赵晓莹
【关键词】高效液相色谱法；河套大黄；土大黄苷；清肺抑火片
【中图分类号】R696【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)07-0367-01
国家药典规定，正品大黄来源于蓼科，属于掌叶组植物的干燥根及根茎。以个大，色黄而得名。品种包括掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄，主产地在四川、青海、甘肃等地，栽培或野生，产量并不大[1]。伪品大黄主要来源波叶组的波叶大黄，包括河套大黄、华北大黄、藏边大黄等，主产地在华北、新疆、西藏、青海等地。波叶组的伪品大黄产量大，流散广，市场中较为常见，但其并非药典收藏的正品大黄，因此均属伪品。正品大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效，是临床较为常用的一种药品。而伪品大黄则不具备这样的功效。目前由于正品大黄产量有限，市面上涌现出大量伪品大黄以假乱真、以次充好，严重干扰医疗市场，甚至威胁患者的生命健康，因此，鉴别大黄真伪至关重要。正品大黄无论从宏观还是微观，甚至理化性质检测结果均与伪品大黄有着很大区别，鉴定的方法也多种多样。本文采用高效液相色谱法（HPLC法）对大黄真伪进行鉴别，并选取清肺抑火片为含大黄中成药物的代表，鉴定其所含大黄真伪，现报道如下。
1方法
1．1仪器与试药：仪器：日本岛津（LC-2010A）高效液相色谱仪；TG332A型微量分析天平(上海分析天平厂)。试药与试剂：土大黄苷对照品，批号110756-200110，来源于中国药品生物制品检定所；河套大黄取自本省药品检验所药材标本室，正品大黄药材购自我省药材公司，上述2种药材均经本所主任药师鉴定。清肺抑火片市售品购自永安大药房，生产厂家云南金柯制药有限公司，批号20094331。
1．2色谱条件:色谱柱为LichrospherC18柱(0.25cm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，检测波长320nm。流速1mL/min，SYG柱温25℃。
1.3对照品溶液的配制:精密称取土大黄苷对照品3.39mg，置25mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。
1．4供试品的制备:取正品大黄及河套大黄，研成细粉，精确称取药材1．0g，加入甲醇25ml，超声处理后，过滤，滤渣用少量甲醇洗涤3次，合并滤液和洗液，减压浓缩，残渣加甲醇溶解，转移至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。取清肺抑火片20片，去包衣后精密称量、研细，再精密称取适量(约相当于2片量)，置锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，超声振荡20min，放冷，用甲醇补充至刻度，精密吸取续滤液10mL，即为供试品液。
2结果
2．1色谱条件及系统适用性:色谱柱：LichrospherC18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(35：5：60)，流速1.0ml/min，检测波长320nm，色谱图见图1。
图1A对照品B河套大黄C正品大黄
2．2线性关系:精密称取土大黄苷对照品14mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL分别含0．28mg、0．32mg、0．16mg的混合液。作为对照品储备液，各吸取对照品储备液50、100、200、300、400、500、600于5mL量瓶中，用甲醇定容。进样测定，以对照品进样量为横坐标，峰面积分值为纵坐标绘制工作曲线，得到回归方程：Y=0.37+2648.20m，r=0．998。结果表明，土大黄苷进样量在0.316-3.69ug时，峰面积与进样量呈良好线性关系。
2．3精密度试验:精密量取对照品溶液，重复进样6次，每次进样量10ul，测得土大黄苷含量，相对标准差RSD为0．28%。
2．4加样回收率试验:精确称取已测定的大黄样品5份，每份0.25g，分别精密加入对照品储备液1.3mL，对照储备液1.6mL，按照供试品溶液制备同法操作并按上述条件测定。结果为99.18%，RSD为0.82%。
2．5样品稳定性试验:按供试品液制备方法处理，并按色谱条件测定记录色谱图，以外标法峰面积计算RSD为0.61%。结果表明：供试品溶液室温下放置在12小时内稳定。
2.6样品测定:取河套大黄样品及清肺抑火片分别按上述方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液及对照品溶液各5uL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算样品中土大黄苷的含量及RSD。结果显示：河套大黄含土大黄苷4.05%，RSD0.41%；清肺抑火片及正品大黄中不含土大黄苷。
3讨论
大黄是我国特产中药材之一，以四川西部和甘肃的大黄质量上乘，药用价值最好。我国药典规定的符合药用正品的大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄及药用大黄的干燥根茎和根。近年来，随着中药事业的发展，中药品种逐渐增多，饮片使用数量也日益加大，加之野生大黄逐渐减少，种植栽培的大黄亦不能满足市场需求，导致陆续出现华北大黄、河套大黄、藏边大黄、天山大黄的根伪充大黄的情况，且伪品大黄日益增多。大黄为苦寒泻下之物，其荡涤肠胃、峻下力猛、走而不守，同时也有活血化瘀、破癥瘕积滞的功效。但由于目前中药市场存在着以伪充真、以劣充好、生熟不分等情况，严重影响了大黄饮片及含大黄成分的中成药的质量、信誉和使用效果，甚至影响人民群众的健康水平。本研究就正品大黄与伪品大黄的鉴定方法进行了研究，以期杜绝上述现象的发生，使药材用名实物相符，确保疗效。
正品大黄与伪品大黄有多处异同点，可通过性状、理化等方法鉴别出正品大黄。①性状鉴别：正品大黄根呈圆柱形、圆锥形或不规则块状，长317cm．直径3～1lcm，外皮棕褐色，除去外皮表面黄棕色至红棕色，质坚实，断面淡红棕色．木部发达，具放射纹理。根茎横切面髓部较宽，可见星点，排列呈环状或散在，气清香，昧苦而微涩．嚼之粘牙，有沙砾感。伪品大黄：根呈圆柱形或纵刮皮不规则条块状、圆柱形的长4～8cm、直径1～4cm，外皮褐棕色，多已刮腺．表面黄棕色．横断面橙红色至黄棕色，根木部宽广，射线细密，红棕色。根茎横切面无星点，气不清香而浊，味先涩后苦。②理化鉴别：正品大黄其粉末的稀乙醇浸出液点于滤纸上，滴加稀乙醇扩散后，显黄色至浅棕色环，置紫外光下观察，显棕色至棕红色荧光。伪品大黄其粉末稀乙醇浸液点于滤纸上，滴加稀乙醇扩散后，显黄色至浅棕色环，置紫外光下观察，显蓝紫色荧光。③显微鉴别：正品大黄粉末呈黄棕色，草酸钙簇晶20～1601a，棱角多短钝，具有缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管，淀粉粒非常多，呈类球形或多角形，单粒淀粉直径3～45皿，复粒由2～8粒组成。伪品大黄其粉末草酸钙簇晶20～85，棱角尖于正品大黄，单粒淀粉直径3～241a，粒复由2～6粒组成，较正品大黄小而少[2]。从以上的叙述可以掌握真伪大黄的明显区别点，有助于确保临床用药的安全性、有效性，保证中药质量、信誉和使用效果。但同时宏观鉴别有赖于经验，而上述几种理化鉴别方法敏感性及准确率尚不够理想，HPLC法是一种更为准确方便的鉴定方法。
高效液相色谱是近三十年来出现的一种新的色谱技术，是色谱法的一个重要分支，其发展速度相当迅猛，短短时间内，已经广泛应用于临床及实验室研究中。采用液相色谱及气相色谱相结合的方法，以液体为流动相，采用高压输送系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。高效液相色谱具有高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快、选择性好等特点，同时色谱柱可反复使用、样品易回收，更适用于分离沸点高、对热稳定性差、分子量较大的物质，对于分析体内药物浓度、体内内源性物质、复杂中药成分尤其适合。中药是一种多成分、多元素混杂的混合体系，由多种药物配合组成方剂或中成药物，发挥多种成分的综合作用达到最佳治疗效果。因此，中药在治疗疾病中具有独特的疗效和优势，但由于其成分的复杂性，也导致了成分分析存在很大的困难，给药品质量监督带来较大的难度。高效液相色谱的应用给中药鉴定开辟了新的天地，借助高效液相色谱的特点可以更为准确、灵敏的鉴定中药及中成药物的有效成分，保证药物的疗效及患者的切身利益[3]。易华平等[4]采用HPLC法测定不同产地淫羊藿中淫羊藿苷的含量；孙蓉等[5]采用HPLC法测定金匮肾气片中马钱苷的含量均取得了良好的效果。本研究就HPLC法鉴定中药大黄及含大黄中成药的真伪进行了研究。土大黄苷是伪品大黄的成分之一，几乎没有泻下的作用[6]，正品大黄中不含有该物质，因此通过HPLC法检测土大黄苷含量可以进行真伪大黄的区分。通过本次实验，建立了鉴定正品大黄及伪品大黄的方法，能够准确判定样品中是否含有土大黄苷，从而为鉴定大黄及含大黄中成药物的真伪提供了一种精密、简便易行、安全可靠的方法，为临床用药安全提供了强有力的技术支持。
综上所述，中药一直以来被人们认为毒性低、安全性高。但近年来一系列国内外有关中药不良事件的报道，使人们对中药的安全性及疗效产生了质疑。中药复方的药效是建立在多种复杂化学成分综合作用基础之上的，质控较为困难。本文采用HPLC法测大黄真伪及含大黄中成药物中主药大黄的真伪，为更加全面有效建立中药制剂质量标准提供了详尽的理论依据，对提高中药复方的安全性具有重大意义。为更好地保证原方临床疗效，确保临床用药的安全性、有效性，保证中药质量、信誉和使用效果，有必要对该方法进行深入研究和广泛应用。参考文献
[1]中华人民共和国药典委员台．中国药典(一部)2000年版．北京：化学工业出版社．2000
[2]许靖.大黄真伪鉴别[J].天津药学.2001，13（6）：51-52
[3]李伟星，焦玉英.药物研究中HPLC的应用.科技论坛:9
[4]易华平.测定不同产地淫羊藿中淫羊藿苷的含量[J].湖南中医杂志,2007(23):67-68
[5]孙蓉.HPLC法测定金匮肾气片中马钱苷的含量[J].云南中医中药杂志，2010（31）：65-66
[6]卢伟.广金钱草及土大黄有效成分研究与应用[D/DB].中文学位论文数据库，2003：46-47
作者单位：233000安徽省蚌埠医学院第一附属医院