导读:本文包含了血清型型论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:苯那普利,高血压,左室肥厚,前胶原
血清型型论文文献综述
艾丽娜[1]（2011）在《苯那普利对高血压病左室肥厚患者血清Ⅲ型Ⅳ型前胶原浓度变化的影响》一文中研究指出目的探讨苯那普利对高血压患者血清Ⅲ型Ⅳ型前胶原浓度变化的影响。方法收集高血压左室肥厚患者53例作为治疗组,健康者24例作为对照组。治疗组患者给予口服苯那普利治疗,对照组不给予任何药物。观察治疗组治疗前血清Ⅲ型Ⅳ型前胶原浓度变化,并与对照组进行比对。观察治疗组治疗前后LVDd,IVST,LVPW和LVMI的改变。结果治疗组治疗前血清PⅢP,PⅣP水平显着高于治疗后和对照组(P<0.05),治疗组患者治疗后LVDd,IVST,LVPW和LVMI均显着小于治疗前(P<0.05)。结论苯那普利可减少PⅢP,PⅣP的血清水平,以减少心肌间质水肿,苯那普利可逆转左室腔扩张,左心室肥厚。(本文来源于《大家健康(学术版)》期刊2011年14期）
Rushma,Shrestha[2]（2007）在《沙眼衣原体E血清型Ⅲ型分泌系统copN基因重组子建立表达和蛋白鉴定》一文中研究指出衣原体(Chlamydia)是一类有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，具有以下特点：(1)革兰氏阴性，圆形或椭圆形体：(2)具有DNA和RNA两种类型的核酸：(3)衣原体以两种形态存在。一种是小而致密的EB(elementary body，原体)，代谢不活跃，有感染性；另一种是大而疏松的RB(reticulate body，网状体)，代谢活跃，能复制生长，无感染性。衣原体的感染从感染性的原体吸附到宿主细胞表面开始，随后通过胞饮作用进入上皮细胞，原体增大并分化为网状体，网状体以二分裂方式增殖，产生子代原体，感染细胞内形成了含有网状体和子代原体的空泡即包涵体。大量的原体随着感染细胞的破裂涌出细胞外，再侵入新的细胞。(4)细胞壁成份中含有肽聚糖；(5)含有核蛋白体；(6)对多种抗生素都敏感。衣原体广泛寄生于包括人类在内的哺乳动物及鸟类。目前已知衣原体可分为四个种属：沙衣眼原体(Chlamydia trachomatis, C. t)、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体及家畜衣原体。C.t包括3个生物亚种：沙眼亚种、性病淋巴肉芽肿亚种、鼠亚种，前两种引起人类疾患。C.t依据其主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)抗原性的不同分为19个血清型，其中L1、L2、L2a和L3型引起性病淋巴肉芽肿(lymphogranuloma venereum, LGV)；A、B、Ba和C型引起沙眼，是全球致盲的首要原因；D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K及基因变种Ja型引起泌尿生殖道感染，是目前国内外最常见的性传播疾病之一。肺炎衣原体感染不仅与呼吸系统感染有关，可导致衣原体肺炎、咽炎，而且与动脉粥样硬化、冠心病的发病相关。因此，预防和控制衣原体感染已成为重要的公共卫生问题。然而到目前为止衣原体的致病机理仍不完全清楚。Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system，TTSS)是一种独立的分泌蛋白的系统。很多革兰氏阴性动植物病原菌都将其产生的致病性蛋白通过TTSS送入动、植物细胞胞质。这些蛋白与真核细胞信号传导因子很相似，可以改变信号传导的方向使宿主免疫反应减弱，细胞骨架重组，建立适于寄生和发挥致病作用的亚细胞小环境。作为专性细胞内寄生菌的衣原体也具有TTSS。从在上世纪70年代开始包括日本Matsumoto在内的很多研究人员发表了衣原体表面的电镜照片：一些凸起从衣原体外膜伸出，象“圆花饰”样，而且在原体和网状体表面均存在。而且这些凸起与其它细菌的Ⅲ型分泌结构相似。在基因检测中，首先在鹦鹉热衣原体基因中发现了与Ⅲ型分泌系统基因同源的部分，Hsia在1997年首次提出了四个基因与Ⅲ型分泌结构的结构基因和调节基因具有同源性。随后，在有关衣原体基因组的工作中发现：衣原体基因组中的结构基因和调节基因与其它具有Ⅲ型分泌系统的病原体编码的Ⅲ型分泌系统的基因有很高的同源性。而且，衣原体编码的Inc(inclusion，包涵体)蛋白家族可以被异种Ⅲ型分泌结构分泌。这些都为衣原体具有Ⅲ型分泌系统提供了依据。基于目前对于其它细菌Ⅲ型分泌系统的了解，人们建立了衣原体Ⅲ型分泌系统的模型。衣原体Ⅲ型分泌结构是一个连续的横跨衣原体内膜和外膜的分泌孔道。CT089(CopN，Cop：Chlamydia outer protein衣原体外膜蛋白)是衣原体Ⅲ型分泌系统的重要组成部分，它是外在膜蛋白(外周膜蛋白)，象”盖子”一样起调节作用，当无宿主感应信号时阻止蛋白的分泌。Hackstadt等用CopN蛋白的特异性抗体进行免疫印记分析，发现CopN蛋白不仅存在于原体、网状体，而且在感染衣原体20小时后细胞培养的提取物中也检测到CopN蛋白的存在。标记CopN蛋白特异性抗体用直接免疫荧光分析衣原体感染20小时后的单层细胞显示特异性的标记呈小环状附于衣原体包涵体的膜上，而且突出于表面。基于这些观察结果，说明CopN蛋白可以：①直接和衣原体相连；②结合于衣原体包涵体的膜；③可以被分泌。虽然人们对CopN蛋白的功能及如何作用知之甚少，但根据CopN蛋白与耶尔森菌的YopN分泌蛋白同源，CopN蛋白应该象YopN蛋白一样，在无宿主信号诱导时起调节作用阻止分泌。而一旦分泌被激活时，胞内的分子伴侣CT088(Scc1)、cr576和CT862可以协助分泌Ⅲ型分泌系统的底物。另外CopN蛋白可能通过宿主细胞接触而激活，从而调节原核细胞的信号传导为其形成早期的包涵体奠定基础，并抑制宿主细胞调亡。目的运用分子生物学方法构建copN-pTrcHisA重组子，E.coli BL21原核表达CopN蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blotting检测CopN蛋白的表达，为进一步研究CopN蛋白的功能和Ⅲ型分泌系统的作用机制，阐明衣原体的致病机理奠定基础。方法实验的大体流程如下：1碱裂解法提取质粒(1)取-20℃保存的含有质粒的E.coli DH5α解冻后吸取100μl菌液接种到LB琼脂平板上(并加入相应含耐药基因的抗生素)，37℃温箱中培养过夜。(2)挑取单菌落接种到3ml LB液态培养基中(并加入相应含耐药基因的抗生素)，把培养试管放到水浴振荡器中，37℃，100转／分，振荡培养12小时。(3)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用低温离心机于4℃以12000g离心30秒，弃上清。(4)加1 mlSTE，悬浮菌体，4℃以12000g离心30秒，弃上清。(5)重复步骤(2)，使细菌沉淀尽可能干燥。(6)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。(7)加200μl新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上3分钟。(8)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒钟使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，将管置于冰上3～5分钟。(9)用低温离心机于4℃以12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。(10)加等体积酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用低温离心机于4℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一新的离心管中。(11)用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA，振荡混合后于室温放置2分钟。(12)用低温离心机于4℃以12000g离心5分钟。弃去上清液。(13)用1ml70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，弃净上清，在空气中使核酸沉淀干燥30分钟。(14)加50μl的用灭菌双蒸水配置的RNA酶(20μg／ml)，以溶解已干燥的DNA沉淀。(15)取5μl质粒溶液，用1％琼脂糖凝胶5v／cm电泳，约40分钟，在紫外线透射反射分析仪下观察结果。2制备C.t的Copn基因：2．1获取C.t E型标准株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。(1)按如下成分配制裂解液：50mMKC1，2.5mM MgCl_2，10mM Tis-HCl(PH8.3)，0.1g／L明胶，0.45％NP-40，0.45％吐温20，200mg／L蛋白酶K。(2)取200μl细胞培养标准菌株液放入1.5ml Eppendorf管中，12000r／min，离心20min，弃上清。(3)沉淀中加入50μl裂解液，振荡混匀后，放入55℃水浴中1小时。(4)加50μl Tris饱和酚，颠倒Eppendorf管，使内容物混合成乳状，蛋白质变性。12000r／min，4℃离心5min，混合物分为两相，上层是清澈透明的水相，下层是酚相。(5)吸取水相至新的Eppendorf管，加入等体积的酚／氯仿(体积比1：1)，颠倒Eppendorf管数次，混匀内容物。(6) 12000r／min，4℃离心5min，吸取上层水相至新的Eppendorf管。(7)加1／25体积的5M氯化钠，混合均匀，再加2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后放置冰上20min，沉淀DNA。(8) 12000r／min，4℃离心10min。(9)倒弃乙醇，Eppendorf管倒置于干燥滤纸上，室温蒸发痕量乙醇。(10)加入20μl无菌双蒸水，溶解DNA，—20℃储存备用。另一种获取基因组DNA的方法是只裂解不提纯DNA，在步骤(3)后，沸水浴15min灭活蛋白酶K后离心3min，取含有DNA的上清液，做PCR扩增的DNA模板，此方法省去DNA提纯步骤，减少提纯过程中的DNA损失。2．2 PCR扩增方法筛选C.t阳性临床标本：根据文献报道选择C.t质粒的特异性引物(上游引物KL1-5’TCCGGAGCGAGTTACGAAGA 3’；下游引物KL2-5’AATCAATGCCCGGGATTGGT 3’)，过程为灭菌双蒸水→Buffer→dNTPmix→上游引物KL1→下游引物KL2→模板DNA→Taq DNA聚合酶的顺序加样，混匀后，短暂离心，加入30μl液体石蜡封闭反应体系，以上操作均在冰盒中进行，最后移入PCR扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃后延伸10分钟，使反应完全。用1％琼脂糖凝胶电泳进行结果判定，但对于某些标本效果不佳，所以选取不易判读的标本，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行结果判定。2．3 PCR扩增C.t的CopN基因：将筛选出的C.t阳性的标本作为模板，用带有限制性核酸内切酶识别位点的CopN基因特异性引物，以PCR的方法扩增C.t的CopN基因，以获得大量用于基因重组的目的基因。采用的引物是文献中报道的C.t的CopN基因的特异性引物。这对引物根据Genebank中提供的C.t的L2血清型CopN基因序列设计，引物由上海博亚公司合成，序列如下：上游引物1：5’-AAACCGCTCGAGGACTGCATCAGGAGGAGCTGGAGGG-3’其中划线部分为限制性核酸内切酶XhoI识别位点，AAACCG为保护性碱基，GAC与起始密码子ATG相互补。下游引物2：5’-TCCGGAATTCTTAGGGTGATGGAGG CTGTG TTGAGGTAGG-3’其中划线部分为限制性核酸内切酶EcoRI识别位点，TCCG为保护性碱基。TTA与终止密码子TAA相互补。NO1、NO2引物扩增的基因片段全长1288bp，其中包括CopN基因1266bp，两个限制性核酸内切酶识别位点共12bp，保护性碱基共10bp。扩增条件为94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，62／63℃退火50秒，72℃延伸80秒，35个循环；72℃后延伸10分钟，使反应完全。取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，判断结果。3重组子的建立3．1载体质粒pTrcHisA与CopN克隆基因的双酶切和回收：我们选择XhoI和EcoRI做为限制性核酸内切酶，两种酶的识别序列及切割方式如下：用限制性核酸内切酶切割质粒的XhoI和EcoRI识别位点，使闭合环状的双链质粒DNA分子打开呈线状，并产生粘性末端。按照灭菌双蒸水→10×NEBuffer→100×BSA→质粒→XhoI→EcoRl的加样顺序在冰中完成操作，吹打混匀，短暂离心5秒，移入预热的恒温水浴箱中，37℃水浴1小时。用同样的方法对CopN克隆基因进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。分别回收质粒和目的基因酶切后的产物，方法如下：(1)在紫外灯下切下有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶质量，该重量作为一个凝胶体积，如100mg=100μl体积。(2)根据凝胶浓度，所用均为1％琼脂糖凝胶应加3个凝胶体积DE-A溶液。混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全熔化(约6-8分钟)。(3)加1.5个凝胶体积的DE-B溶液，混合均匀。(4)吸取(3)中的混合溶液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，3600rpm，离心1分钟。若液体残留，加大离心转数1分钟。(5)吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次，3600rpm，离心1分钟。(6)将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm，离心30s，弃滤液。(7)将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm，离心30s，弃滤液。(8)重复步骤(7)(9)将制备管置于离心管中，12000rpm离心1分钟，净弃W2溶液。(10)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。3．2连接和转化3．2．1 CopN基因与载体质粒的连接将酶切后回收的CopN基因与载体质粒按接近10：1的分子比率混合，在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应，组建含CopN重组子。反应条件为16℃16小时，再放入4℃冷藏24～48小时使反应完全，反应总体系为25μl，其中质粒1μl，CopN基因19.5μl，10×L Buffer2.5μl，T4 DNA连接酶1μl(350u)，补足灭菌双蒸水至25μl。3．2．2氯化钙法制备感受态E.coli DH5α(1)取-20℃保存的E.coli DH5α，接种于LB琼脂平板，放置37℃温箱中过夜培养。次日挑取单菌落接种到3ml LB液态培养基中，37℃，150rpm，摇菌过夜培养。(2)取1ml菌液接种于14ml LB液态培养基中，37℃，150rpm，振荡培养约2.5h，至OD260=0.6时，此时E.coli的浓度约为5×10~7／ml。将菌液平均倒入3个5ml Eppendorf管中，冰浴30min。4℃4000rpm离心10min收集菌体，弃净上清。(3)菌体悬浮于1ml冰预冷的100mmol／L CaCl_2中，冰上孵育10min，4℃，4000rpm离心10min收集菌体，弃净上清。(4)菌体重新悬浮于0.2ml冰预冷的100mmol／L CaCl_2中，混合均匀，4℃放置12～24h。(5)向200μl感受态E.coli DH5α中加上述连接产物10μl(约40ng)，混匀，冰上孵育30min。此步骤设立两个对照组：阳性对照，取10μl(约40ng)pTrcHisA质粒转化感受态E.coli；阴性对照，不加质粒，代以10μl蒸馏水转化感受态E.coli。(6)放置42℃水浴中，热休克90s，再迅速置于冰上2min，然后每管加LB培养液800μl，37℃，培养1.5h。(7)取200μl菌液均匀接种到含氨苄青霉素(100μg／ml)的LB固态培养皿上，倒置平皿，37℃，培养16h，观察菌落生长情况，转化成功的平皿于4℃保存。3．2．3连接产物转化至E.coli DH5α本实验借助热休克将重组子导入处于感受态的E.coli DH5α。具体步骤如下：向200μl感受态E.coli DH5α中加含CopN重组子10μl(约40ng)，混匀，冰上孵育30m。此步骤设立两个对照组：阳性对照，取10μl(约40ng)载体质粒(相应未重组的质粒)转化至感受态E.coli DH5α；阴性对照，不加质粒，代以10μl灭菌双蒸水转化至感受态E.coli DH5α。(1)放置42℃水浴中，热休克90s。(2)迅速置于冰上2m。(3)每管加LB培养液800μl，37℃，培养1.5小时，使细菌复苏，并表达重组质粒编码的Amp抗性标记基因。4阳性重组子的筛选和鉴定4．1抗生素平板筛选法：E.coli DH5α本身无氨苄青霉素抗药性，接种到含氨苄青霉素的琼脂培养板上后，不能存活。而pTrcHisA质粒基因中含有氨苄青霉素抗性基因，所以转化有重组子CopN-pTrcHisA的E.coli DH5α仍具有氨苄青霉素抗药性，能在含有氨苄青霉素的琼脂培养板上生长成单菌落。CopN-pTrcHisA重组子转化E.coli DH5α后，用抗生素平板筛选法，可以筛选已转化有质粒的E.coli DH5α。此外，pTrcHisA质粒在E.coli中具有高拷贝扩增的特性，随着菌体的繁殖，可以获得大量的重组子。除阳性重组子外，酶切不完全而自身环化的质粒载体也能转化E.coli DH5α，生长成单菌落，形成假阳性，本法只是阳性重组子的初步筛选。CopN-pTrcHisA重组子转化E.coli DH5α后，取200μl菌液接种于氨苄青霉素阳性的LB琼脂平板上。阳性对照平板接种200μl已转化pTrcHisA质粒的E.coli DH5α。阴性对照平板接种的200μl菌液，为灭菌双蒸水转化的E.coli DH5α。接种后，37℃温箱中培养16小时，观察菌落生长情况。4．2 PCR扩增方法筛选阳性重组子取数个LB琼脂平板上的DH5α单菌落，培养E.coli DH5α，提取质粒。以提取的质粒为DNA模板，用引物NO1、NO2扩增重组质粒CopN-pTrcHisA中的CopN基因，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定。需要注意PCR反应可能有假阳性存在，仍有必要作进一步鉴定。4．3重组子的酶切鉴定重组子CopN-pTrcHisA基因序列全长约5.7Kb，其中含有pTrcHisA质粒4.4Kb和CopN基因1266bp。提取的重组质粒用XhoI和EcoRI限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。4．4重组子的基因测序鉴定：选取上述方法证明转化成功的E.coli DH5α菌液800μl，送宝生物工程(大连)有限公司进行重组子基因的序列鉴定。5测序正确的重组子转化至蛋白表达菌E.coli BL21，方法同3．2．2。6沙眼衣原体E型Bour菌株CopN的诱导表达挑取成功转化CopN-pTrcHisA重组子的E.coli BL21单克隆菌落，加入到10ml液体带有氨苄青霉素抗性(Amp 50μg／mL)的LB培养基中，37℃摇菌过夜。将该菌液加入1000mlLB液态培养基中(Amp 50μg／mL)，同上培养2h，至对数生长期。加入IPTG(终浓度0.03mM)，继续摇菌2h。室温10000转／分，30秒离心收菌。得到5管湿菌沉淀，以冰浴TEN液洗涤2次(1／10体积洗涤)，加入溶菌酶(终浓度1mg／ml)、Triton-X 100(终浓度0.5％)冰上孵育15min。以49％振幅6秒12次超声碎菌。悬浊液4℃12000rpm离心20分，分离沉淀和上清液分别储存于—20℃冰箱以备分析。7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)灌胶前，应用洗衣粉或清洁液充分清洗灌胶玻璃板，并用无水乙醇冲洗贴胶面，最后用干净的纱布拭干。操作时应戴手套。安装好灌胶装置。(2)选择10％分离胶浓度。注意将胶充分混匀，TEMED先于AP加。灌好分离胶后，立即在其上加入蒸馏水封闭。静置20min。(3)配制4％积层胶。(4)分离胶凝固后，倾出上层蒸馏水，可用滤纸吸干。倒入积层胶，插入梳子，注意不要产生气泡。(5)待凝胶聚合完全后，在电泳槽中加入电泳缓冲液(注意胶的下面不要存在缓冲液的气泡)，小心移出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。(6)上样：将获得的样品从-20℃冰箱中取出，于37℃溶化。用微量加样器分别取15μl样品溶液和5μl 4×SDS加样缓冲液(终浓度为：0.0625mol／LTris-HCL、pH 6.8，2％SDS，10％甘油，5％2-巯基乙醇，0.001％溴酚蓝)加入0.2ml EP管中混匀。然后将含有蛋白和上样缓冲液的EP管放入恒温水浴锅中，在100℃条件下煮沸3分钟，使蛋白质变性。煮沸结束后按预定顺序加样，每孔加样品20ul。最后在所有不用的样品孔中加上等体积的4×SDS凝胶上样缓冲液。(7)积层胶电压稳定在80V，当溴酚蓝指示剂越过积层胶与分离胶的分界线后，将电压调整并稳定在120V直至溴酚蓝跑到胶底部(约1.5小时)。(8)切胶。上方切去浓缩胶部分，下方切去溴酚蓝以下部分。(9)考马斯亮蓝染色1h，脱色液洗3次，每次30min。8．Western blot方法检测CopN蛋白的表达(1) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，方法同7。(2)转膜：根据凝胶大小剪取4张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素，然后将滤纸、硝酸纤维素滤膜及凝胶于转移缓冲液中处理10min。同时将海绵浸于转移缓冲液中。按如下方法安装转移装置：阴极、一层海绵、两层滤纸、胶、PVDF、膜、两层滤纸、一层海绵、一层海绵，将气泡赶净(主要是胶和膜之间的气泡)。(3)将硝酸纤维素膜放入可热密封的塑料袋，根据滤膜面积以0.1ml／cm~2的量加入封闭液，然后密闭袋口。平放在平缓摇动的摇摆平台上于室温下孵育1～2小时。(4)用封闭缓冲液按1∶800的比例稀释his-tag单抗，并于振荡器上混匀。(5)剪开塑料袋，弃去封闭液，立即在装有用上述方法处理过的硝酸纤维素滤膜的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加入用封闭液稀释的一抗，密封袋口，将滤膜平放在平缓摇动的摇摆平台上，于4℃孵育过夜。(6)滤膜完成后，戴手套从塑料袋中取出膜，放在塑料盒中摇动着用PBST洗3次，每次10～15min。(7)用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(二抗)，稀释二抗浓度至1∶1000。(8)将膜放进一新的可密封塑料袋，按滤膜面积0.1ml／cm2加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，在室温下持续摇动1～2h。(9)戴手套从塑料袋中取出滤膜，放在塑料盒中摇动着用PBST洗3次，每次10～15min。最后用PBS洗一次，时间为10～15min。(10)将表面带有抗原-抗体-抗抗体-HRP复合物的滤膜放在塑料盒中，加入配好的DAB显色试剂(按说明书操作)，于平缓摇床上进行显色定位至条带清晰为止，最后取出滤膜用蒸馏水洗2遍终止反应。(11)待印记膜在空气中自然干燥后，将其密封入塑料袋中保存。结果1碱裂解法提取质粒：用1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约4400bp可见清晰的质粒条带，证明pTrcHisA质粒提取成功。2制备C.t的Copn基因：2．2 PCR扩增方法筛选C.t阳性临床标本：1％琼脂糖凝胶电泳和8％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，在241bp的位置发现了一条清晰的条带，说明用衣原体质粒引物KL1、KL2扩增成功筛选C.t阳性的标本，并为下一步扩增CopN基因提供了模板DNA。在结果判定上，对于片断较小PCR产物(如衣原体质粒引物KL1、KL2扩增产物仅241bp)，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳效果更佳。2．3 PER扩增C.t的CopN基因：用1％琼脂糖凝胶电泳进行结果判定，在相当于Marker1000—1500bp间出现清晰特异性条带，引物N1、N2扩增C.tCopN基因成功。3重组子的建立3．1载体质粒pTrcHisA与CopN克隆基因的双酶切和回收：1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，与Marker相比较，酶切产物分别在4.4Kb(相当于Marker 3500-5500bp间)和近1.3Kb(相当于Marker1000-2000bp间)位置出现清晰特异性条带，提示酶切成功。3．2连接和转化重组子的抗生素琼脂平板筛选结果显示：阳性对照平板与实验平板都有菌落生长，且前者较后者菌落密集，阴性对照平板无菌落生长，提示重组子连接成功、转化成功。4阳性重组子的筛选和鉴定4．1抗生素平板筛选法：结果同3．2．24．2 PCR扩增方法筛选阳性重组子1％琼脂糖凝胶电泳结果，约1.3Kb处出现清晰特异的条带，提示CopN基因与pTrcHisA质粒连接成功，重组子CopN-pTrcHisA成功转化至E.coli DH5α。4．3重组子的酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示双酶切后CopN-pTrcHisA重组子分隔成4.4Kb(相当于Marker 3500-5500bp间)和近1.3Kb(相当于Marker1000-2000bp间)大小两个基因片段，证明CopN基因位于pTrcHisA质粒内，重组成功。4．4重组子的基因测序鉴定：测序结果与网上基因库CopN基因相比完全一致，证明重组入质粒的为CopN基因。5测序正确的重组子转化至蛋白表达菌E.coli BL21重组子的抗生素琼脂平板筛选结果显示：阳性对照平板与实验平板都有密集的菌落生长，阴性对照平板无菌落生长，提示重组子转化成功。6沙眼衣原体E型Bour菌株CopN的诱导表达聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可见重组菌在48KD处有一浓集条带，而空质粒菌并无浓集条带；Western blot结果也可见重组菌在约48KD附近有一条显色条带，而对照的空质粒菌则没有显色条带。两者均证明CopN的诱导表达成功。结论1．成功构建C.t E血清型的TTSS中CopN基因与pTrcHisA质粒的重组体CopN-pTrcHisA。2．本实验在构建CopN重组子的过程中摸索出适合本实验室的分子生物学方法，获得了经验。3．构建C.t E血清型CopN基因重组子，为下一步表达CopN蛋白及其功能的相关研究奠定了基础。4．通过IPTG诱导得到了较多的CopN蛋白。5．聚丙烯酰胺凝胶电泳和western blotting对蛋白进行了鉴定。CopN蛋白对Ⅲ型分泌系统的分泌蛋白起调节作用，对CopN蛋白的深入研究可能揭示Ⅲ型分泌系统的作用机制，阐明衣原体的致病机理。(本文来源于《天津医科大学》期刊2007-05-01）
王蕊,齐蔓莉,刘全忠[3]（2006）在《沙眼衣原体E血清型Ⅲ型分泌系统CopN基因的克隆》一文中研究指出沙眼衣原体(C．trachomatis,Ct)D～K血清型主要引起泌尿生殖道感染,其中E、D和F血清型是临床最常见的。本研究选取E血清型作为研究对象。Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system)是一种独立的分泌蛋白的系统。很多革兰阴性病原菌都将其产生的致病性蛋白通过Ⅲ型分泌系统送入细胞质而发挥毒性作用。这些蛋白与真核细胞信号传导因子很相似,可以改变信号传导的方向,使宿主免疫反应减弱,细胞骨架重组,建立适于寄生和发挥致病作用的亚细胞小环境。衣原体的Ⅲ型分泌系统由20多个蛋白形成一个连续的横跨衣原体内膜和外膜的分泌孔道,分泌蛋白可以从中通过。衣原体外膜蛋白N(Chlamydia outer protein N,CopN)是衣原体Ⅲ型分泌系统的重要组成部分,对Ⅲ型分泌系统分泌蛋白起调节作用。我们旨在构建Ct的E血清型CopN重组子,研究CopN蛋白的功能和Ⅲ型分泌系统的作用机制。(本文来源于《中华皮肤科杂志》期刊2006年05期）
孙桂芳,刘凤岐,孙萍,孙波[4]（2005）在《扩张型心肌病血清Ⅰ型、Ⅲ型前胶原水平与左室结构及收缩功能的关系》一文中研究指出目的研究扩张型心肌病(IDCM)血清Ⅰ型、Ⅲ型前胶原(PCⅠ、PCⅢ)水平与左室结构及收缩功能的关系。方法IDCM患者53例,健康人32例为对照组,应用放射免疫法测定血清PCⅠ、PCⅢ,应用超声心动仪测量左室结构指标及左室射血分数(LVEF)。分析IDCM血清PCⅠ、PCⅢ与左室结构指标、LVEF关系。结果IDCM组血清PCⅠ、PCⅢ高于对照组(P<0.01)。简单线性相关分析揭示IDCM血清PCⅠ、PCⅢ分别与舒张末期左室内径、左室质量指数(LVMI)正相关(P<0.05),与LVEF负相关(P<0.01)。多元逐步回归分析显示血清PCⅠ、PCⅢ分别与LVEF负相关,与左室结构指标无相关性(P>0.05)。结论IDCM血清PCⅠ、PCⅢ升高;反映左室收缩功能降低。(本文来源于《心脏杂志》期刊2005年02期）
王新,夏朝红,陈月云[5]（2000）在《高血压病左室肥厚患者血清Ⅲ型Ⅳ型前胶原浓度变化及苯那普利对其影响》一文中研究指出高血压病伴左室肥厚（ＬＶＨ）是引起心血管事件的主要危险因子之一。近年研究发现在超载性心肌肥厚的发展过程中伴随有心肌进行性纤维化［１］,即心肌间质网络的重建,包括胶原含量及构型等改变。血清前胶原末端肽在一定程度上反映心肌间质胶原堆积情况,可用于评估心肌纤维(本文来源于《中国临床药理学与治疗学》期刊2000年02期）
陈月云,王伟华,夏朝红,程光华[6]（1999）在《高血压病患者血清Ⅲ型、Ⅳ型前胶原、透明质酸浓度变化及苯那普利干预》一文中研究指出目的了解高血压病患者血清Ⅲ型前胶原（ＰⅢＰ）、Ⅳ型前胶原（ＰⅣＰ）、透明质酸（ＨＡ）的变化以及苯那普利对其影响。方法应用放射免疫技术测定４７例高血压患者和２１例健康体检者血清ＰⅢＰ、ＰⅣＰ、ＨＡ的浓度，并给高血压患者以苯那普利治疗十二周后复测上述指标。结果高血压组ＰⅢＰ、ＰⅣＰ、ＨＡ分别为１２６．８±１７．４μｇ／Ｌ，６４．１±１０．１７μｇ／Ｌ、７９．２３±９．７８μｇ／Ｌ明显高于对照组的８４．２±１１．９μｇ／Ｌ，５１．７２±９．２４μｇ／Ｌ、４１．３３±６．２５μｇ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）；苯那普利治疗十二周后，高血压组上述指标分别为８９．４±１０．０９μｇ／Ｌ、５９．８±７．１μｇ／Ｌ、６５．４±８．１６μｇ／Ｌ，与治疗前相比Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５，差异显著，有统计学意义。结论血清ＰⅢＰ、ＰⅣＰ、ＨＡ水平与血压升高密切相关并致心肌纤维化。血管紧张素转换酶抑制剂－苯那普利能在有效控制血压的同时明显降低血清ＰⅢＰ、ＰⅣＰ、ＨＡ含量(本文来源于《高血压杂志》期刊1999年01期）
血清型型论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
衣原体(Chlamydia)是一类有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，具有以下特点：(1)革兰氏阴性，圆形或椭圆形体：(2)具有DNA和RNA两种类型的核酸：(3)衣原体以两种形态存在。一种是小而致密的EB(elementary body，原体)，代谢不活跃，有感染性；另一种是大而疏松的RB(reticulate body，网状体)，代谢活跃，能复制生长，无感染性。衣原体的感染从感染性的原体吸附到宿主细胞表面开始，随后通过胞饮作用进入上皮细胞，原体增大并分化为网状体，网状体以二分裂方式增殖，产生子代原体，感染细胞内形成了含有网状体和子代原体的空泡即包涵体。大量的原体随着感染细胞的破裂涌出细胞外，再侵入新的细胞。(4)细胞壁成份中含有肽聚糖；(5)含有核蛋白体；(6)对多种抗生素都敏感。衣原体广泛寄生于包括人类在内的哺乳动物及鸟类。目前已知衣原体可分为四个种属：沙衣眼原体(Chlamydia trachomatis, C. t)、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体及家畜衣原体。C.t包括3个生物亚种：沙眼亚种、性病淋巴肉芽肿亚种、鼠亚种，前两种引起人类疾患。C.t依据其主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)抗原性的不同分为19个血清型，其中L1、L2、L2a和L3型引起性病淋巴肉芽肿(lymphogranuloma venereum, LGV)；A、B、Ba和C型引起沙眼，是全球致盲的首要原因；D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K及基因变种Ja型引起泌尿生殖道感染，是目前国内外最常见的性传播疾病之一。肺炎衣原体感染不仅与呼吸系统感染有关，可导致衣原体肺炎、咽炎，而且与动脉粥样硬化、冠心病的发病相关。因此，预防和控制衣原体感染已成为重要的公共卫生问题。然而到目前为止衣原体的致病机理仍不完全清楚。Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system，TTSS)是一种独立的分泌蛋白的系统。很多革兰氏阴性动植物病原菌都将其产生的致病性蛋白通过TTSS送入动、植物细胞胞质。这些蛋白与真核细胞信号传导因子很相似，可以改变信号传导的方向使宿主免疫反应减弱，细胞骨架重组，建立适于寄生和发挥致病作用的亚细胞小环境。作为专性细胞内寄生菌的衣原体也具有TTSS。从在上世纪70年代开始包括日本Matsumoto在内的很多研究人员发表了衣原体表面的电镜照片：一些凸起从衣原体外膜伸出，象“圆花饰”样，而且在原体和网状体表面均存在。而且这些凸起与其它细菌的Ⅲ型分泌结构相似。在基因检测中，首先在鹦鹉热衣原体基因中发现了与Ⅲ型分泌系统基因同源的部分，Hsia在1997年首次提出了四个基因与Ⅲ型分泌结构的结构基因和调节基因具有同源性。随后，在有关衣原体基因组的工作中发现：衣原体基因组中的结构基因和调节基因与其它具有Ⅲ型分泌系统的病原体编码的Ⅲ型分泌系统的基因有很高的同源性。而且，衣原体编码的Inc(inclusion，包涵体)蛋白家族可以被异种Ⅲ型分泌结构分泌。这些都为衣原体具有Ⅲ型分泌系统提供了依据。基于目前对于其它细菌Ⅲ型分泌系统的了解，人们建立了衣原体Ⅲ型分泌系统的模型。衣原体Ⅲ型分泌结构是一个连续的横跨衣原体内膜和外膜的分泌孔道。CT089(CopN，Cop：Chlamydia outer protein衣原体外膜蛋白)是衣原体Ⅲ型分泌系统的重要组成部分，它是外在膜蛋白(外周膜蛋白)，象”盖子”一样起调节作用，当无宿主感应信号时阻止蛋白的分泌。Hackstadt等用CopN蛋白的特异性抗体进行免疫印记分析，发现CopN蛋白不仅存在于原体、网状体，而且在感染衣原体20小时后细胞培养的提取物中也检测到CopN蛋白的存在。标记CopN蛋白特异性抗体用直接免疫荧光分析衣原体感染20小时后的单层细胞显示特异性的标记呈小环状附于衣原体包涵体的膜上，而且突出于表面。基于这些观察结果，说明CopN蛋白可以：①直接和衣原体相连；②结合于衣原体包涵体的膜；③可以被分泌。虽然人们对CopN蛋白的功能及如何作用知之甚少，但根据CopN蛋白与耶尔森菌的YopN分泌蛋白同源，CopN蛋白应该象YopN蛋白一样，在无宿主信号诱导时起调节作用阻止分泌。而一旦分泌被激活时，胞内的分子伴侣CT088(Scc1)、cr576和CT862可以协助分泌Ⅲ型分泌系统的底物。另外CopN蛋白可能通过宿主细胞接触而激活，从而调节原核细胞的信号传导为其形成早期的包涵体奠定基础，并抑制宿主细胞调亡。目的运用分子生物学方法构建copN-pTrcHisA重组子，E.coli BL21原核表达CopN蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blotting检测CopN蛋白的表达，为进一步研究CopN蛋白的功能和Ⅲ型分泌系统的作用机制，阐明衣原体的致病机理奠定基础。方法实验的大体流程如下：1碱裂解法提取质粒(1)取-20℃保存的含有质粒的E.coli DH5α解冻后吸取100μl菌液接种到LB琼脂平板上(并加入相应含耐药基因的抗生素)，37℃温箱中培养过夜。(2)挑取单菌落接种到3ml LB液态培养基中(并加入相应含耐药基因的抗生素)，把培养试管放到水浴振荡器中，37℃，100转／分，振荡培养12小时。(3)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用低温离心机于4℃以12000g离心30秒，弃上清。(4)加1 mlSTE，悬浮菌体，4℃以12000g离心30秒，弃上清。(5)重复步骤(2)，使细菌沉淀尽可能干燥。(6)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。(7)加200μl新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上3分钟。(8)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒钟使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，将管置于冰上3～5分钟。(9)用低温离心机于4℃以12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。(10)加等体积酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用低温离心机于4℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一新的离心管中。(11)用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA，振荡混合后于室温放置2分钟。(12)用低温离心机于4℃以12000g离心5分钟。弃去上清液。(13)用1ml70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，弃净上清，在空气中使核酸沉淀干燥30分钟。(14)加50μl的用灭菌双蒸水配置的RNA酶(20μg／ml)，以溶解已干燥的DNA沉淀。(15)取5μl质粒溶液，用1％琼脂糖凝胶5v／cm电泳，约40分钟，在紫外线透射反射分析仪下观察结果。2制备C.t的Copn基因：2．1获取C.t E型标准株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。(1)按如下成分配制裂解液：50mMKC1，2.5mM MgCl_2，10mM Tis-HCl(PH8.3)，0.1g／L明胶，0.45％NP-40，0.45％吐温20，200mg／L蛋白酶K。(2)取200μl细胞培养标准菌株液放入1.5ml Eppendorf管中，12000r／min，离心20min，弃上清。(3)沉淀中加入50μl裂解液，振荡混匀后，放入55℃水浴中1小时。(4)加50μl Tris饱和酚，颠倒Eppendorf管，使内容物混合成乳状，蛋白质变性。12000r／min，4℃离心5min，混合物分为两相，上层是清澈透明的水相，下层是酚相。(5)吸取水相至新的Eppendorf管，加入等体积的酚／氯仿(体积比1：1)，颠倒Eppendorf管数次，混匀内容物。(6) 12000r／min，4℃离心5min，吸取上层水相至新的Eppendorf管。(7)加1／25体积的5M氯化钠，混合均匀，再加2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后放置冰上20min，沉淀DNA。(8) 12000r／min，4℃离心10min。(9)倒弃乙醇，Eppendorf管倒置于干燥滤纸上，室温蒸发痕量乙醇。(10)加入20μl无菌双蒸水，溶解DNA，—20℃储存备用。另一种获取基因组DNA的方法是只裂解不提纯DNA，在步骤(3)后，沸水浴15min灭活蛋白酶K后离心3min，取含有DNA的上清液，做PCR扩增的DNA模板，此方法省去DNA提纯步骤，减少提纯过程中的DNA损失。2．2 PCR扩增方法筛选C.t阳性临床标本：根据文献报道选择C.t质粒的特异性引物(上游引物KL1-5’TCCGGAGCGAGTTACGAAGA 3’；下游引物KL2-5’AATCAATGCCCGGGATTGGT 3’)，过程为灭菌双蒸水→Buffer→dNTPmix→上游引物KL1→下游引物KL2→模板DNA→Taq DNA聚合酶的顺序加样，混匀后，短暂离心，加入30μl液体石蜡封闭反应体系，以上操作均在冰盒中进行，最后移入PCR扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃后延伸10分钟，使反应完全。用1％琼脂糖凝胶电泳进行结果判定，但对于某些标本效果不佳，所以选取不易判读的标本，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行结果判定。2．3 PCR扩增C.t的CopN基因：将筛选出的C.t阳性的标本作为模板，用带有限制性核酸内切酶识别位点的CopN基因特异性引物，以PCR的方法扩增C.t的CopN基因，以获得大量用于基因重组的目的基因。采用的引物是文献中报道的C.t的CopN基因的特异性引物。这对引物根据Genebank中提供的C.t的L2血清型CopN基因序列设计，引物由上海博亚公司合成，序列如下：上游引物1：5’-AAACCGCTCGAGGACTGCATCAGGAGGAGCTGGAGGG-3’其中划线部分为限制性核酸内切酶XhoI识别位点，AAACCG为保护性碱基，GAC与起始密码子ATG相互补。下游引物2：5’-TCCGGAATTCTTAGGGTGATGGAGG CTGTG TTGAGGTAGG-3’其中划线部分为限制性核酸内切酶EcoRI识别位点，TCCG为保护性碱基。TTA与终止密码子TAA相互补。NO1、NO2引物扩增的基因片段全长1288bp，其中包括CopN基因1266bp，两个限制性核酸内切酶识别位点共12bp，保护性碱基共10bp。扩增条件为94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，62／63℃退火50秒，72℃延伸80秒，35个循环；72℃后延伸10分钟，使反应完全。取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，判断结果。3重组子的建立3．1载体质粒pTrcHisA与CopN克隆基因的双酶切和回收：我们选择XhoI和EcoRI做为限制性核酸内切酶，两种酶的识别序列及切割方式如下：用限制性核酸内切酶切割质粒的XhoI和EcoRI识别位点，使闭合环状的双链质粒DNA分子打开呈线状，并产生粘性末端。按照灭菌双蒸水→10×NEBuffer→100×BSA→质粒→XhoI→EcoRl的加样顺序在冰中完成操作，吹打混匀，短暂离心5秒，移入预热的恒温水浴箱中，37℃水浴1小时。用同样的方法对CopN克隆基因进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。分别回收质粒和目的基因酶切后的产物，方法如下：(1)在紫外灯下切下有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶质量，该重量作为一个凝胶体积，如100mg=100μl体积。(2)根据凝胶浓度，所用均为1％琼脂糖凝胶应加3个凝胶体积DE-A溶液。混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全熔化(约6-8分钟)。(3)加1.5个凝胶体积的DE-B溶液，混合均匀。(4)吸取(3)中的混合溶液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，3600rpm，离心1分钟。若液体残留，加大离心转数1分钟。(5)吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次，3600rpm，离心1分钟。(6)将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm，离心30s，弃滤液。(7)将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm，离心30s，弃滤液。(8)重复步骤(7)(9)将制备管置于离心管中，12000rpm离心1分钟，净弃W2溶液。(10)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl水，室温静置1分钟。12000rpm离心1分钟洗脱DNA。3．2连接和转化3．2．1 CopN基因与载体质粒的连接将酶切后回收的CopN基因与载体质粒按接近10：1的分子比率混合，在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应，组建含CopN重组子。反应条件为16℃16小时，再放入4℃冷藏24～48小时使反应完全，反应总体系为25μl，其中质粒1μl，CopN基因19.5μl，10×L Buffer2.5μl，T4 DNA连接酶1μl(350u)，补足灭菌双蒸水至25μl。3．2．2氯化钙法制备感受态E.coli DH5α(1)取-20℃保存的E.coli DH5α，接种于LB琼脂平板，放置37℃温箱中过夜培养。次日挑取单菌落接种到3ml LB液态培养基中，37℃，150rpm，摇菌过夜培养。(2)取1ml菌液接种于14ml LB液态培养基中，37℃，150rpm，振荡培养约2.5h，至OD260=0.6时，此时E.coli的浓度约为5×10~7／ml。将菌液平均倒入3个5ml Eppendorf管中，冰浴30min。4℃4000rpm离心10min收集菌体，弃净上清。(3)菌体悬浮于1ml冰预冷的100mmol／L CaCl_2中，冰上孵育10min，4℃，4000rpm离心10min收集菌体，弃净上清。(4)菌体重新悬浮于0.2ml冰预冷的100mmol／L CaCl_2中，混合均匀，4℃放置12～24h。(5)向200μl感受态E.coli DH5α中加上述连接产物10μl(约40ng)，混匀，冰上孵育30min。此步骤设立两个对照组：阳性对照，取10μl(约40ng)pTrcHisA质粒转化感受态E.coli；阴性对照，不加质粒，代以10μl蒸馏水转化感受态E.coli。(6)放置42℃水浴中，热休克90s，再迅速置于冰上2min，然后每管加LB培养液800μl，37℃，培养1.5h。(7)取200μl菌液均匀接种到含氨苄青霉素(100μg／ml)的LB固态培养皿上，倒置平皿，37℃，培养16h，观察菌落生长情况，转化成功的平皿于4℃保存。3．2．3连接产物转化至E.coli DH5α本实验借助热休克将重组子导入处于感受态的E.coli DH5α。具体步骤如下：向200μl感受态E.coli DH5α中加含CopN重组子10μl(约40ng)，混匀，冰上孵育30m。此步骤设立两个对照组：阳性对照，取10μl(约40ng)载体质粒(相应未重组的质粒)转化至感受态E.coli DH5α；阴性对照，不加质粒，代以10μl灭菌双蒸水转化至感受态E.coli DH5α。(1)放置42℃水浴中，热休克90s。(2)迅速置于冰上2m。(3)每管加LB培养液800μl，37℃，培养1.5小时，使细菌复苏，并表达重组质粒编码的Amp抗性标记基因。4阳性重组子的筛选和鉴定4．1抗生素平板筛选法：E.coli DH5α本身无氨苄青霉素抗药性，接种到含氨苄青霉素的琼脂培养板上后，不能存活。而pTrcHisA质粒基因中含有氨苄青霉素抗性基因，所以转化有重组子CopN-pTrcHisA的E.coli DH5α仍具有氨苄青霉素抗药性，能在含有氨苄青霉素的琼脂培养板上生长成单菌落。CopN-pTrcHisA重组子转化E.coli DH5α后，用抗生素平板筛选法，可以筛选已转化有质粒的E.coli DH5α。此外，pTrcHisA质粒在E.coli中具有高拷贝扩增的特性，随着菌体的繁殖，可以获得大量的重组子。除阳性重组子外，酶切不完全而自身环化的质粒载体也能转化E.coli DH5α，生长成单菌落，形成假阳性，本法只是阳性重组子的初步筛选。CopN-pTrcHisA重组子转化E.coli DH5α后，取200μl菌液接种于氨苄青霉素阳性的LB琼脂平板上。阳性对照平板接种200μl已转化pTrcHisA质粒的E.coli DH5α。阴性对照平板接种的200μl菌液，为灭菌双蒸水转化的E.coli DH5α。接种后，37℃温箱中培养16小时，观察菌落生长情况。4．2 PCR扩增方法筛选阳性重组子取数个LB琼脂平板上的DH5α单菌落，培养E.coli DH5α，提取质粒。以提取的质粒为DNA模板，用引物NO1、NO2扩增重组质粒CopN-pTrcHisA中的CopN基因，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定。需要注意PCR反应可能有假阳性存在，仍有必要作进一步鉴定。4．3重组子的酶切鉴定重组子CopN-pTrcHisA基因序列全长约5.7Kb，其中含有pTrcHisA质粒4.4Kb和CopN基因1266bp。提取的重组质粒用XhoI和EcoRI限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。4．4重组子的基因测序鉴定：选取上述方法证明转化成功的E.coli DH5α菌液800μl，送宝生物工程(大连)有限公司进行重组子基因的序列鉴定。5测序正确的重组子转化至蛋白表达菌E.coli BL21，方法同3．2．2。6沙眼衣原体E型Bour菌株CopN的诱导表达挑取成功转化CopN-pTrcHisA重组子的E.coli BL21单克隆菌落，加入到10ml液体带有氨苄青霉素抗性(Amp 50μg／mL)的LB培养基中，37℃摇菌过夜。将该菌液加入1000mlLB液态培养基中(Amp 50μg／mL)，同上培养2h，至对数生长期。加入IPTG(终浓度0.03mM)，继续摇菌2h。室温10000转／分，30秒离心收菌。得到5管湿菌沉淀，以冰浴TEN液洗涤2次(1／10体积洗涤)，加入溶菌酶(终浓度1mg／ml)、Triton-X 100(终浓度0.5％)冰上孵育15min。以49％振幅6秒12次超声碎菌。悬浊液4℃12000rpm离心20分，分离沉淀和上清液分别储存于—20℃冰箱以备分析。7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)灌胶前，应用洗衣粉或清洁液充分清洗灌胶玻璃板，并用无水乙醇冲洗贴胶面，最后用干净的纱布拭干。操作时应戴手套。安装好灌胶装置。(2)选择10％分离胶浓度。注意将胶充分混匀，TEMED先于AP加。灌好分离胶后，立即在其上加入蒸馏水封闭。静置20min。(3)配制4％积层胶。(4)分离胶凝固后，倾出上层蒸馏水，可用滤纸吸干。倒入积层胶，插入梳子，注意不要产生气泡。(5)待凝胶聚合完全后，在电泳槽中加入电泳缓冲液(注意胶的下面不要存在缓冲液的气泡)，小心移出梳子。用电泳缓冲液冲洗加样孔。(6)上样：将获得的样品从-20℃冰箱中取出，于37℃溶化。用微量加样器分别取15μl样品溶液和5μl 4×SDS加样缓冲液(终浓度为：0.0625mol／LTris-HCL、pH 6.8，2％SDS，10％甘油，5％2-巯基乙醇，0.001％溴酚蓝)加入0.2ml EP管中混匀。然后将含有蛋白和上样缓冲液的EP管放入恒温水浴锅中，在100℃条件下煮沸3分钟，使蛋白质变性。煮沸结束后按预定顺序加样，每孔加样品20ul。最后在所有不用的样品孔中加上等体积的4×SDS凝胶上样缓冲液。(7)积层胶电压稳定在80V，当溴酚蓝指示剂越过积层胶与分离胶的分界线后，将电压调整并稳定在120V直至溴酚蓝跑到胶底部(约1.5小时)。(8)切胶。上方切去浓缩胶部分，下方切去溴酚蓝以下部分。(9)考马斯亮蓝染色1h，脱色液洗3次，每次30min。8．Western blot方法检测CopN蛋白的表达(1) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，方法同7。(2)转膜：根据凝胶大小剪取4张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素，然后将滤纸、硝酸纤维素滤膜及凝胶于转移缓冲液中处理10min。同时将海绵浸于转移缓冲液中。按如下方法安装转移装置：阴极、一层海绵、两层滤纸、胶、PVDF、膜、两层滤纸、一层海绵、一层海绵，将气泡赶净(主要是胶和膜之间的气泡)。(3)将硝酸纤维素膜放入可热密封的塑料袋，根据滤膜面积以0.1ml／cm~2的量加入封闭液，然后密闭袋口。平放在平缓摇动的摇摆平台上于室温下孵育1～2小时。(4)用封闭缓冲液按1∶800的比例稀释his-tag单抗，并于振荡器上混匀。(5)剪开塑料袋，弃去封闭液，立即在装有用上述方法处理过的硝酸纤维素滤膜的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加入用封闭液稀释的一抗，密封袋口，将滤膜平放在平缓摇动的摇摆平台上，于4℃孵育过夜。(6)滤膜完成后，戴手套从塑料袋中取出膜，放在塑料盒中摇动着用PBST洗3次，每次10～15min。(7)用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(二抗)，稀释二抗浓度至1∶1000。(8)将膜放进一新的可密封塑料袋，按滤膜面积0.1ml／cm2加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，在室温下持续摇动1～2h。(9)戴手套从塑料袋中取出滤膜，放在塑料盒中摇动着用PBST洗3次，每次10～15min。最后用PBS洗一次，时间为10～15min。(10)将表面带有抗原-抗体-抗抗体-HRP复合物的滤膜放在塑料盒中，加入配好的DAB显色试剂(按说明书操作)，于平缓摇床上进行显色定位至条带清晰为止，最后取出滤膜用蒸馏水洗2遍终止反应。(11)待印记膜在空气中自然干燥后，将其密封入塑料袋中保存。结果1碱裂解法提取质粒：用1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约4400bp可见清晰的质粒条带，证明pTrcHisA质粒提取成功。2制备C.t的Copn基因：2．2 PCR扩增方法筛选C.t阳性临床标本：1％琼脂糖凝胶电泳和8％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，在241bp的位置发现了一条清晰的条带，说明用衣原体质粒引物KL1、KL2扩增成功筛选C.t阳性的标本，并为下一步扩增CopN基因提供了模板DNA。在结果判定上，对于片断较小PCR产物(如衣原体质粒引物KL1、KL2扩增产物仅241bp)，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳效果更佳。2．3 PER扩增C.t的CopN基因：用1％琼脂糖凝胶电泳进行结果判定，在相当于Marker1000—1500bp间出现清晰特异性条带，引物N1、N2扩增C.tCopN基因成功。3重组子的建立3．1载体质粒pTrcHisA与CopN克隆基因的双酶切和回收：1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，与Marker相比较，酶切产物分别在4.4Kb(相当于Marker 3500-5500bp间)和近1.3Kb(相当于Marker1000-2000bp间)位置出现清晰特异性条带，提示酶切成功。3．2连接和转化重组子的抗生素琼脂平板筛选结果显示：阳性对照平板与实验平板都有菌落生长，且前者较后者菌落密集，阴性对照平板无菌落生长，提示重组子连接成功、转化成功。4阳性重组子的筛选和鉴定4．1抗生素平板筛选法：结果同3．2．24．2 PCR扩增方法筛选阳性重组子1％琼脂糖凝胶电泳结果，约1.3Kb处出现清晰特异的条带，提示CopN基因与pTrcHisA质粒连接成功，重组子CopN-pTrcHisA成功转化至E.coli DH5α。4．3重组子的酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示双酶切后CopN-pTrcHisA重组子分隔成4.4Kb(相当于Marker 3500-5500bp间)和近1.3Kb(相当于Marker1000-2000bp间)大小两个基因片段，证明CopN基因位于pTrcHisA质粒内，重组成功。4．4重组子的基因测序鉴定：测序结果与网上基因库CopN基因相比完全一致，证明重组入质粒的为CopN基因。5测序正确的重组子转化至蛋白表达菌E.coli BL21重组子的抗生素琼脂平板筛选结果显示：阳性对照平板与实验平板都有密集的菌落生长，阴性对照平板无菌落生长，提示重组子转化成功。6沙眼衣原体E型Bour菌株CopN的诱导表达聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可见重组菌在48KD处有一浓集条带，而空质粒菌并无浓集条带；Western blot结果也可见重组菌在约48KD附近有一条显色条带，而对照的空质粒菌则没有显色条带。两者均证明CopN的诱导表达成功。结论1．成功构建C.t E血清型的TTSS中CopN基因与pTrcHisA质粒的重组体CopN-pTrcHisA。2．本实验在构建CopN重组子的过程中摸索出适合本实验室的分子生物学方法，获得了经验。3．构建C.t E血清型CopN基因重组子，为下一步表达CopN蛋白及其功能的相关研究奠定了基础。4．通过IPTG诱导得到了较多的CopN蛋白。5．聚丙烯酰胺凝胶电泳和western blotting对蛋白进行了鉴定。CopN蛋白对Ⅲ型分泌系统的分泌蛋白起调节作用，对CopN蛋白的深入研究可能揭示Ⅲ型分泌系统的作用机制，阐明衣原体的致病机理。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
血清型型论文参考文献
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