CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图像

一、CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象（论文文献综述）

张潇^[1]（2015）在《抗EV71病毒单克隆抗体及柯萨奇病毒病毒样颗粒的制备研究》文中研究表明手足口病（Hand foot and mouth disease,HFMD）是一种多见于婴幼儿的病毒流行性传染疾病,其流行疫情主要集中于亚太地区,2008年被纳入我国丙类传染病。手足口病流行范围广,是一种自愈性疾病,然而少数患儿伴有急性弛缓麻痹、脑干脑炎和脑膜脑炎等神经系统疾病,重症死亡率高,并呈逐年增长趋势,作为新发传染病,手足口病严重影响着我国婴幼儿的生命健康。手足口病的主要致病病原体包括肠道病毒71型（Enterovirus 71）与柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16,CVA16）,其中EV71病毒是造成的HFMD重症及死亡的主要病原体。目前,手足口病还没有有效的治疗方法。为了开发具有临床应用潜能的手足口病重症治疗药物,本课题展开了相关的研究工作,包括以下两个部分。第一,利用噬菌体展示技术分离制备可识别EV71病毒衣壳蛋白VP4高度保守多肽（VP4N20）的人鼠嵌合单克隆抗体。免疫学实验结果显示其中一株抗体A-M001在体外既可以中和EV71病毒亦可以中和CVA16病毒,具有广谱中和病毒活性。第二,本研究利用单细胞基因扩增技术尝试从感染EV71病毒患儿体内分离具有中和EV71病毒活性的全人源单克隆抗体。共分离得到137株单克隆抗体,有4株抗体在体外表现出不同程度的中和EV71病毒活性。其中,单克隆抗体hm Ab136在体外表现出最强的中和EV71病毒活性。该抗体在体外既可以中和EV71-A亚型病毒亦可以中和EV71-C4亚型病毒。针对EV71-A和EV71-C4亚型病毒的体外半数抑制浓度分别是:IC50=0.071μg/m L和IC50=0.040μg/m L。体内中和实验显示单克隆抗体hm Ab136在300 ng/g剂量条件下可以完全保护小鼠抵抗致死剂量EV71病毒攻击,其IC50=0.053μg/m L。实验结果显示该抗体在体内外均具有理想的中和EV71病毒活性,但该抗体不具有中和CVA16病毒的能力。我们还利用Western-blot初步鉴定了该抗体的潜在识别表位,结果显示抗体无法识别EV71病毒的线性表位,提示该抗体是通过识别EV71病毒的空间表位来中和EV71病毒的。相关研究国际上尚无类似报道。柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus B3,CVB3）属于肠道病毒属,能引起手足口病重症并发症类似病理症状,导致中枢神经系统感染,诱发无菌性脑膜炎、脑炎,另外还能引起病毒性心肌炎及由病毒性胰腺炎引起的I型糖尿病等多种疾病,CVB3病毒持续感染能够诱发扩张性心肌病,具有较高的致死率,因此倍受关注,目前还没有开发出有效的抗病毒疫苗。为此,本课题展开了第三部分研究内容,研制抗CVB3病毒新型疫苗。第三,利用酵母系统制备CVB3病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）新型疫苗。研究结果显示在酵母细胞中共表达CVB3P1蛋白和3CD蛋白或共表达CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4蛋白可有效制备CVB3 VLPs。VLP是具有完整的病毒衣壳蛋白,无病毒核酸的病毒空颗粒,兼具免疫原性与安全性,已成为抗病毒疫苗研究热点。采用酿酒酵母表达系统,通过两种不同的技术路线分别成功制备了CVB3病毒VLP。为研制CVB3预防性疫苗探索了新的技术策略。

杜恩岐^[2]（2006）在《Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究》文中认为p13基因由我们实验室于1995年首次报道。随着大规模基因组测序的发展,越来越多的杆状病毒全基因组被测定,目前已报道的杆状病毒p13基因多达二十多个。奇怪地是这些p13基因均特异地存在于II型核型多角体病毒和部分颗粒体病毒的基因组中。而I型核型多角体病毒基因组中则不存在。对于p13基因的启动子和编码区的结构功能目前已有预测,但尚无相关研究工作报道。本研究对p13基因的启动子活性、p13基因的进化、在天然系统及异源系统中的功能及其潜在的杀虫活性进行了研究,为p13基因进一步深入研究和杀虫潜力应用的开创之举。目前已有14类不同杆状病毒的22个p13基因序列报道,我们经DNASTAR软件对已报道的14类杆状病毒（每类各选一个序列）P13氨基酸同源性比较发现,不同杆状病毒P13之间的同源性在42.1%-74.7%,其中Ls-P13与HaNPV P13同源性最高（58.7%）与PoGV P13最低（44%）。对P13的氨基酸同源性比较和进化树分析表明P13可被分为两个群,I群为GV的P13,它们之间有高度同源性。II群为II型NPV的P13,它们之间同源性差异较大。其中II群根据同源性又可分为两个亚群:I亚群为LsNPV,HaNPV和SlNPV三种,其他II型NPVs的P13为第II亚群。p13基因5’UTR普遍存在早期启动子核心序列GTGTTATA及CAT/AT盒和晚期启动子核心序列TTAAG盒。在早晚期启动子之间有一3-30aa组成的小ORF,推测这一小顺反子可能具有重要的调控功能。在p13基因5’UTR的上游,有一个杆状病毒普遍存在的同源重复序列（Homologue repeat,简称hr）,一般hr有多个,而p13基因的hr的数目因病毒种类的不同而不同。已经证明,杆状病毒的hr是DNA复制的ori和转录激活的增强子,对早期基因的表达有增强作用。因此由p13基因的5’UTR结构,我们推测p13基因为一早晚期基因,并主要在早期发挥作用。以Ha-p13为例,我们证明p13基因启动子从2h.p.i到90h.p.i均有活性。不管在天然Hz-AM1细胞还是在异源Sf9细胞中,Ha-p13基因启动子本身并不是一个强启动子,但在hr4存在时,Ha-p13基因启动子活性在Hz-AM1细胞中提高了20倍,在Sf9细胞中则提高了2000倍。携带hr4增强子的Ha-p13基因启动子活性在天然细胞和异源细胞中存在的巨大差异可能受细胞的某些因子调控。为研究P13蛋白功能,我们以Ha-P13和Ls-P13为例,分别对P13蛋白在天然和非天然宿主昆虫细胞和幼虫中的作用进行了研究。由于携带eGFP的棉铃虫杆状病毒HaSNPV-G本身带有Ha-p13基因,因此我们通过dsRNA-Hap13来沉默Ha-P13的表达。流式细胞仪检测结果发现5μg dsRNA-Hap13可以有效地抑制Ha-P13在Sf9和Hz-AM1细胞中的表达。HaSNPV-G与5μg dsRNA-Hap13共感染发现棉铃虫的死亡率明显下降,而且与dsRNA-Hap13的使用剂量成正相关性。这表明p13在天然系统中是一个杀虫相关基因。另一方面,由于I型核型多角体病毒如AcMNPV中缺少p13基因,因此我们将Ls-p13基因插入AcMNPV基因组构建重组病毒rAc-hr5/IE1-Lsp13-G来检验异源系统中P13的杀虫活性。生物测定实验进一步证明,Ls-P13能够明显提早AcMNPV的杀虫时间。通过杆状病毒Ls-P13或Ha-P13与不携带Ls-p13的AcMNPV共同注射感染幼虫发现,一旦Ls-P13的亮氨酸拉链结构发生突变,Ls-P13的杀虫活性也会随之失去,尽管我们对这种确切机理还没有完全解释清楚,但是P13提早杀虫时间的特性很可能使其成为未来新型生物杀虫剂的侯选基因。为进一步研究P13在异源系统中提早杀虫的机理,我们构建了一系列重组病毒来研究P13对病毒在细胞中增殖的影响。我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显抑制多角体的产生,其抑制效率随P13表达时相的提前而加强,即P13的早期表达有更强的抑制作用。当P13的亮氨酸拉链发生突变时,P13对多角体的抑制效率随之丧失。而P13的跨膜区发生缺失时,对多角体的效应与Leu Zipper相反,即抑制效果明显提高。另一方面,P13对出芽病毒（BV）的效应与对多角体的效应不同,我们发现,P13在Sf9细胞中的表达可以明显增加出芽病毒（BV）的产生,当亮氨酸拉链突变时,P13对BV的增殖效率随之丧失;当P13的跨膜区发生缺失时,P13对BV的增殖略有下降。以上结果充分证明P13提前杀虫效果的机制是由于P13改变了BV和多角体之间的动态平衡,主要是由于P13的LZLD（Leucine zipper like domain）减少了多角体产量,增加了BV产量。跨膜区使P13晚期定位在质膜上,与LZLD效果相反的是,当TM缺失后P13的定位向核中转移,对多角体的抑制进一步加强,而对BV增加略有下降。BV的参加则加速了AcMNPV从细胞到细胞的次级感染,所以使注射感染时间大大提早。此外,我们对Ha-P13在天然Hz-AM1细胞和Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位进行了研究。得出了一致的结果,我们发现P13不管在天然细胞还是异源细胞中,转染48h后主要定位在细胞质膜上。Ls-P13在异源Sf9细胞中的定位为一动态过程,即早期（12h）定位于细胞核中,随后（24h）从细胞核向细胞质膜移动,最后定位于细胞质膜上。当Ls-P13的I、II跨膜区依次缺失时,Ls-P13的晚期定位逐渐从细胞质膜向细胞核移动。尤其在跨膜区II发生缺失时,绝大部分P13蛋白已脱离了细胞质膜而进入核中。由于多角体在核中装配而BV主要在细胞质膜上装配,而且Ls-P13具有抑制多角体产生和促进BV生成的作用。因此当跨膜区缺失时,Ls-P13的定位从细胞质膜而向核移动,核中的Ls-P13的增加和细胞质膜上Ls-P13的降低很好地解释了为什么在跨膜区缺失后L s-P13对多角体的产生的抑制效果进一步加强而对BV的增强效果稍有下降。另一方面,由于L s-P13早期主要在核中表达,随后从核中向细胞质膜上移动,这也很好地解释了为什么L s-P13对多角体的抑制效果随表达时相的推迟而减弱。

赵铁强,唐伟,鲍英华,国立秋,赵清亮,张飞虎,董申^[3]（2003）在《CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象》文中指出 原子力显微镜（AFM）是一种具有原子级分辨率的超微结构研究工具。与传统的X射线衍射、电镜等方法相比,它具有分辨率高、制样简单、可在接近生理条件下成像等优点。本研究拟用AFM观察柯萨奇B3病毒（CVB3）VP1基因及其真核表达质粒,探讨AFM在观察线性和质粒DNA中的应用。

金玉怀^[4]（2003）在《CCK-8对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞增殖及MMPs产生的影响及其可能作用机制的研究》文中进行了进一步梳理类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性、炎症性自身免疫病。以持续性滑膜炎症，滑膜组织增生、新生血管形成和进行性滑与软骨组织结构破坏为病理特征。病变常经久不愈，最终可导致患者的残障和生存期缩短。RA的病因至今未明，但多数研究认为，免疫平衡失调，尤其是Th1/Th2型免疫应答失衡和促炎性细胞因子（如TNFα、IL-β、IL-12、IL-15、IL-18、IL-6等）的产生过多，在RA的发病中可能具有重要作用。近年的研究则表明，除上述因素外，RA患者的成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS），在RA的发病、慢性炎症的维持和骨与软骨的结构破坏方面可能具有重要的作用。滑膜炎症，滑膜组织增生和血管翳形成，关节软骨和骨组织结构的破坏，是RA的主要病理组织学改变。活化的滑膜组织可以表达和分泌多种粘附分子，细胞趋化因子、促炎性细胞因子和生长因子，如血管细胞间粘附分子-1（vascular cell adhesion molacular-1 ,VCAM-1）、细胞间粘附分子-1（intracellular adhesion molecule-1 , ICAM-1）、巨噬细胞趋化蛋白（macrophage chemotactic pntein-1, MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein, MIP）、IL-1、IL-6、IL-8、粒细胞和巨噬细胞克隆剌激因子（granulocyte-macrophage clony stimulating factor, GM-CSF） 等。它们可募集巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞到病变关节部位，并使之活化、增生和分化，促进炎症反应的发生；它们产生的血管内皮生长因子（vescular endothelial growth factor ,VEGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、血小板衍生的生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）等能够促进新生血管及血管翳的形成；它们所产生的细胞外基质降解酶，包括多种金属蛋白酶<WP=5>（metalloproteinases , MMPs）和组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶K和蛋白聚糖酶（agreencanase），则可以降解关节的细胞外基质成分和软骨内的聚糖成分（agreencan），是引起关节结构破坏的主要原因。而滑膜组织的活化增生，是所有这些病变的基础。关于滑膜组织增生的原理，仍存在有较多争议。一般认为，成纤维细胞样滑膜细胞生长特性的改变及凋亡缺陷是滑膜组织增生的一个主要原因。Muller-ladner和Fassbender 等的研究发现RA FLS具有转化细胞的表型特征和生长特性，如细胞呈多形性，胞浆丰富，核仁显着，锚定非依赖性生长的和接触抑制的丧失等；Imamura等则发现RA FLS有单克隆或寡克隆细胞扩张的存在；端粒酶的活化在细胞增殖和永生化方面具有重要作用，RA FLS中也有端粒酶活性检出。这些结果都提示在滑膜组织增生中，RA FLS的主动增殖起着主导作用。鉴于RA FLS细胞在脱离炎症微环境后依然能保持此生长特性，这种改变有可能是永久性的基因型改变。这种改变的发生机制，则可能与p53抑癌基因的体细胞突变和原癌基因c-myc、 c-jun、c-fos等的活化有关。RA FLS具有p53抑癌基因的负显性突变，这种突变可导致p21的合成减少和周期素-1的合成增加使细胞进入增殖周期，从而引起滑膜增生。在另一方面，炎症关节局部促炎性细胞因子的存在，从而剌激细胞活化和增殖是滑膜增生的另一个重要原因。其中TNFα是滑膜细胞增生和活化的有效剌激剂，可显着剌激RA患者滑漠细胞的增生，细胞因子的分泌和细胞外基质降解酶的产生。TNFα通过与其受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）结合而发挥生物学作用。有研究表明，RA患者滑膜成纤维细胞上有TNFRs的表达，TNFα可以通过下调TNFR1的和上调TNFR2表达促进RA患者滑膜细胞的增生。而由于促炎性细胞因子的剌激、癌基因的活化及信号传导系统的改变，则又可以引起RA-FLS的凋亡缺陷，使之不能发生或不能完成凋亡过程。延长了RA FLS的生存期，则可从另一方面导致滑膜组织增生的发生。CCK-8属于脑肠肽，具有明显的抗炎作用。在动物实验中，它表现有明显的抗内毒素休克作用，可显着抑制内毒素休克大鼠血浆、肺脏和脾脏的TNFα 、IL-1β和IL-6的产生。在离体实验中，CCK-8可明显抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞（pulmonary intenstitial<WP=6>macrophages, PIM）TNFα的产生和核转录因子NF-κB的活化。近年来通过对的血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）和垂体腺苷酸环化酶激活多肽（petuitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP）的研究发现，VIP/PACAP具有与CCK-8类似的免疫凋节和抗炎作用。动物实验研究发现VIP和PACAP都能显着降低小鼠胶原性关节炎的发病率,完全消除了关节肿胀和骨与软骨的结构破坏，并发现这种治疗作用是与疾病的炎性和自身免疫成分的下调是相关的 。离体实验研究也发现VIP对于RA患者的FLS增生具有明显抑制作用。认为VIP和PACAP可能具有用于RA治疗的潜在价值。Manni等的研究发现CCK-8的拮抗剂丙谷胺，具有加重关节炎症的作用。但CCK-8对于RA患者FLS的活化和增生是否也有相似的作用尚未见报道，据此我们观察了CCK-8对于大鼠滑膜传代细胞株RSC-364和CIA大鼠FLS增殖、凋亡及基质金属蛋白酶2、9

二、CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象（论文提纲范文）

（1）抗EV71病毒单克隆抗体及柯萨奇病毒病毒样颗粒的制备研究（论文提纲范文）

（2）Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究（论文提纲范文）

（4）CCK-8对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞增殖及MMPs产生的影响及其可能作用机制的研究（论文提纲范文）

四、CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象（论文参考文献）

• [1]抗EV71病毒单克隆抗体及柯萨奇病毒病毒样颗粒的制备研究[D]. 张潇. 北京工业大学, 2015(03)
• [2]Ⅱ型核型多角体病毒新型P13蛋白的结构、功能及杀虫潜力研究[D]. 杜恩岐. 武汉大学, 2006(01)
• [3]CVB3病毒VP1基因及其真核表达质粒的原子力显微镜图象[J]. 赵铁强,唐伟,鲍英华,国立秋,赵清亮,张飞虎,董申. 中华实验和临床病毒学杂志, 2003(04)
• [4]CCK-8对大鼠成纤维细胞样滑膜细胞增殖及MMPs产生的影响及其可能作用机制的研究[D]. 金玉怀. 河北医科大学, 2003(01)

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