是提取时间（B），而乙醇浓度（A）和加乙醇溶剂的倍数（C）是次要影响因素，所以是最佳组合是加10倍量的60%的乙醇提取三次，每次2小时。对于出膏率显著影响的因素是乙醇浓度（A），次之的是加乙醇溶剂的倍数（C），而提取时间（B）和提取次数（D）是次要的影响因素，最佳组合是加12倍量的70%的乙醇提取三次，每次2小时。
综上所述，考虑到没食子酸、槲皮素均为地锦草的有效成分，结合实际生产情况，为了实际操作的方便快捷、成本时间的节约，最终确定为先加10倍的60%乙醇溶剂浸泡24小时，回流提取3次，前两次回流提取每次2小时，后一次回流提取1小时。
4.优化工艺验证
按照优化条件进行三次试验，即加10倍的60%乙醇溶剂浸泡24小时，前两次回流提取每次2小时，后一次回流提取1小时。每次的煎煮液过滤，收集滤液，合并滤液，浓缩至一定体积。精密称定提取液适量，依法测定样品中没食子酸、槲皮素的含量及出膏率。结果平均含量分别为596.21mg、165.43mg，出膏率为28.04%，高于正交试验安排中任意一组的结果，证明优化条件可行。
5.讨论
采用多指标综合评分方法，确定地锦草的醇提取工艺：加10倍的60%乙醇溶剂浸泡24小时，回流提取三次，前两次提取每次2小时，后一次提取1小时。提取工艺科学、稳定、可行，具有生产可行性，为大生产浸膏的均一稳定奠定了基础。
【参考文献】
[1]朱英．地锦草的研究进展[J]．现代中药研究与实践，2003，17(5):62
[2]吴雪钗,于波涛,等．没食子酸稳定性研究[J]．西南国防医药，2006.16(5):484
[3]褚小兰,廖万玉,楼兰英,等．地锦类中草药的药理作用研究[J]．时珍国医国药.2001.12(3):193