导读:本文包含了质粒测序论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肺炎克雷伯菌,p1512-KPC,碳青霉烯酶,blaKPC-2
质粒测序论文文献综述
蒋昭芳,赵亚超,李曼莉,周冬生,朱天川[1]（2019）在《肺炎克雷伯菌质粒p1512-KPC的测序及比较基因组学分析》一文中研究指出【目的】对多重耐药的肺炎克雷伯菌1512中的质粒p1512-KPC进行测序及比较基因组学的分析。【方法】利用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定,根据7对管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)对菌株进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)。利用PCR进行耐药基因的筛查,通过接合转移实验及电转化实验将质粒转入受体菌大肠杆菌EC600。采用改良Carba NP法检测细菌碳青霉烯酶的活性以及类型,使用VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪检测菌株最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。最后通过高通量测序技术结合生物信息分析手段明确菌株1512及质粒p1512-KPC的耐药基因谱,并通过比较基因组方法对质粒p1512-KPC的基本结构、耐药基因遗传环境及移动元件等结构基因组学特征进行分析。【结果】菌株1512为产A类碳青霉烯酶的多重耐药肺炎克雷伯菌,MLST分型结果显示该菌为ST11型。经PCR筛查,菌株1512包含bla_(KPC-2)、dfrA1和sul1耐药基因,其中bla_(KPC-2)基因位于不可结合转移但电转成功的质粒p1512-KPC上。测序结果显示,质粒p1512-KPC长度为117.69 kb,同时包含IncFII型复制子和属于Rep_3家族但类型未知的复制子repB,并携带耐药基因bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB。其中bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)及bla_(TEM-1)分别存在于截短的Tn6296、Tn6367及截短的Tn2的基因环境中。【结论】携带bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB基因的质粒p1512-KPC介导了肺炎克雷伯菌1512对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类及氨基糖苷类抗生素耐药,并能引起相应耐药基因的水平传播。此外,本研究还对IncFII型复制子和Rep_3家族复制子repB共存的质粒进行了比较基因组分析,为该类型质粒的多样性和进化提供了更深入的理解。(本文来源于《微生物学报》期刊2019年02期）
赵亚超[2]（2018）在《IncN1和IncFIB多重耐药质粒的测序及结构基因组学分析》一文中研究指出随着抗生素的滥用,多重耐药菌株逐渐增多,严重影响感染性疾病的治疗。细菌染色体上的耐药基因可以在很多种类的移动元件的作用下整合到质粒上,而质粒可以通过细菌间性菌毛的接触在不同菌种间进行传播。故明确多重耐药质粒中耐药基因、移动元件,阐明耐药分子遗传特征十分重要。本文针对临床分离的多重耐药菌株,对质粒介导多重耐药的机制进行探索研究,具体分为两个部分:(1)含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析;(2)IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tetA的测序和比较基因组学分析。含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析大肠杆菌BTR于2013年分离自北京同仁医院一名患者的尿液样本。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)进行多位点序列分型。进行质粒接合转移实验。为了验证bla_(NDM-1)在相关菌株中是否表达,通过改良Carba NP法检测菌株是否产碳青霉烯酶及其类型。通过微量肉汤稀释法检测药物敏感性。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取细菌基因组,使用“鸟枪法”构建全基因组文库,并在Ion PGM测序平台上进行高通量测序。通过多位点序列分型,大肠杆菌BTR属于序列型405,并且通过PCR筛查检测到bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、qnrS1、qnrD、erm(B)和mph(A)耐药基因的存在。bla_(NDM-1)和qnrS1基因可以通过接合转移方式从菌株BTR共转移到大肠杆菌EC600,产生接合子BTR-NDM-EC600,证明这两个耐药基因位于同一个质粒上,该质粒被命名为pNDM-BTR。菌株BTR和接合子BTR-NDM-EC600都产B类碳青霉烯酶,并且都对氨苄西林、头孢唑林、头孢呋新、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药,但都对替加环素、呋喃妥因、磷霉素和多粘菌素敏感。此外,菌株BTR还对氨曲南、氯霉素、阿奇霉素、庆大霉素和四环素耐药。本部分研究共纳入分析6个质粒,即IncN1型质粒的参考质粒R46、所有全测序且携带bla_(NDM)的IncN1型质粒(p LK78、p LK75、pEcNDM1和pNDM-BTR)以及与pNDM-BTR具有最高覆盖度和一致性的近源质粒pMR3-OXA181。每一个质粒的结构都可以分为保守的IncN1型骨架区和一些外源插入区。保守的IncN1型骨架区包括了repA和它的iterons、stbABC–orfD操纵子、保守上游重复控制调节子区以及kikA、resP、korB和tra基因。在六个质粒骨架区不同位点整合了很多外源插入区。R46包括一个多重耐药区,其由1型整合子In1、ΔTn6309、砷抗性座位arsRDABC–orf378、orf657和IS26组成。质粒p LK78、pLK75、pEcNDM1和pMR3-OXA181均包括了两个外源插入区:pLK78包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1021、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pLK75包括In1021-5’和一个由IS1X2、ecoRII–ecoRIImet、In1021-3’和Tn1721残余组成的多重耐药区;pEcNDM1包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1007、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pMR3-OXA181包括Tn3家族新的转座子Tn6361和由1型整合子In191、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的dfrA14区。pNDM-BTR包括叁个外源插入区,即IS26、dfrA14区和Tn3家族新的转座子Tn6360。本部分研究为耐药基因在IncN1型质粒间通过移动元件进行水平转移、IncN1型质粒的多样化和进化(特别是携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒)提供了更深入的理解,对携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒的流行病学研究提供了理论依据。IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tet A的测序和比较基因组学分析肺炎克雷伯菌A1705于2013年分离自沈阳盛京医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌911021于2014年分离自重庆医科大学第一附属医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌1642于2014年分离自北京307医院一名患者的肺泡灌洗液。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)进行多位点序列分型。使用QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒提取质粒,进行质粒电转化实验。通过VITEK-2自动系统检测药物敏感性。使用Qiagen Blood&Cell Culture DNA Maxi Kit提取细菌基因组DNA。针对菌株1642,构建了平均长度为5k的Nextera Mate Pair大片段文库,并在Illumina MiSeq测序平台上进行高通量测序。针对菌株A1705和911021,在基于单分子实时测序技术的PacBio RSII测序平台上进行测序。通过多位点序列分型,表明菌株A1705和911021分别属于序列型449和11,而菌株1642代表了一个新的序列型2040。通过PCR筛查,表明肺炎克雷伯菌A1705携带bla_(KPC-2)、bla_(NDM-1)、bla_(OXA-1)、qnrS1、oqxAB、tetA(A)、tetA(D)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(TEM-1)和bla_(SHV-33)耐药基因;肺炎克雷伯菌911021携带bla_(KPC-2)、qnrS1、oqxAB、mph(A)、tetA(A)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-11)和bla_(TEM-1)耐药基因;肺炎克雷伯菌1642携带bla_(KPC-2)、qnrS1、mph(A)、tetA(A)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-12)和bla_(CTX-M-14)耐药基因。菌株A1705、911021和1642中的qnrS1、tetA(A)和bla_(CTXM-14)基因均可以通过电转化方式共转移到大肠杆菌DH5α,产生电转子A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α,证明这些耐药基因分别位于同一个质粒上,质粒被分别命名为pA1705-qnrS、911021-tetA和1642-tetA。菌株A1705、911021和1642及其各自的电转子,即A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α都对氨苄西林、复方新诺明、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢曲松和庆大霉素耐药,菌株A1705、911021和1642还对头孢替坦、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、呋喃妥因耐药。此外,菌株911021和1642对阿米卡星耐药,但是菌株A1705对阿米卡星敏感。本部分研究中共纳入分析8个质粒,即参考质粒pKPN-c22(首次完整测序的含有基因repA和repB1的质粒)、pA1705-qnrS、p911021-tetA、p1642-tetA以及携带基因repA和rep B1且和各质粒具有最高覆盖度和一致性的四个的质粒,即pKPN3-307_typeA、pKPN3-307_TypeC、p6234-198.371kb和pKPSH11。每一个质粒的结构都可以分为骨架区和大量的外源插入区。主要的骨架区基因包括repA和repB1、umuCD、parAB以及parB的附着位点parC、finO和一系列F型接合转移基因,包括rlx、dtr、cpl、sfx、eex、tivF(tivF1到tivF16、tivF18和tivF19)、traJQ和trbEF。在八个质粒骨架区不同位点存在许多不同的外源插入区,尤其是在骨架区orf312和repB1之间存在一个巨大的外源插入区。该外源插入区内包括了一个或两个多重耐药区。质粒pKPN-c22、pKPSH11、p6234-198.371kb、pKPN3-307_TypeC、pKPN3-307_typeA、p911021-tetA和p1642-tetA都含有一个多重耐药区,而质粒pA1705-qnrS含有两个多重耐药区。各质粒的多重耐药区又由很多的移动元件组成,比如插入序列、整合子、转座子和转座单元。本部分研究为耐药基因在Inc FIB家族质粒间通过移动元件进行水平转移提供了更深入的理解。此外,为临床多重耐药肠杆菌科细菌,特别是多重耐药肺炎克雷伯菌的传播提供研究依据。总结本研究分别对两类多重耐药质粒进行了系统且全面的描述,包括复制起始基因、骨架区和外源插入区,耐药基因和移动元件,从而阐明了由多重耐药质粒介导的耐药机制,可为多重耐药菌的研究与防控提供理论支持。(本文来源于《军事科学院》期刊2018-05-23）
黄丽燕,陈定强,唐海玲,吴爱武[3]（2018）在《肺炎克雷伯菌质粒pIMP26_DQ49的高通量测序分析》一文中研究指出目的通过对肺炎克雷伯菌DQ49耐药质粒pIMP26_DQ49的测序及分析,研究其与肺炎克雷伯菌耐药的关系。方法利用多位点序列分型技术(MLST)检测肺炎克雷伯菌DQ49的序列分型(ST),通过接合实验得到携带耐药基因bla_(IMP-26)的质粒pIMP26_DQ49,利用Illumina Miseq高通量测序平台对该质粒进行测序,得到的数据用Edena软件拼接,并利用RAST网上注释工具对得到的质粒全序列进行注释,同时使用网上序列比对工具BLAST进行分析。结果 MLST分析该菌的ST型为新的ST型ST2460(基因型42-22-26-96-233-38-51);接合实验证明该质粒能通过接合转移进行传播;测序结果表明,pIMP26-DQ49属于质粒不相容群(Inc)中的IncN群,是大小为55 179 bp的环状质粒,携带3个耐药基因,G+C含量为50.4%,预测编码52个功能基因。BLAST发现pIMP26-DQ49与已报道的pIMP-HZ1序列相似度高达99%,且携带的可移动基因元件也高度相似,其耐药基因环境包含可导致转座事件发生的IS903D、IS2、Tn2、Tn3、tnp、tnpA,以及能捕获和整合外源性基因的1类整合子基因intl1。结论质粒pIMP26-DQ49携带超广谱β-内酰胺酶基因bla_(TEM-1)、喹诺酮耐药基因qnrS1和金属型碳青霉烯酶基因bla_(IMP-26),其存在可能对相应的耐药基因在肠杆菌科细菌中的传播发挥重要作用。(本文来源于《广东医学》期刊2018年01期）
梁权辉[4]（2017）在《多药耐药IncHI2型和IncHI5型质粒的测序及比较基因组学分析》一文中研究指出近年来多重耐药菌株和泛耐药菌株层出不穷且播散速度快,进一步增加了临床感染性疾病治疗的困难。携带耐药基因的质粒所导致的水平基因传播在细菌耐药中起着重要的作用,耐药基因一般通过插入序列、整合子和转座子等移动元件进行水平转移,质粒可以介导耐药基因在不同的细菌个体间转移,而移动元件则只能介导耐药基因在细菌个体内的DNA分子间转移。IncHI质粒是肠杆菌科细菌对抗生素耐药的重要载体。IncHI型质粒先前根据研究的次序分为IncHI1、IncHI2和IncHI3。本研究中,根据代表性质粒的复制起始基因及骨架保守序列特征将IncHI质粒进一步分为五类亚组,增加IncHI4和IncHI5两个亚型。经分析显示每个亚型内质粒骨架区域序列均存在着很高的遗传保守性,同时,五类IncHI质粒均保留有接合转移区tra1和tra2,还有碲耐药基因簇ter;即便如此,五类IncHI亚型质粒之间还是存在着很大的差异。从中国叁家教学医院临床病人分离出来的叁株多重耐药菌:阴沟肠杆菌T5282,弗氏柠檬酸杆菌112298和解鸟氨酸拉乌尔菌YNKP001,分别得到了 IncHI2型质粒pT5282-mphA、p112298-catA 和 IncHI5 型质粒 pYNKP001-dfrA;根据叁个质粒的序列从全球核酸数据库中挑选出IncHI2型参考质粒R478和IncHI5型参考质粒pKOX_R1,并对该五个质粒序列进行精细的生物学信息分析及比较基因组学分析。序列分析显示整合子,转座子和以插入序列介导的移动元件等一系列插入区域分布在质粒骨架区的不同位置,而这些元件构建起来的多重耐药区里一般携带着叁种及其叁种以上不同的耐药基因,其种类包括氨基糖苷类抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、β内酰胺类抗性基因、大环内酯类抗性基因、磺胺类抗性基因、喹诺酮抗性基因、利福平抗性基因、甲氧苄啶抗性基因、磷霉素抗性基因、季铵盐类抗性基因等。在了解多重耐药质粒结构的同时,发现并命名了一系列新的移动元件,包括7个转座子Tn6321、Tn6322、Tn6338-Tn6340、Tn6346 Tn6347;还有插入序列 ISEc16、ISCfr8-ISCfr11、ISKox1-ISKox3。自抗生素应用于临床感染性疾病的治疗,临床上不久便出现其相应耐药菌株,细菌在不同的抗生素选择压力及环境条件的变化下,使其快速获得并保留不同的抗性基因,并因此加速耐药菌株的持续扩散。本课题把目前出现具有代表性IncHI型质粒进行整理,重新定义划分标准,添加至5个亚型;精细分析呈现了多药耐药IncHI型质粒的特征性及多样性,揭示IncHI型质粒是临床分离菌多药耐药特征的重要载体,为肠杆菌科细菌性感染疾病的治疗提供分子依据,为临床上多药耐药肠杆菌科细菌的传播提供研究依据,以期预防或延缓细菌耐药发展的趋势。(本文来源于《南方医科大学》期刊2017-05-12）
蒋晓圆[5]（2017）在《携带bla_(IMP)和1型整合子的多个IncN2型质粒的测序和比较基因组学分析》一文中研究指出碳青霉烯类抗生素是一类具有广谱抗菌活性的抗生素。它是治疗革兰阴性菌感染,特别是肠杆菌科菌的强效药物。近年来,耐碳青霉烯类抗生素的菌株逐渐增多,严重危及公众健康,已引发全球性关注。碳青霉烯酶可以水解碳青霉烯类抗生素。按照Ambler分类法,碳青霉烯酶可以分为A、B、D叁类。其中A类和D类酶均为丝氨酸酶,B类为金属酶。产碳青霉烯酶是菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因之一。本研究的主要目的是探索叁个产IMP临床分离株耐药的分子机制。前期我们收集了大量菌株,通过各项基础筛查,最终选定3株深入研究:肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285。0801和7121(来自中国人民解放军307医院)分别分离自不同病人的血液和痰液标本,17285(来自安徽医科大学第一附属医院)分离自中段尿标本。菌株的菌种通过16S rRNA进行鉴定,PCR检测相应的耐药基因类型,碳青霉烯酶类型通过改良Carba NP法进行检测,利用VITEK 2仪器测定菌株的抗生素敏感性,接合转移实验得到相应的接合子,进而验证质粒是否具有可转移性,用Qiagen大提试剂盒从接合子中提取质粒DNA,构建mate-pair文库,通过Miseq仪器完成测序。肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285均产IMP型碳青霉烯酶,blaIMP分别位于质粒p0801-IMP(登录号:KT345947)、p7121-IMP(登录号:KX784502)和p17285-IMP(登录号:KX784503)上。这叁个质粒均为接合型质粒,通过接合转移实验分别获得接合子0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600。0801和7121携带的耐药基因均为blaIMP、blaTEM、和blaCTX-M-1group,17285携带的耐药基因为blaIMP、blaTEM。0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600均仅含blaIMP。上述的所有野生株和接合子都产B类碳青霉烯酶,均对头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南耐药。0801、7121和17285对庆大霉素耐药,其他菌株均表现为敏感。所有菌株均对阿米卡星表现为敏感。p0801-IMP、p7121-IMP和p17285-IMP是首次完成全序测定的携带blaIMP的IncN2型质粒。本研究纳入分析的质粒共6个,Inc N2型质粒的参考质粒pYNKP001-NDM,和5个包含1型整合子的IncN2型质粒(p0801-IMP、p7121-IMP、p17285-IMP、pJIE137和p34983-59.134kb)。比较基因组学分析显示,这6个质粒均可分为骨架区和外源插入区两大模块。其中5个包含1型整合子的IncN2型质粒外源插入区的移动元件有:整合子In1223(p0801-IMP/p7121-IMP)、整合子In655(p17285-IMP)、整合子In27(pJIE137)、整合子In1130(p34983-59.134kb)、ISEcp1-orfRA1-14转座单元(p17285-IMP)、ISEcp1-blaCTX-M-62-Δorf477-orfRA1-14转座单元(pJIE137)和新型Tn1696相关转座子Tn6325(p34983-59.134kb)。In1223和In655均为Tn402-like 1型整合子,In27和In1130为复合型1型整合子。IncN2型质粒通常会整合不同类型的移动元件,这些元件往往会携带耐药基因,多种耐药基因的共存势必会加速菌株的扩散及进化,所以医务工作者和相关部门应提高对耐药菌株传播的防控意识,规范临床抗生素的应用,预防或减缓耐药现象发生趋势。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2017-03-01）
张峣[6]（2016）在《牛副流感病毒3型全基因组测序及反向遗传质粒系统建立》一文中研究指出牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza-3 virus,BPIV3)隶属于副黏病毒科呼吸道病毒属。BPIV3是牛呼吸道综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)的主要病原,大多数牛感染BPIV3会表现出急性临床症状,对舍饲育肥牛的危害极大,全球的养牛业因此蒙受重大的经济损失。截至目前,BPIV3已报道3种基因型,即A、B及C型,在世界范围内的多个地区均有这3种基因型毒株的分离报道。对我国BPIV3流行病学调查表明,该病毒已在我国广泛流行,黑龙江、山东和内蒙古自治区等地亦有该病毒的分离报道,已进行基因鉴定毒株的基因型主要为A型及C型。本研究对2014年分离于宁夏地区的一株BPIV3毒株进行全基因组测序并进行同源性及进化树分析,参考GenBank上标准序列设计5对引物,覆盖病毒基因组全长。将RT-PCR产物连接于pMD®18-T载体后转化至大肠埃希菌,将阳性质粒进行核苷酸测序,测序结果通过分子生物学软件进行拼接,并与GenBank上参考序列进行比较及构建进化树。结果表明,分离毒株为C基因型牛副流感病毒3型,命名为NX49。NX49株全基因组长为15474bp,提交到GenBank的序列号为KT071671。理化分析结果表明,NX49毒株对高温、酸及脂溶剂均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝实验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应;第6代病毒的滴度约为108.0TCID50/m L。同源性分析结果表明,NX49与中国山东C型分离株SD0835具有最高的同源性,为99.3%;与中国内蒙古A型分离株NM09的同源性为82.5%;与澳大利亚B型分离株Q5592的同源性为81.4%。NX49与SD0835同属一个进化分枝,但由于地域及时间上的不同可能造成他们之间在基因水平上存在差异。另外,本研究以BPIV3标准毒株BN-1为亲本构建BPIV3反向遗传质粒系统,利用RT-PCR方法分段扩增BPIV3全基因组序列,利用合适的酶切位点将各片段克隆至真核表达载体pCI-neo并分别在病毒基因组的3ˊ及5ˊ端添加锤头状核酶(HamRz)与丁肝病毒核酶(HdvRz)序列。以构建的全长质粒为模板扩增用于构建辅助质粒的N、P及L全长编码基因同时在上游引物启动子前引入可提高转录效率的Kozak序列并将各基因克隆至真核表达载体pCI-neo。将构建的辅助质粒转染MDBK细胞并进行RT-PCR及免疫荧光鉴定。结果表明,成功构建基于CMV启动子的BN-1全基因组克隆及辅助质粒且辅助质粒可在MDBK细胞中正常转录表达。本研究将为BPIV3基因功能研究及活载体疫苗构建奠定基础。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2016-06-01）
杨羚,唐海玲,陈定强,裘宇容[7]（2016）在《肺炎克雷伯菌质粒pNDM-LJ的高通量测序分析》一文中研究指出目的:通过对肺炎克雷伯菌质粒pNDM-LJ的高通量测序分析,研究其与肺炎克雷伯菌耐药的相关性。方法:利用Illumina Miseq高通量测序平台进行测序,然后用Edena软件拼接测序数据,再利用RAST网上工具将拼接得到的contigs进行注释,并用BLAST网上工具进行分析。结果:pNDM-LJ为54 kb大小的环状质粒,GC含量约为49%,预测编码52个功能基因,在不相容群分类中属于Inc X3群质粒。该质粒与已知的Inc X质粒序列有较高的相似性,blaNDM-1基因所在的基因环境比较复杂,推测其是由多个转座事件共同构建的。在pNDM-LJ中,blaNDM-1基因的5′端和3′端分别与ISAba125和IS26两种插入序列相连,形成大小约为10.8 kb的转座子样结构。结论:pNDM-LJ质粒携带碳青霉烯类耐药基因blaNDM-1,可能对我国的广泛传播blaNDM-1基因发挥重要作用。(本文来源于《实用医学杂志》期刊2016年05期）
罗穗豫,李华[8]（2014）在《盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA_(△N59)的构建及测序分析》一文中研究指出目的构建盆腔炎患者感染大肠埃希菌重组质粒pGEX-SrtA△N59并进行测序鉴定,为寻找盆腔炎患者感染大肠埃希菌的治疗新方法和新药研发奠定基础。方法分别提取pMD20-SrtA和pGEX-4T-1质粒并进行鉴定。然后根据SrtA基因序列来设计特异性引物,以pMD20-SrtA为模板进行SrtA△N59基因PCR扩增。将目的片段克隆至pGEX-4T-1中,构建pGEX-SrtA△N59重组质粒,进行酶切和测序分析。结果 pMD20-SrtA酶切目的基因片段约为618bp,与预期SrtA基因片段大小相符合,可作为模板扩增SrtA△N59。pGEX-4T-1经单、双酶切均获得5 000bp片段,大小与预期值(4 900bp)相符合,该质粒可应用于构建重组质粒。PCR扩增产物约460bp,与SrtA△N59基因的大小符合。构建的pGEX-SrtA△N59重组质粒经双酶切,获得460bp目的基因片段,表明SrtA△N59基因成功插到载体pGEX-4T-1中;基因测序显示,其与AF162687基因序列100%匹配。SrtA△N59基因大小应为441bp,但本实验设计引物时在其两端分别加有酶切位点以及保护性基团,所以所得扩增产物的目的片段大小约为460bp。结论构建的pGEX-SrtA△N59中成功插入SrtA基因,重组质粒构建正确。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2014年09期）
田新莉,钟莉,覃重军[9]（2014）在《拟诺卡氏菌线型质粒pNPL1的测序和分析》一文中研究指出【目的】检测和分析稀有放线菌中新的线型质粒。【方法】从植物内生菌中分离链霉菌之外的放线菌菌株,检测、测序和分析线型质粒。【结果】从中草药植物紫花前胡的叶片中分离到一株内生放线菌25L-1-1c,经过16S rRNA基因序列比对属于拟诺卡氏菌。从该菌株中检测到一个约25 kb的线型质粒pNPL1。克隆和测序了pNPL1新的端粒,含有多个小的回文序列。测序获得全长为24 621 bp的线型质粒pNPL1,预测编码22个基因,其中2个基因与链霉菌质粒的端粒复制基因同源,1个基因与链霉菌质粒主要的接合转移基因相似,其余19个基因为未知功能。携带pNPL1端粒复制基因的质粒不能转化变铅青链霉菌,暗示需要发展拟诺卡氏菌的遗传操作系统。【结论】这是首次在拟诺卡氏菌中发现和描述线型质粒。(本文来源于《微生物学通报》期刊2014年07期）
朱颖旻,许铭翾,沈美娟,陈振华,覃重军[10]（2010）在《红球菌线型质粒pNSL1的克隆、测序和复制区的鉴定》一文中研究指出从红球菌NS1中检测到两个线型质粒pNSL1和pNSL2。【目的】克隆、测序和分析pNSL1,并鉴定质粒的复制区。【方法】利用脉冲电泳方法从凝胶中回收大量的质粒DNA,进行鸟枪法克隆、测序和拼接,通过生物信息学分析和实验证明质粒的自主复制区。【结果】克隆、测序和拼接获得pNSL1全长为117252bp的序列,包括在红球菌中保守的1282bp端粒的序列。序列预测含有103个蛋白编码区,包括质粒的复制、分配、转移等功能基因。将pNSL1中一个与分枝杆菌质粒的复制基因同源的pNSL1.038及其上游的767bp非编码序列克隆到大肠杆菌质粒,电击转化珊瑚诺卡氏菌4.1037,获得了抗性转化子。【结论】克隆、测序了全长的线型质粒pNSL1,鉴定了质粒的复制区。(本文来源于《微生物学报》期刊2010年08期）
质粒测序论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
随着抗生素的滥用,多重耐药菌株逐渐增多,严重影响感染性疾病的治疗。细菌染色体上的耐药基因可以在很多种类的移动元件的作用下整合到质粒上,而质粒可以通过细菌间性菌毛的接触在不同菌种间进行传播。故明确多重耐药质粒中耐药基因、移动元件,阐明耐药分子遗传特征十分重要。本文针对临床分离的多重耐药菌株,对质粒介导多重耐药的机制进行探索研究,具体分为两个部分:(1)含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析;(2)IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tetA的测序和比较基因组学分析。含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他携带bla_(NDM)的IncN1型质粒的结构基因组学分析大肠杆菌BTR于2013年分离自北京同仁医院一名患者的尿液样本。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)进行多位点序列分型。进行质粒接合转移实验。为了验证bla_(NDM-1)在相关菌株中是否表达,通过改良Carba NP法检测菌株是否产碳青霉烯酶及其类型。通过微量肉汤稀释法检测药物敏感性。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取细菌基因组,使用“鸟枪法”构建全基因组文库,并在Ion PGM测序平台上进行高通量测序。通过多位点序列分型,大肠杆菌BTR属于序列型405,并且通过PCR筛查检测到bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、qnrS1、qnrD、erm(B)和mph(A)耐药基因的存在。bla_(NDM-1)和qnrS1基因可以通过接合转移方式从菌株BTR共转移到大肠杆菌EC600,产生接合子BTR-NDM-EC600,证明这两个耐药基因位于同一个质粒上,该质粒被命名为pNDM-BTR。菌株BTR和接合子BTR-NDM-EC600都产B类碳青霉烯酶,并且都对氨苄西林、头孢唑林、头孢呋新、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑和环丙沙星耐药,但都对替加环素、呋喃妥因、磷霉素和多粘菌素敏感。此外,菌株BTR还对氨曲南、氯霉素、阿奇霉素、庆大霉素和四环素耐药。本部分研究共纳入分析6个质粒,即IncN1型质粒的参考质粒R46、所有全测序且携带bla_(NDM)的IncN1型质粒(p LK78、p LK75、pEcNDM1和pNDM-BTR)以及与pNDM-BTR具有最高覆盖度和一致性的近源质粒pMR3-OXA181。每一个质粒的结构都可以分为保守的IncN1型骨架区和一些外源插入区。保守的IncN1型骨架区包括了repA和它的iterons、stbABC–orfD操纵子、保守上游重复控制调节子区以及kikA、resP、korB和tra基因。在六个质粒骨架区不同位点整合了很多外源插入区。R46包括一个多重耐药区,其由1型整合子In1、ΔTn6309、砷抗性座位arsRDABC–orf378、orf657和IS26组成。质粒p LK78、pLK75、pEcNDM1和pMR3-OXA181均包括了两个外源插入区:pLK78包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1021、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pLK75包括In1021-5’和一个由IS1X2、ecoRII–ecoRIImet、In1021-3’和Tn1721残余组成的多重耐药区;pEcNDM1包括Tn1721残余和一个由1型整合子In1007、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的多重耐药区;pMR3-OXA181包括Tn3家族新的转座子Tn6361和由1型整合子In191、ecoRII–ecoRIImet和ΔIS1X2组成的dfrA14区。pNDM-BTR包括叁个外源插入区,即IS26、dfrA14区和Tn3家族新的转座子Tn6360。本部分研究为耐药基因在IncN1型质粒间通过移动元件进行水平转移、IncN1型质粒的多样化和进化(特别是携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒)提供了更深入的理解,对携带bla_(NDM)基因的IncN1型质粒的流行病学研究提供了理论依据。IncFIB家族多重耐药质粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tet A的测序和比较基因组学分析肺炎克雷伯菌A1705于2013年分离自沈阳盛京医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌911021于2014年分离自重庆医科大学第一附属医院一名患者的尿液样本。肺炎克雷伯菌1642于2014年分离自北京307医院一名患者的肺泡灌洗液。通过VITEK-2自动系统和16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。对主要的ESBLs基因、碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内酯类耐药基因和常见的四环素耐药基因进行PCR筛查。使用七个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)进行多位点序列分型。使用QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒提取质粒,进行质粒电转化实验。通过VITEK-2自动系统检测药物敏感性。使用Qiagen Blood&Cell Culture DNA Maxi Kit提取细菌基因组DNA。针对菌株1642,构建了平均长度为5k的Nextera Mate Pair大片段文库,并在Illumina MiSeq测序平台上进行高通量测序。针对菌株A1705和911021,在基于单分子实时测序技术的PacBio RSII测序平台上进行测序。通过多位点序列分型,表明菌株A1705和911021分别属于序列型449和11,而菌株1642代表了一个新的序列型2040。通过PCR筛查,表明肺炎克雷伯菌A1705携带bla_(KPC-2)、bla_(NDM-1)、bla_(OXA-1)、qnrS1、oqxAB、tetA(A)、tetA(D)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(TEM-1)和bla_(SHV-33)耐药基因;肺炎克雷伯菌911021携带bla_(KPC-2)、qnrS1、oqxAB、mph(A)、tetA(A)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-11)和bla_(TEM-1)耐药基因;肺炎克雷伯菌1642携带bla_(KPC-2)、qnrS1、mph(A)、tetA(A)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-12)和bla_(CTX-M-14)耐药基因。菌株A1705、911021和1642中的qnrS1、tetA(A)和bla_(CTXM-14)基因均可以通过电转化方式共转移到大肠杆菌DH5α,产生电转子A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α,证明这些耐药基因分别位于同一个质粒上,质粒被分别命名为pA1705-qnrS、911021-tetA和1642-tetA。菌株A1705、911021和1642及其各自的电转子,即A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α都对氨苄西林、复方新诺明、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢曲松和庆大霉素耐药,菌株A1705、911021和1642还对头孢替坦、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、呋喃妥因耐药。此外,菌株911021和1642对阿米卡星耐药,但是菌株A1705对阿米卡星敏感。本部分研究中共纳入分析8个质粒,即参考质粒pKPN-c22(首次完整测序的含有基因repA和repB1的质粒)、pA1705-qnrS、p911021-tetA、p1642-tetA以及携带基因repA和rep B1且和各质粒具有最高覆盖度和一致性的四个的质粒,即pKPN3-307_typeA、pKPN3-307_TypeC、p6234-198.371kb和pKPSH11。每一个质粒的结构都可以分为骨架区和大量的外源插入区。主要的骨架区基因包括repA和repB1、umuCD、parAB以及parB的附着位点parC、finO和一系列F型接合转移基因,包括rlx、dtr、cpl、sfx、eex、tivF(tivF1到tivF16、tivF18和tivF19)、traJQ和trbEF。在八个质粒骨架区不同位点存在许多不同的外源插入区,尤其是在骨架区orf312和repB1之间存在一个巨大的外源插入区。该外源插入区内包括了一个或两个多重耐药区。质粒pKPN-c22、pKPSH11、p6234-198.371kb、pKPN3-307_TypeC、pKPN3-307_typeA、p911021-tetA和p1642-tetA都含有一个多重耐药区,而质粒pA1705-qnrS含有两个多重耐药区。各质粒的多重耐药区又由很多的移动元件组成,比如插入序列、整合子、转座子和转座单元。本部分研究为耐药基因在Inc FIB家族质粒间通过移动元件进行水平转移提供了更深入的理解。此外,为临床多重耐药肠杆菌科细菌,特别是多重耐药肺炎克雷伯菌的传播提供研究依据。总结本研究分别对两类多重耐药质粒进行了系统且全面的描述,包括复制起始基因、骨架区和外源插入区,耐药基因和移动元件,从而阐明了由多重耐药质粒介导的耐药机制,可为多重耐药菌的研究与防控提供理论支持。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
质粒测序论文参考文献
[1].蒋昭芳,赵亚超,李曼莉,周冬生,朱天川.肺炎克雷伯菌质粒p1512-KPC的测序及比较基因组学分析[J].微生物学报.2019
[2].赵亚超.IncN1和IncFIB多重耐药质粒的测序及结构基因组学分析[D].军事科学院.2018
[3].黄丽燕,陈定强,唐海玲,吴爱武.肺炎克雷伯菌质粒pIMP26_DQ49的高通量测序分析[J].广东医学.2018
[4].梁权辉.多药耐药IncHI2型和IncHI5型质粒的测序及比较基因组学分析[D].南方医科大学.2017
[5].蒋晓圆.携带bla_(IMP)和1型整合子的多个IncN2型质粒的测序和比较基因组学分析[D].安徽医科大学.2017
[6].张峣.牛副流感病毒3型全基因组测序及反向遗传质粒系统建立[D].黑龙江八一农垦大学.2016
[7].杨羚,唐海玲,陈定强,裘宇容.肺炎克雷伯菌质粒pNDM-LJ的高通量测序分析[J].实用医学杂志.2016
[8].罗穗豫,李华.盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA_(△N59)的构建及测序分析[J].中国病原生物学杂志.2014
[9].田新莉,钟莉,覃重军.拟诺卡氏菌线型质粒pNPL1的测序和分析[J].微生物学通报.2014
[10].朱颖旻,许铭翾,沈美娟,陈振华,覃重军.红球菌线型质粒pNSL1的克隆、测序和复制区的鉴定[J].微生物学报.2010