导读:本文包含了异源生物合成论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:海洋曲霉属真菌,肠道内生真菌,次级代谢产物,OSMAC策略
异源生物合成论文文献综述
李昕阳[1]（2019）在《海洋曲霉属真菌次级代谢产物及其生物合成基因簇异源表达研究》一文中研究指出海洋微生物物种丰富,生态功能多样,其代谢产物往往具有新颖的结构及显着的生物活性,是先导化合物及新药的重要来源。作为海洋微生物的重要组成部分,曲霉属真菌(Aspergillus sp.)能够产生多种结构类型和生物活性的次级代谢产物,作为活性天然产物的重要来源之一引起了人们极大的关注。生物信息学分析表明真菌中存在大量次级代谢产物生物合成基因簇(Biosynthetic Gene Clusters,BGCs),仅曲霉属和青霉属真菌所含BGCs至少为25000个,具有丰富的次级代谢产物合成潜力。如何运用传统分离方法挖掘更多活性代谢产物,以及在基因组信息指导下运用生物学手段激活这些生物合成基因簇具有很大的研究价值和研究意义。本文从海蟑螂肠道内分离得到叁株曲霉属(Aspergillus sp.)真菌Z3、Z4和Z5,对这叁株真菌进行了系统的次级代谢产物研究,运用OSMAC(One Strain Many Compounds)策略从其发酵物中分离了 34个化合物,包括9个新化合物,以及1个首次从真菌代谢产物中发现的化合物。对分离得到的细胞松弛素类衍生物和吲哚二酮哌嗪二聚体类衍生物进行了初步的抗肿瘤活性、抑菌活性以及神经保护活性测试。从真菌Z5中分离得到的次级代谢产物类型较单一,远低于前期该菌株的生物合成基因簇预测结果,本文选择Z5基因组中一个NRPS-like类型的基因簇作为研究对象,尝试以构巢曲霉Aspergillus nidulans为宿主,对该基因簇进行异源表达,丰富菌株Z5的次级代谢产物类型,探索真菌Z5更多的应用价值。采用OSMAC策略丰富曲霉属真菌Z4的次级代谢产物,从其2216E液体培养基和大米培养基中分离了 17个化合物,包括13个细胞松弛素类衍生物(1～13)及4个二酮哌嗪类化合物(14～17),其中化合物1～5为新化合物,化合物1和2为新骨架化合物。化合物12对人前列腺癌细胞PC3具有显着的细胞毒活性,IC50为11.14μM,化合物9对PC3细胞生长具有中等抑制作用,IC50为31.72 μM。从曲霉属真菌Z3中分离鉴定了 8个化合物,包括一个茚酮类化合物(18),四个吲哚二酮哌嗪二聚体类衍生物(19～22),一个麦角甾醇类化合物(23),一个间苯二酚(24),一个二肽类化合物(25)。其中化合物18为新化合物,化合物20～22为化合物19的立体异构体,也是新化合物。运用比较ECD和计算ECD法、NOESY谱、X-ray单晶衍射、Marfey法等多种方法,确定了化合物18及化合物20～22的绝对构型。在基因组信息指导下,选择真菌Z5基因组中一个NRPS-like类型的基因簇(cluster 24)为研究对象,以构巢曲霉A.nidulans为宿主对其进行异源表达,并将骨架基因g8094的启动子替换为强启动子gpdAp;同时,对Z5野生株进行改造,将诱导型强启动子alcAp插入g8094之前,成功构建Z5突变株。RT-PCR及相对定量q-PCR结果显示更换强启动子之后骨架基因g8094表达量虽有提高,但整体表达量依然较低,修饰基因表达量较低或没有表达,尚未挖掘出该基因簇编码的代谢产物。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-06-06）
张焕云[2]（2019）在《抗感染抗生素teixobactin的生物合成途径的重构和异源表达》一文中研究指出近些年,随着抗生素的广泛使用甚至滥用,细菌耐药性逐渐增加。耐药性致病菌的传播和感染严重危害人类健康,已经成为世界范围内的棘手问题。来源于不可培养土壤微生物Eleftheria terra的缩肽类抗生素teixobactin具有独特新颖的双重靶标作用机制,即通过同时与细菌细胞壁上肽聚糖前体脂质Ⅱ及壁磷壁酸前体脂质Ⅲ的保守序列相结合来阻断细菌细胞壁的合成,对多种耐药性致病菌具有显着强效的抑制活性,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等。这种特殊的作用方式使病原体对其很难产生耐药性。因而,teixobactin作为一种对抗耐药性致病菌的先导化合物在抗感染药物研发方面显示出巨大的潜力。Teixobactin结构中的十叁元环及稀有的非天然氨基酸L-allo-enduracididine(L-allo-End)的化学合成难度大,产量难以提升;其生物合成基因簇大(约52 kb),其产生菌Eleftheria terrae不可培养。所以,本研究拟通过teixobactin生物合成基因簇全合成和生物合成途径的重构,在可培养微生物中实现teixobactin的生物合成,克服化学合成方面的局限。结果如下:1.Teixobactin人工生物合成基因簇的合成、组装和异源表达基于NCBI数据库中公布的teixobactin生物合成基因簇序列信息,首先进行基因簇的分段化学合成,获得11个片段;利用Red/ET同源重组工程和ExoCET重组技术对1 1个DNA片段进行多片段组装等,得到了teixobactin人工生物合成基因簇,并构建不同的表达质粒。选择合适的底盘细胞,使teixobactin的人工生物合成基因簇得以高效的表达,检测到一系列化合物积累;抑菌活性实验表明,发酵粗提物对于枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性。将这一系列化合物进行分离纯化,并进行了高分辨质谱-超高压液相色谱联用仪(HPLC-HR-ESIMS)和核磁共振技术(NMR,nuclear magnetic resonance)分析(正在鉴定结构),为基因簇的理性设计提供理论依据。Teixobactin生物合成基因簇序列中以及异源宿主基因组上均不包含其非天然氨基酸前体物L-allo-End的生物合成相关基因,异源表达表明宿主细胞不能提供该氨基酸前体。利用6M盐酸过夜进行Marfey水解反应,水解含L-End和D-allo-End的恩拉霉素,并添加酸水解物到以上异源表达发酵体系中进行喂养实验,但是未检测到含该非天然氨基酸家族的teixobactin及相关衍生物的积累。2.Teixobactin前体物-End家族非天然氨基酸的生物合成基因簇重构推测L-allo-End在teixobactin中的生物合成很有可能也遵循与其他该家族氨基酸类似的途径,所以搜索NCBI数据库获得两种放线菌来源的End家族非天然氨基酸的生物合成基因簇序列(编码叁个酶,即MppP/MppQ/MppR和EndP/EndQ/EndR);通过化学合成、组装及修饰,重构已知的该家族非天然氨基酸的生物合成基因簇;异源表达检测到两个相关化合物积累(结构待鉴定)。3.Teixobactin-End人工生物合成基因簇构建和异源表达将teixobactin人工生物合成基因簇和End人工生物合成基因簇进行组装缝合,构建teixobactin-End人工生物合成基因簇。导入异源宿主细胞中,进行液体发酵。发酵液HPLC-MS分析表明:新积累的化合物分子量明显大于上面得到的teixobactin衍生物,推测可能是End前体结合产物(需通过提高产量来进行结构解析)。4.总结:基于基因化学合成、同源重组、多片段组装、DNA无缝定点改造等技术,本研究首次实现了不可培养细菌来源的teixobactin生物合成基因簇(约52kb)的人工合成和组装、组合生物合成和异源表达,获得了一系列具有生物学活性的化合物,并重构了其重要前体物End家族非天然氨基酸的生物合成途径。本研究将会推进多肽类抗感染药物的新药研发,有助于对抗耐药性的新一代抗生素的创新研制。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-21）
刘晓彤[3]（2019）在《蛋白酶体抑制剂syrbactins的组合生物合成和prenylisatin的异源表达》一文中研究指出微生物是重要药用化合物的主要来源。为挖掘更多抗肿瘤和抗细菌感染的天然活性药物,本文从组合生物合成和基因组挖掘两个角度来对两类化合物开展研究。1蛋白酶体抑制剂类化合物syrbactins生物合成基因簇的挖掘和组合生物合成蛋白酶体(proteasome)负责降解错误折迭、过量的蛋白,是抗肿瘤药物筛选的分子1靶标。短肽类化合物syrbactins家族被认为是新一代蛋白酶体抑制先导化合物。它们的核心骨架(也是活性中心)十二元内酰胺环母核的生物合成机制类似,都由非核糖体肽合成酶(NRPS)-聚酮合酶(PKS)复合体采用模块化组装方式合成,这种机制可以允许利用组合生物合成技术对其聚酮或聚肽骨架结构进行构效优化。本研究目标是通过基因组挖掘得到更多来源的syrbactins生物合成基因簇,通过理性设计和重新组合,建立syrbactins的“人工”生物合成途径,实现syrbactins的构效优化。1.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和异源表达:为了积累更多模块元件,本研究首先利用GenBank等数据库中大量的细菌基因组及宏基因组信息进行挖掘,利用在线程序Blast进行序列比对和分析,利用antiSMASH进行基因簇预测,发现了许多潜在的syrbactins生物合成基因簇,包含以前研究过的glb、syl、lmm(分别合成丁香霉素(syringolins)、滑杆菌素(glidobactins)、cepafungins 和luminmycins等化合物)以及新发现的Pglb(来自荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderi 1 glumae PG1))。因在原始菌中未检测到syrbactins家族产物积累,对Pglb基因簇进行直接克隆、异源表达以及进行启动子的原位插入激活等实验,但均未能激活相应基因簇的表达。1.2 Syrbactins家族异源表达宿主的筛选:为便于进行不同基因簇之间组合生物合成,本研究尝试在白色链霉菌J1074(StreptomycesalbuJ1074)、伯克氏菌DSM 7029(Burkholderial(DSM 7029)、天蓝色天霉菌(Streptomycescoelicolor)等几种常用宿主中异源表达syrbactins生物合成基因簇,期望找到最佳适配性的宿主,以有效表达“人工”的syrbactins生物合成基因簇。目前结果发现:白色链霉菌中,syl可以表达,但glb不能表达;天蓝色链霉菌中,syl和glb均不能表达,伯克氏菌中syl不能表达。尚未找到能同时高效表达glb、Pglb和syl叁个基因簇的宿主菌。1.3 Glidobactins生物合成基因簇的阻断与回补:对伯克氏菌DSM 7029基因组上glidobactins生物合成基因glbC和glbF成功进行敲除,获得单基因敲除突变菌株。HPLC-MS分析发现,glbC和glbF敲除突变株没有glidobactins产生,成功阻断了 glidobactins生物合成通路,说明glbC和glbF作为结构基因对glidobactins生物合成非常关键。将构建好的glbC和glbF回补表达质粒电转化到以上敲除突变株中,发现:基因回补后能恢复glidobactins的生产,但产量降低为野生型DSM 7029的10%。1.4 Glidobactins生物合成基因簇结构基因的种间替换:以上面获得的glbC和glbF敲除突变株为基础,尝试利用来自syl以及Pglb基因簇中的同源基因进行结构基因的种间替换(预期发生氨基酸残基的替换):sylD(与glbC同源)、sylC(与glbF同源)和PglbC(与glbC同源)分别导入DSM7029敲除突变株,替换glbC和glbF。HPLC-MS检测发现,种间结构基因替换未能产生杂合化合物。1.5 Glidobactins生物合成基因簇模块和结构域替换:以直接克隆得到的glidobactins生物合成基因簇glb为基础,分别敲除glbC中的第二个模块和该模块中的腺苷酰化结构域A;随后将来源于syl和PglP两个基因簇中的相应的模块和腺苷酰化结构域无痕插入到glbC中,完成模块替换。最后将构建的“人工”生物合成基因簇导入到敲除了glb的DSM 7029进行表达,结果没有预期的杂合化合物产生(仅产生了二肽结构的化合物),说明模块和结构域替换导致glidobactins生物合成通路中断。为了消除不同生物来源的syrbactins生物合成基因簇GC含量以及密码子偏好性的影响,我们对用于替换的模块进行了密码子优化,然后重新进行模块和结构域的替换,结果也没有检测到预期化合物。2异戊烯吲哚类化合物prenylisatin的生物合成Prenylisatin是细菌来源的异戊烯吲哚类化合物,具有抗细菌、抗真菌及细胞毒性等特性,是色氨酸在异戊烯基转移酶的催化作用下,在不同位置发生了异戊烯基取代形成的。虽然目前已经发现一系列异戊烯基转移酶,能对吲哚环上所有非桥头原子(N-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6和C-7)进行异戊烯化,但这类化合物完整的生物合成通路仍未阐明。本研究目标是利用Red/ET直接克隆技术进行基因组挖掘,鉴定异戊烯吲哚类化合物prenylisatin生物合成基因簇,研究其生物合成途径,为进行更多类似化合物的生物合成奠定基础。2.1 Prenylisatin生物合成基因簇的直接克隆和异源表达:我们利用antiSMASH对放线菌“D74”(Streptomycesrochei)基因组进行基因簇预测,发现此菌株含有大量次级代谢基因簇;对其中沉默的基因簇cluster 2进行直接克隆,导入到天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomycescoelicolor A3(2))中。HPLC-MS检测证明:异源表达成功激活该基因簇,该化合物m/z 215.6[M+H]+,与文献报道一致。2.2 Prenylisatin生物合成基因簇中单个基因的功能研究:分别对prenylisatin基因簇中包含的17个基因进行单基因同框缺失突变,获得17个单基因突变菌株,然后进行LC-MS分析。结果表明:叁个基因isa8、iia9和isal0为prenylisatin生物合成途径中的关键基因,缺失后导致目标产物不再积累。同源性分析表明isa8和iia9分别为色氨酸合成酶和芳香族异戊烯转移酶基因。isal0功能不确定(推测编码转录调控因子)。3总结本研究开展系列组合生物合成研究,利用结构基因替换、模块替换及结构域替换,结合密码子优化等,构建系列syrbactins人工生物合成途径,但均未得到预期杂合化合物。Syrbactins化合物是通过NRPS-PKS杂合途径合成的,其中的蛋白质-蛋白质相互作用比单一的NRPS或PKS途径更加难以预测,微小的改变也会对整个生物合成途径产生巨大影响,目前有报道关于NRPS模块替换产生新化合物,但罕有NRPS-PKS杂合基因簇模块替换成功的案例报道。从放线菌基因组上直接捕获了 30 kb的prenylisatin生物合成基因簇,并成功进行异源表达和单基因敲除,鉴定叁个关键基因(编码色氨酸合成酶、芳香族异戊烯转移酶和未知功能蛋白),为异戊烯吲哚类天然活性产物组合生物合成提供重要的基因资源。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-17）
刘岚清,刘宏,张伟,姚明东,李炳志[4]（2019）在《利用异源酶组合构建酿酒酵母中咖啡酸的生物合成》一文中研究指出微生物中构建植物源天然产物的生物合成面临着许多挑战,尤其是当需要表达与激活植物源细胞色素P450酶的时候。通过从几种细菌中筛选HpaB和HpaC两种酶,本文在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了具有活性的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4HPA3H),它可以发挥植物源细胞色素P450酶的相似作用,用于生产咖啡酸。在与一个共同的酪氨酸氨裂合酶(TAL)协同作用下,不同的异源HpaB酶和HpaC酶组合在将底物L-酪氨酸转化为目标产物咖啡酸上展现出不同能力。以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的HpaB酶和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的HpaC酶的异源酶组合可生产最高咖啡酸产量,摇瓶培养下可达到(289.4±4.6)mg·L–1。酵母底盘细胞与异源酶的相容性得到了有效的改善,咖啡酸的产量比初始值提高了40倍。铜绿假单胞菌HpaB酶中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域周围的6个关键氨基酸残基与其他细菌来源的HpaB酶有明显区别,可能在影响酶活性方面起关键作用。综上,我们建立了一种有效的方法来构建高效的酵母系统用于合成非天然羟基苯丙烷类化合物。(本文来源于《Engineering》期刊2019年02期）
刘帅[5]（2019）在《海洋真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成相关功能基因的异源表达及初步敲除》一文中研究指出深海海洋中有着丰富的微生物资源,尤其是深海真菌,能够产生大量新颖的、有较强生物学活性的次级代谢产物。由于独特的海洋生存环境,例如高温,高压,低营养以及弱光照,导致海洋真菌具有丰富的物种多样性,加上特殊的防御机制,能促进各种类型的次级代谢产物的生物合成。此外,已经报道过的新型海洋真菌次级代谢产物高达有1000多种,而且部分在抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化以及抗癌症等方面有较强的活性。胶霉毒素是烟曲霉合成的具有氧化还原性的非核糖体环肽,是一种含2个硫的有很强致病性的二酮哌嗪类化合物(ETPs)。胶霉毒素能破坏细胞内氧化还原平衡,产生活性氧等有害物质。其在抗肿瘤、抗真菌、抗氧化以及作为医疗诊断试剂方面具有良好的开发前景。本课题组前期已从深海真菌Geosmithia pallida FS140中分离出了大量具有抗真菌及抗肿瘤活性的胶霉毒素及其衍生物,其中有大量结构新颖的胶霉毒素类二聚体化合物,提示该真菌可能存在独特的胶霉毒素生物合成基因簇。本论文对分离自南海深海沉积物的真菌曲霉Geosmithia pallida FS140中胶霉毒素生物合成关键基因gliT和gliM2进行了异源表达纯化和酶学性质分析,硫氧还蛋白还原酶的最适酶促反应温度40℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在30℃时最好;甲基转移酶的最适反应温度为35℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在35℃时最好,为后续其在生产实践中应用奠定了基础。对gliF基因进行了在酵母细胞中的成功克隆,构建了含gliF基因的pPIC9k表达载体,并对其进行了成功的表达纯化,为后续继续研究其酶学性质提供了有力条件。并且对功能基因gliT和gliF进行了CRISPR-Cas9系统的构建,优化了深海真菌原生质体的制备方法和转化方法,为后续深海真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成功能基因和代谢通路的研究奠定了分子生物学基础。综上所述,本研究从深海真菌中筛选出胶霉毒素生物合成关键基因gliT、gliM2和gliF,并对其进行了体外克隆、异源表达、分离纯化与酶活分析,为进一步研究深海真菌Geosmithia pallida FS140的硫氧还蛋白还原酶、氧甲基转移酶和细胞色素氧化酶的生物学功能及更好地将深海真菌Geosmithia pallida FS140应用于工业生产提供参考依据。并且,构建出适用于深海丝状真菌的CRISPR-Cas9敲除系统和原生质体制备系统,为深海丝状真菌更多功能基因的挖掘以及分离新型活性次级代谢产物骨架奠定分子生物学基础。(本文来源于《福建农林大学》期刊2019-03-01）
包莹玲,吕旭浩,赵威棣,周靖阳,祝衢鑫[6]（2018）在《多目标优化新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的异源双控表达》一文中研究指出[目的]基于试验设计对高粱素生物合成关键酶-烷基间苯二酚合酶(Sb_ARS)的异源双控表达进行多目标优化。[方法]在前期成功进行Sb_ARS的温控自裂解异源表达的基础上,依次通过PB设计、最陡爬坡设计、响应面设计及线性加权多目标优化等方法,分析了11个与Sb_ARS在大肠杆菌中双控异源表达密切相关因素的影响。[结果]菌体培养时长、IPTG诱导时长和甘氨酸浓度对Sb_ARS酶活力和裂解率影响显着;当菌体培养时长为6.8h、IPTG诱导时长为4.6 h和甘氨酸质量浓度为1.0 g/L时,可获得总体最优Sb_ARS酶活力(117.12±0.13)%和裂解率(89.21±0.35)%。[结论]研究结果为新型除草剂高粱素的生物合成研究奠定理论基础。(本文来源于《农药》期刊2018年12期）
王苗,王倩,岳昌武[7]（2018）在《链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展》一文中研究指出天然活性物质的合成、调控和抗性基因都是成簇的排列在微生物基因组内,通过基因工程等技术,将目的基因转移至不同的宿主菌内异源表达,不仅能够激活沉默基因簇,且可将异源表达体系作为一个非常有用的工具,通过生物合成或组合生物合成的方法生产出更多结构新颖且功能独特的实用天然产物或其衍生物[1-2]。本文针对近年来在链霉菌体内次级代谢产物生物合成基因簇的异源表(本文来源于《贵州医药》期刊2018年07期）
郑彩云[8]（2018）在《藻红蛋白在大肠杆菌中的异源高效生物合成》一文中研究指出藻胆蛋白是某些藻类特有的重要捕光色素蛋白。藻胆蛋白的来源主要有两种:天然提取和异源生物合成。本研究利用代谢工程原理,首先以双启动子质粒pRSFDuet,将藻胆蛋白亚基基因cpcB和裂和酶基因cpcS组成多顺反子,插入到第一个表达框中。藻红胆素生物合成酶基因Ho1和pebS组成多顺反子,插入到第二个表达框中。质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物浓度、诱导温度和诱导时长等发酵条件。利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株。以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白最大吸收峰为555 nm,最大荧光发射峰为565 nm,色基结合率达92.0%,OD_(555)/OD_(280)为8.0。成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。其次由于藻红蛋白的抗氧化活性与色基结合率呈正相关,又不同裂和酶催化色基结合不同的脱辅基蛋白,其光谱学性质出现差异,通过能量共振转移,增加重组蛋白的stokes位移。首先筛选四种不同来源的cpcT,将藻红蛋白合成所需基因(ho1、pcyA、cpcB、cpcT)构建于双启动子质粒pRSFDuet。质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,纯化后分析重组蛋白的光谱学性质,得到念珠藻(Nostoc)PCC 7120来源cpcT催化PEB特异性结合到CpcB的Cys-153上,获得的重组藻红蛋白在535nm处具有特征吸收,荧光发射峰为546nm。第二将Bp-1来源cpcS构建于载体pBAD(His-A)中得pBAD(His-A)-cpcS。与上述pRSFDuet质粒共转化大肠杆菌后获得表达菌株,CpcS催化PEB在Cys-84位点结合的裂合酶。分离纯化结合双色基重组藻红蛋白,其特征吸收峰为500、555nm,荧光发射峰为560nm,Stokes位移增加。最后,裂合酶活性,直接影响色基结合率,进而影响藻红蛋白的生理化性质。本研究旨在为发现新型裂合酶奠定基础,为体外重组藻红蛋白的合成提供更加宽阔的途径。聚球藻(Synechococcus sp.)CC9311基因组表达文库作为筛选对象。Sau3AⅠ对聚球藻CC9311基因组DNA进行不完全酶切。尝试与载体G110200和G112939进行连接,转化,涂板诱导表达。最后通过流式细胞仪筛选出具有荧光特性的菌种。首先确定聚球藻CC9311基因组DNA提取方法即植物基因组提取试剂盒:1mg聚球藻CC9311藻体可提取基因组DNA约1.8μg。使用Sau3AⅠ对聚球藻CC9311基因组DNA进行不完全,酶切最佳条件:1 U/μg基因组DNA,37℃,酶切10min。流式细胞仪分选得具有荧光的菌体。本研究实现了重组藻红蛋白在大肠杆菌体内的高效生物合成,确定了色基结合率与抗氧化活性的线性关系。通过共转化获得了结合双色基的重组藻红蛋白,建立了聚球藻基因组表达文库的构建方法和筛选流程。为藻胆蛋白的异源生物合成提供了新思路,为其广泛应用奠定了基础。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2018-06-01）
岳新晶[9]（2018）在《埃博霉素在异源宿主黄色粘球菌中的生物合成和遗传改造研究》一文中研究指出埃博霉素(epothilone)是由粘细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物,与着名的抗癌药物紫杉醇(taxol)具有类似的抗肿瘤机制,即促进微管蛋白聚合,稳定微管结构,抑制肿瘤细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成,进而抑制其生长。由于分子量更小,水溶性更好,对于多重耐药肿瘤细胞仍有很好的抑制活性,埃博霉素被认为是紫杉醇的更新替代产品。作为极具潜力的抗癌药物,埃博霉素迅速成为国内外生物和医药学等多个领域的研究热点。目前,埃博霉素主要通过微生发酵进行生产制备,由于发酵产量低,分离困难等原因,埃博霉素高昂的生产成本使其成为临床抗癌药物中的“天价药”。近年来,相关研究人员陆续尝试了在不同异源宿主中表达埃博霉素生物合成基因簇,但是表达产量远远低于本源菌。黄色粘球菌作为纤维堆囊菌的近缘宿主,因为其可以提供丰富的前体物质,生长代时更短,而且遗传操作体系成熟,被证明是高效表达埃博霉素的一个友好宿主。对于此类友好宿主,通过遗传改造提高埃博霉素基因簇在宿主中的表达水平,可能是从根本上解决埃博霉素异源表达低产问题的最直接途径,但是目前国内外对此方面的研究尚处于空白。本实验室在前期的工作中通过转座的方式将So0157-2的埃博霉素基因簇及上下游侧翼序列整合至黄色粘球菌DZ2的基因组中,获得突变菌株ZE菌,成功实现了埃博霉素的异源表达。借助于这样一个高效的异源宿主平台,我们围绕着进一步提高埃博霉素异源表达产量这一目标,对菌株的发酵条件进行了初步的优化,并且对埃博霉素基因簇的转录调控和宿主展开了一系列遗传改造研究。首先,我们对ZE菌的发酵条件进行了初步的研究,通过多个批次的发酵实验确定了菌株在实验室摇瓶发酵条件下的最佳接种比例和最佳发酵周期。在培养基中添加油酸甲酯不仅可以促进菌株的生长,也可以提高菌株中埃博霉素基因簇的转录水平,进而使得埃博霉素的异源表达产量获得约十倍的提升。为了更为直接有效地调控埃博霉素的合成,我们试图寻找与其相关的调控基因。本课题组在前期工作中发现,在So0157-2插入失活基因簇上游紧邻的一个基因后,埃博霉素的产量提高4倍,说明该基因的表达可能抑制埃博霉素的合成,并由此将该基因命名为esi(epothilone synthesis inhibitor)基因。随后,本论文在埃博霉素异源表达菌ZE中对这一结果进行验证,发现esi基因的表达水平与埃博霉素基因簇的转录水平及埃博霉素产量存在负相关。结合生物信息学分析预测和体外实验验证,我们确证esi基因所编码的蛋白可以结合埃博霉素基因簇的启动子并对基因簇的转录进行负调控,而且最佳的结合位点位于基因簇启动子转录起始位点下游的一个17 bp的特殊序列。这是目前报道的第一个,也是唯一一个埃博霉素的转录调控因子。在ZE菌株中敲除该负转录调控因子,埃博霉素基因的转录水平显着上调,埃博霉素的产量提高38%。启动子是调控基因转录水平的核心,所以我们试图使用内源性的强启动子来替换基因簇的原始启动子Pepo。我们选择了黄色粘球菌中两个高表达内源基因的启动子PpilA和PgroEL1,使用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因在大肠杆菌中证明PpilA和PgroEL1表现出远高于埃博霉素基因簇启动子Pepo的转录活性。但是使用PpilA和PgroEL1分别替换Pepo后,埃博霉素的产量显着降低,降幅达80%。随后,我们在黄色粘球菌中详细分析了叁种启动子表达gfp基因和埃博霉素基因簇的时间模式,发现Pepo启动子在培养初期保持稳定而较低的转录活性,在培养后期转录活性显着增强,而PpilA和PgroEL1在菌株生长初期的转录活性很高,但是随着培养时间的延长,转录活性迅速下降。埃博霉素是一类次级代谢产物,一般认为在细胞生长的后期或稳定期开始大量合成,所以PpilA和PgroEL1启动子这种先高后低的表达时间模式不适合用于埃博霉素的合成。以上研究结果揭示了部分强启动子不适用于表达次级代谢产物的原因,也提示我们在通过启动子改造过表达目的基因时,除了启动子的转录强度,启动子转录基因的时间模式也应当作为一个重要的指标进行考量。埃博霉素的生物合成基因簇包含7个组成基因,各基因表现出不同的转录频率和转录丰度。基因簇内部转录水平低的基因,有可能成为限制埃博霉素合成速率的限速步骤。我们在埃博霉素基因簇内部不同位置插入额外的启动子,有效提高插入位点下游基因的转录水平,进而提高埃博霉素的表达产量。例如在epoB基因前分别插入Ppil4后,epoB、epoC和epoD的转录水平分别提高了 8.5倍,4.1倍和2.6倍,而埃博霉素的总产量分别提高34%。在同一位置插入Paph后,对基因簇转录和埃博霉素产量产生类似影响,只是影响程度较弱。此外,我们注意到启动子的插入对上游基因的转录产生不利影响。在epoE基因前插入Paph后,epoP-epoD的转录水平均显着下降,对应的埃博霉素产量也下降90%。启动子插入实验展示了通过协调基因簇各基因转录水平来调控埃博霉素产量,进而由此寻找埃博霉素合成过程中限速步骤的可行性,但是实验策略有待完善。黄色粘球菌可以合成大量PKS/NRPS次级代谢产物,内源性次级代谢产物与埃博霉素的合成竞争大量的前体物质和能量,所以我们试图对这些内源性的次级代谢基因簇进行失活。通过软件预测,在黄色粘球菌DZ2中可能存在24个次级代谢基因簇,其中仅有6个被详细研究并鉴定到了对应的产物。我们优先选择了 5个产物产量较高的PKS/NRPS基因簇,通过敲除关键基因对产物合成途径进行失活,最终成功获得4个次级代谢基因簇的单失活突变株。4个突变株具有类似的生长曲线,说明失活次级代谢基因簇对宿主的生长速度没有明显的影响,但是其中两个突变株中埃博霉素产量显着提高(提高幅度分别为34%和19%),而另外两个突变株的埃博霉素产量显着降低(降低幅度分别为61%和80%)。以上实验结果说明失活宿主菌内源性次级代谢基因簇对埃博霉素的合成产生截然不同的影响,反应出宿主内次级代谢复杂的调控网络。宿主菌中仍有大量内源性次级代谢基因簇有待研究,每个基因簇的逐个单失活实验可以规避产生不利影响的基因簇,有效筛选出敲除后能够促进埃博霉素合成的基因簇。我们预期通过多个基因簇的组合失活,不仅可以进一步提高埃博霉素的表达产量,也可以为精简宿主基因组,构建适合表达埃博霉素的底盘生物奠定初步的实验基础。综上所述,我们利用实验室前期构建的埃博霉素异源表达宿主平台,在优化异源表达菌株发酵条件的基础之上,利用异源宿主成熟的遗传操作体系,通过鉴定并敲除埃博霉素基因簇的负转录调控因子,基因簇的启动子改造和宿主菌内源性次级代谢基因簇的失活,有效提高了埃博霉素在异源宿主中的表达产量。以上叁种改造思路均能不同程度地促进埃博霉素的合成,我们预期通过整合不同改造策略,可以实现促进作用的累加,大幅提高埃博霉素的异源表达产量,使其能够媲美甚至优于本源菌。构建高产的埃博霉素异源表达菌株不仅有助于实现埃博霉素的高效率规模化生产,创造巨大的经济价值和社会效益,也使得通过遗传改造定向改造埃博霉素成为可能,为筛选新型抗肿瘤药物提供更多选择。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-30）
范佳会,侍媛媛,江志波,李星星,雷璇[10]（2018）在《Sansanmycin生物合成基因簇在天蓝色链霉菌中的异源表达》一文中研究指出Sansanmycins(SSs)是一类由Streptomyces sp.SS产生的尿苷肽类抗生素,具有抗结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌活性。该类化合物主要是由4',5'-烯胺-3'-脱氧尿苷通过肽键与假四肽肽链中的N-甲基-2,3-二氨基丁酰基(DABA)相连。为了研究相关基因的功能,进一步利用合成生物学的手段获得SSs的新结构衍生物,本实验克隆了完整的SS生物合成基因簇,并将其在天蓝色链霉菌M1146、M1152和M1154中异源表达。借助于HPLC和LC-HRMS/MS等对重组菌株的发酵液进行分析,结果表明叁株异源表达菌株均能产生SS-A,而且M1154异源表达菌株的SS-A产量与未退化的野生型菌株相当。同时从M1154异源表达菌株发酵液中发现了一个可能为新结构的SS类似物SS-1154。(本文来源于《药学学报》期刊2018年06期）
异源生物合成论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
近些年,随着抗生素的广泛使用甚至滥用,细菌耐药性逐渐增加。耐药性致病菌的传播和感染严重危害人类健康,已经成为世界范围内的棘手问题。来源于不可培养土壤微生物Eleftheria terra的缩肽类抗生素teixobactin具有独特新颖的双重靶标作用机制,即通过同时与细菌细胞壁上肽聚糖前体脂质Ⅱ及壁磷壁酸前体脂质Ⅲ的保守序列相结合来阻断细菌细胞壁的合成,对多种耐药性致病菌具有显着强效的抑制活性,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等。这种特殊的作用方式使病原体对其很难产生耐药性。因而,teixobactin作为一种对抗耐药性致病菌的先导化合物在抗感染药物研发方面显示出巨大的潜力。Teixobactin结构中的十叁元环及稀有的非天然氨基酸L-allo-enduracididine(L-allo-End)的化学合成难度大,产量难以提升;其生物合成基因簇大(约52 kb),其产生菌Eleftheria terrae不可培养。所以,本研究拟通过teixobactin生物合成基因簇全合成和生物合成途径的重构,在可培养微生物中实现teixobactin的生物合成,克服化学合成方面的局限。结果如下:1.Teixobactin人工生物合成基因簇的合成、组装和异源表达基于NCBI数据库中公布的teixobactin生物合成基因簇序列信息,首先进行基因簇的分段化学合成,获得11个片段;利用Red/ET同源重组工程和ExoCET重组技术对1 1个DNA片段进行多片段组装等,得到了teixobactin人工生物合成基因簇,并构建不同的表达质粒。选择合适的底盘细胞,使teixobactin的人工生物合成基因簇得以高效的表达,检测到一系列化合物积累;抑菌活性实验表明,发酵粗提物对于枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性。将这一系列化合物进行分离纯化,并进行了高分辨质谱-超高压液相色谱联用仪(HPLC-HR-ESIMS)和核磁共振技术(NMR,nuclear magnetic resonance)分析(正在鉴定结构),为基因簇的理性设计提供理论依据。Teixobactin生物合成基因簇序列中以及异源宿主基因组上均不包含其非天然氨基酸前体物L-allo-End的生物合成相关基因,异源表达表明宿主细胞不能提供该氨基酸前体。利用6M盐酸过夜进行Marfey水解反应,水解含L-End和D-allo-End的恩拉霉素,并添加酸水解物到以上异源表达发酵体系中进行喂养实验,但是未检测到含该非天然氨基酸家族的teixobactin及相关衍生物的积累。2.Teixobactin前体物-End家族非天然氨基酸的生物合成基因簇重构推测L-allo-End在teixobactin中的生物合成很有可能也遵循与其他该家族氨基酸类似的途径,所以搜索NCBI数据库获得两种放线菌来源的End家族非天然氨基酸的生物合成基因簇序列(编码叁个酶,即MppP/MppQ/MppR和EndP/EndQ/EndR);通过化学合成、组装及修饰,重构已知的该家族非天然氨基酸的生物合成基因簇;异源表达检测到两个相关化合物积累(结构待鉴定)。3.Teixobactin-End人工生物合成基因簇构建和异源表达将teixobactin人工生物合成基因簇和End人工生物合成基因簇进行组装缝合,构建teixobactin-End人工生物合成基因簇。导入异源宿主细胞中,进行液体发酵。发酵液HPLC-MS分析表明:新积累的化合物分子量明显大于上面得到的teixobactin衍生物,推测可能是End前体结合产物(需通过提高产量来进行结构解析)。4.总结:基于基因化学合成、同源重组、多片段组装、DNA无缝定点改造等技术,本研究首次实现了不可培养细菌来源的teixobactin生物合成基因簇(约52kb)的人工合成和组装、组合生物合成和异源表达,获得了一系列具有生物学活性的化合物,并重构了其重要前体物End家族非天然氨基酸的生物合成途径。本研究将会推进多肽类抗感染药物的新药研发,有助于对抗耐药性的新一代抗生素的创新研制。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
异源生物合成论文参考文献
[1].李昕阳.海洋曲霉属真菌次级代谢产物及其生物合成基因簇异源表达研究[D].浙江大学.2019
[2].张焕云.抗感染抗生素teixobactin的生物合成途径的重构和异源表达[D].山东大学.2019
[3].刘晓彤.蛋白酶体抑制剂syrbactins的组合生物合成和prenylisatin的异源表达[D].山东大学.2019
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[5].刘帅.海洋真菌GeosmithiapallidaFS140胶霉毒素生物合成相关功能基因的异源表达及初步敲除[D].福建农林大学.2019
[6].包莹玲,吕旭浩,赵威棣,周靖阳,祝衢鑫.多目标优化新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的异源双控表达[J].农药.2018
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