导读:本文包含了凝集素蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:天南星科有毒中药,凝集素蛋白,炎症,受体
凝集素蛋白论文文献综述
王卫[1]（2019）在《天南星科4种有毒中药凝集素蛋白促炎作用机制及炮制的影响》一文中研究指出半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)、掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott.)、天南星(Arisaema heterophyllum Maxim.)、白附子(Typhonium giganteum Engl.)均为天南星科有毒中药,临床误服生品或鲜品均出现强烈的刺激性毒性。课题组前期研究表明,天南星科这4种有毒中药的刺激性毒性成分同属一类,均是其含有的“毒针晶”,并发现毒针晶中带有毒蛋白,这类毒蛋白是该科属有毒中药中特有的凝集素蛋白。课题组前期研究发现凝集素蛋白可加重因毒针晶刺激导致的家兔眼结膜水肿,可导致大鼠足趾肿胀,并可诱导大鼠腹腔中性粒细胞迁移聚集,具有强烈的促炎毒性,且这种促炎作用与居留巨噬细胞密切相关,能够导致巨噬细胞的活化,但其促炎机制尚未阐明。因天南星科这4种有毒中药具有强烈的刺激性毒性,需炮制以降低毒性才能临床应用。《中国药典》及全国中药饮片炮制规范对天南星科这几种有毒中药的炮制方法均记载为采用辅料生姜、白矾以及加热的方法进行炮制,课题组前期研究发现白矾具有确切的破坏针晶结构的作用,但其对凝集素蛋白的影响还有待进一步探讨。为进一步阐明天南星科4种有毒中药中的凝集素蛋白促炎毒性机制以及炮制对凝集素蛋白的影响,本论文从细胞膜受体介导产生生物学效应的角度,深入系统的研究4种凝集素蛋白的促炎机制;采用辅料生姜、白矾以及加热的方法分别炮制4种凝集素蛋白,以研究不同炮制方法及辅料对凝集素蛋白的影响。通过上述研究,以揭示天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制及复制法炮制解毒的科学内涵,为天南星科有毒中药的饮片质量控制、临床安全应用、炮制工艺改革与创新提供科学依据和理论支撑,也为其他同科属有毒中药炮制研究提供示范和借鉴。主要研究工作如下:1.天南星科4种有毒中药凝集素蛋白与巨噬细胞的结合作用研究从天南星科植物半夏、掌叶半夏、天南星、白附子的块茎中分别提取分离纯化获得半夏凝集素(PTL)、掌叶半夏凝集素(PPL)、天南星凝集素(AEL)和白附子凝集素(TGL);采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记4种凝集素蛋白,并经流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测4种凝集素蛋白与巨噬细胞是否发生结合。流式细胞仪检测结果显示,与空白组比较,经FITC标记的不同浓度的4种凝集素蛋白(6.25、12.5、25、50μg/mL)刺激巨噬细胞1h后均能导致细胞荧光强度显着增强,表明4种凝集素蛋白均能与巨噬细胞发生结合,且随着凝集素蛋白给药剂量的增加,其结合率显着增大。共聚焦显微镜观察结果显示,4种凝集素蛋白刺激巨噬细胞1h后均能定位到巨噬细胞膜上,并且随着给药剂量的增加和刺激时间的延长,4种凝集素蛋白均逐渐进入细胞质中。以上结果表明天南星科4种凝集素蛋白能与巨噬细胞发生结合,并主要定位于细胞膜上,推测凝集素蛋白可能与细胞膜表面受体发生结合。2.天南星科4种有毒中药凝集素蛋白促炎机制研究以不同浓度的4种凝集素蛋白体外刺激RAW264.7巨噬细胞,1h后Western blot法检测巨噬细胞中MAPKs通路关键蛋白p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK以及NF-κB通路关键蛋白p-p65、p65、p-IκB、IκB的表达;并采用ELISA法检测凝集素蛋白刺激巨噬细胞后对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放的影响。结果显示,4种有毒中药凝集素蛋白均能够激活MAPKs、NF-κB炎症信号通路,表现为p-p38、p-ERK、p-JNK、p-IKB、p-p65蛋白水平的升高。同时,4种凝集素蛋白均能够导致巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的大量释放。此结果表明天南星科有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星和白附子凝集素蛋白具有强烈的促炎毒性。炎症通路的活化以及炎症因子的释放受到上游细胞膜受体的调控,荧光标记实验表明,4种凝集素蛋白可定位于巨噬细胞膜上,定位于细胞膜上的凝集素蛋白是否与受体结合?是与哪类受体结合?本论文采用基因沉默技术,以shRNA质粒转染巨噬细胞,分别沉默6种重要的细胞膜炎症相关受体,即吞噬性受体中的SR-A和DC-SIGN,模式识别信号受体中的TLR4,细胞因子受体中的TNFR1、TNFR2和IL-1R1,并采用倒置荧光显微镜、PCR以及Western Blot法分别对沉默效率进行测定。达到基因沉默效果后,采用Western Blot和ELISA法分别检测4种凝集素蛋白刺激巨噬细胞对MAPKs、NF-κB信号通路以及对炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-6释放的影响,进而筛选可能的与凝集素蛋白结合的关键受体分子,同时采用Western Blot法对关键受体分子及其下游衔接蛋白表达进行测定,以进一步验证该受体分子是否与凝集素蛋白发生相互作用。研究结果显示,分别以shSR-A、shDC-SIGN、shTLR4、shTNFR1、shTNFR2、shIL-1R1质粒4μg转染巨噬细胞48h后,各基因的沉默效率均达到70%左右,表明以此条件转染的巨噬细胞基因沉默效果良好。与未沉默组相比,沉默受体组4种凝集素蛋白导致的MAPKs和NF-κB通路的活化程度以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放的程度均显着降低,其中以沉默TNFR1和TLR4受体组促炎作用降低最为显着,表明TNFR1和TLR4受体在4种凝集素蛋白的促炎过程中发挥重要作用。Western Blot结果显示,4种凝集素蛋白均能使细胞中TNFR1受体及下游衔接蛋白TRADD、TRAF2以及TLR4受体及下游衔接蛋白MyD88、IRAK4、TRAF6蛋白水平升高,进一步表明TNFR1和TLR4受体在4种凝集素蛋白的促炎过程中发挥重要作用。根据上述结果可推测4种凝集素蛋白与TNFR1或TLR4受体间可能存在直接的结合作用。为验证此推测,论文采用蛋白-蛋白相互作用的方法进一步研究两种受体与凝集素蛋白的结合作用。因4种凝集素蛋白目前未能检索到叁维结构,故本论文采用同源建模的方法分别模拟出了4种凝集素蛋白的叁维结构,进而分别与TNFR1、TLR4受体进行对接,并测定4种凝集素蛋白与TNFR1、TLR4受体的结合力。同时,采用生物膜层干涉技术(BLI)验证4种凝集素蛋白与TNFR1、TLR4受体的亲和作用,测定其亲和力。蛋白-蛋白对接结果表明,4种凝集素蛋白与TNFR1受体的结合力均远大于TNFR1特异性蛋白配体(TNF-β)与TNFR1受体的结合力,且半夏凝集素与TNFR1受体的结合力约是TNFR1特异性蛋白配体(TNF-β)与TNFR1受体结合力的2倍;而4种凝集素蛋白与TLR4受体的结合力与TLR4特异性蛋白配体(MD-2)与TLR4受体结合力相接近。BLI研究结果表明,4种凝集素蛋白与TNFR1的亲和常数在5～8×10-8mol/L之间;4种凝集素蛋白与TLR4的亲和常数在2× 10-6～4× 10-5mol/L之间。亲和常数越小,分子间的结合越牢固。故上述结果表明,与TLR4受体相比,TNFR1受体与4种凝集素蛋白具有更强的亲和作用。研究结果表明,天南星科4种凝集素蛋白与TNFR1受体具有强烈的亲和作用,TNFR1受体应该是4种凝集素蛋白发挥促炎作用的主要分子靶点,而TLR4受体与4种凝集素也有一定的结合力,是促炎作用的次要靶点。3.半夏凝集素干预的巨噬细胞转录组测序为深入研究凝集素对巨噬细胞的作用,本论文采用转录组测序的方法考察凝集素蛋白对巨噬细胞基因表达和功能的影响。以半夏凝集素为模式蛋白,50μg/mL的剂量刺激巨噬细胞1h后,利用Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序,构建半夏凝集素干预的巨噬细胞转录组文库,并用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。通过测序评估和基因表达量分析,结果显示半夏凝集素刺激巨噬细胞后,共获得巨噬细胞652种差异表达基因,其中上调基因616个,且其中有43个基因与炎症密切相关,下调基因36个。功能分析显示半夏凝集素主要影响巨噬细胞的分子功能、生物过程以及细胞组成。代谢通路分析表明半夏凝集素刺激巨噬细胞后,主要影响细胞中的TNF信号通路、MAPK信号通路等。此结果与凝集素蛋白和TNF受体结合并激活MAPK、NF-κB信号通路导致炎症因子大量释放的结果一致。4.炮制对天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的影响天南星科4种有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星和白附子均具有强烈的促炎毒性,故临床上常采用白矾水浸泡或生姜加白矾加热煮制的方法进行炮制以降低毒性。本论文采用白矾水浸泡和生姜加上白矾并加热煮制的方法炮制4种有毒中药,研究炮制对凝集素蛋白的影响。采用Western Blot法半定量测定半夏、掌叶半夏、天南星、白附子及其不同炮制品中凝集素蛋白的含量。分别单独以生姜汁浸泡、白矾水浸泡、加热煮制4种有毒中药及凝集素蛋白,考察不同炮制方法对4种凝集素蛋白含量的影响;采用SDS-PAGE法结合银染技术鉴定4种凝集素经炮制后的蛋白沉淀;采用MALDI-TOF检测不同炮制方法对4种凝集素蛋白一级结构的影响。结果表明,生掌叶半夏、生半夏、生天南星和生白附子中各凝集素蛋白的含量分别为7.3%、4.9%、2.7%、2.3%,白矾炮制后的清半夏中半夏凝集素的含量为0.027%,而姜半夏、制天南星和制白附子中均未检测到活性凝集素蛋白。加热煮制能够导致4种活性凝集素含量大大降低,白矾水浸泡同样降低4种活性凝集素蛋白的含量,而生姜汁浸泡对活性凝集素蛋白的含量基本无影响。SDS-PAGE法结合银染技术以及MALDI-TOF结果显示,采用白矾水浸泡以及单独加热煮制的方法进行炮制,可导致凝集素蛋白变性的同时发生降解,从而导致具有活性的凝集素蛋白的含量显着降低。研究结果表明,炮制工艺和辅料中以白矾水浸泡和加热煮制这4种有毒中药可降低其毒性,但单独采用生姜汁浸泡无显着降毒作用。这解释了采用白矾水浸泡和生姜加白矾煮制的工艺能够一直沿用至今,而单独姜浸炮制工艺己被淘汰的原因。本论文深入研究了天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制,结合课题组前期研究结果,论文揭示了天南星科有毒中药产生强烈的刺激性致炎毒性的机制是:4种有毒中药块茎中的毒针晶可刺入机体组织,针晶及块茎中的凝集素蛋白可随针晶进入组织,与组织巨噬细胞膜上的TNFR1、TLR4受体结合,诱导氧化应激,并激活下游MAPK、NF-κB及NLRP3信号通路,导致炎症因子大量释放,并进一步促发炎症级联反应,导致强烈的炎症刺激性毒性。复制法炮制解毒的机制在于,白矾可破坏4种有毒中药中针晶的结构,同时辅料白矾以及加热煮制的方法能够导致凝集素蛋白变性或降解,从而显着降低刺激性毒性;单独以生姜汁浸泡不能破坏凝集素蛋白,而生姜加上白矾煮制的炮制技术主要是白矾和加热的作用。本论文的研究结果明确地揭示了天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制以及复制法炮制解毒的关键科学内涵,为天南星科及其他科属有毒中药的饮片质量控制、炮制工艺改革与创新提供示范和借鉴。(本文来源于《南京中医药大学》期刊2019-06-10）
赵金龙[2]（2019）在《质子化诱导调控黑芸豆凝集素蛋白致敏性的构效关系研究》一文中研究指出本试验采用质子化诱导处理黑芸豆(Phaseolus vulgaris L.)凝集素,将凝集素置于低于等电点(pI)的系列低pH环境中,对其进行质子化诱导,研究了凝集素结构变化与致敏性消减的构效关系,并进一步探究了质子化诱导处理后,溶液体系回调中性,对芸豆分离蛋白品质的影响。1、同源模建出芸豆凝集素的叁维结构,采用多种生物信息学工具预测出B和T细胞抗原表位,进一步通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、淋巴细胞增殖和细胞因子释放试验,对抗原表位进行体外验证,发现4个B细胞抗原表位(B1:NVNDNGEPTLSS、B2:VGSEPKDKGG、B3:NNYKYDSNAHT和B4:LYNVHWDPKPRH)和2个T细胞表位(T1:LQRDATVSS和T2:FNIDVPNNS),高疏水性正电荷性质的氨基酸残基在凝集素抗原表位构成中发挥重要作用。2、对芸豆凝集素进行质子化诱导处理,研究发现,凝集素结构在不同质子化条件,呈现逐渐展开的过程,并在8 h达到稳定状态。基于内/外源荧光光谱、SDS-PAGE、动态光散射(DLS)、分子排阻色谱(SEC)和差示扫描量热法(DSC)分析发现,质子化诱导可引起凝集素结构去折迭,甚至解聚,可能会掩埋、破坏或分裂凝集素表面抗原表位,并导致更多的凝集素胰蛋白酶酶切位点暴露。3、质子化诱导处理的芸豆凝集素与弗氏完全佐剂(CFA)混合乳化,连续腹腔注射致敏BALB/c小鼠5周,末次通过灌胃大剂量激发致敏。相对于Native组,经处理后的凝集素致敏的BALB/c小鼠致敏症状减轻、免疫球蛋白(IgE和IgG_1)、mMCPT-1、组胺和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ)含量均显着降低。圆二色谱(CD)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和分子动学(MD)模拟表明,质子化诱导可使凝集素α-螺旋含量显着降低,β-折迭含量升高,凝集素蛋白结构去折迭,更多的胰蛋白酶酶切位点暴露于蛋白表面。4、黑芸豆分离蛋白经质子化诱导处理8 h后,回调pH至中性(即质子化诱导还原处理),经冷冻干燥,得到芸豆蛋白粉。结构分析表明,经处理后的分离蛋白α-螺旋含量降低,β-折迭升高,分离蛋白结构解折迭,更多的疏水性氨基酸暴露,总-SH和游离-SH含量显着减少,二硫键(-S-S-)含量增加。功能性研究发现,处理后的分离蛋白,具有更高的乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)、起泡性(FC)和起泡稳定性(FS)、持油性(FHC)及凝胶性,而溶解性和持水性(WHC)降低。处理后的芸豆蛋白粉凝血活性和致敏性显着性降低,体外消化率明显改善。(本文来源于《合肥工业大学》期刊2019-05-01）
毛善虎,郁红礼,吴皓,王卫,李晓楠[3]（2017）在《掌叶半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞的致炎作用研究》一文中研究指出为探索掌叶半夏凝集素蛋白(PPL)刺激巨噬细胞诱导炎症的作用与炎症小体NLRP3的相关性。采用凝胶色谱纯化掌叶半夏凝集素蛋白并采用SDS-PAGE凝胶电泳分析其纯度;采用ELISA法以IL-1β为指标考察PPL刺激巨噬细胞释放炎症因子的影响;采用荧光探针DCFH-DA荧光酶标仪检测PPL刺激巨噬细胞后活性氧ROS的水平变化;以ROS抑制剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)预处理巨噬细胞,考察PPL刺激ROS的过量生成与炎症因子IL-1β大量释放的相关性;采用Western Blot方法检测PPL对炎症小体生成相关的Caspase-1 p20,NLRP3,TXNIP,ASC等蛋白的表达水平变化。结果显示分离纯化的PPL达到电泳纯;PPL刺激巨噬细胞后引起ROS过量释放,引起强烈的氧化应激反应,胞内炎症因子IL-1β含量显著升高;NAC可抑制PPL导致的ROS过量生成,且IL-1β释放也显著降低。同时PPL可诱导胞内Caspase-1 p20,NLRP3,ASC蛋白表达升高,TXNIP表达显着降低。研究结果表明,PPL刺激巨噬细胞可导致强烈的氧化应激反应,同时能够激活炎症小体NLRP3,导致IL-1β大量生成释放,即PPL能够通过ROS-TXNIP-NLRP3-IL-1β信号通路促进IL-1β的成熟和分泌,导致炎症级联反应。(本文来源于《中国中药杂志》期刊2017年13期）
郁红礼,毛善虎,赵腾斐,吴皓,潘耀宗[4]（2015）在《姜辣素拮抗半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞所致炎症因子TNF-α释放增加、ROS过量生成及RIP3表达增高》一文中研究指出为探索姜辣素拮抗半夏凝集素蛋白致炎作用,该研究采用ELISA法测定生姜不同提取部位对半夏凝集素蛋白所致巨噬细胞释放炎症因子TNF-α的影响;采用荧光探针测定姜辣素对半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞氧自由基ROS水平变化的影响;采用Western blot法研究姜辣素对半夏凝集素蛋白致巨噬细胞中细胞受体相互作用蛋白RIP3的表达水平增高的影响;扫描电镜研究姜辣素对半夏凝集素蛋白致巨噬细胞形态变化的影响。结果显示姜辣素可显着抑制半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞所导致炎症因子释放增加、ROS过量生成及RIP3的表达增高,扫描电镜显示姜辣素可抑制半夏凝集素蛋白导致的细胞变形坏死。生姜解半夏毒的机制可能与姜辣素抑制半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞导致的炎症因子释放、ROS的过量生成、RIP3的表达增高及巨噬细胞坏死相关,机体表现为抑制炎症的发生发展。(本文来源于《中国中药杂志》期刊2015年18期）
吴皓[5]（2014）在《天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性和炮制的影响》一文中研究指出(本文来源于《2014年全国中药炮制学术年会暨中药饮片创新发展论坛及协同创新联盟会议会议讲义》期刊2014-11-15）
潘耀宗,郁红礼,吴皓,陈叶青,王奎龙[6]（2014）在《掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用与巨噬细胞的相关性研究》一文中研究指出目的:探索掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白诱导炎症与巨噬细胞的相关性。方法:自掌叶半夏块茎中提取分离纯化掌叶半夏毒针晶与凝集素蛋白;采用SDS-PAGE凝胶电泳联合质谱分析鉴定凝集素蛋白;采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,以TNF-α和IL-1β为指标,研究掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白刺激巨噬细胞释放炎症因子的影响;采用扫描电镜法观察经掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激后巨噬细胞的形态变化;采用巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养迁移模型,考察掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白分别刺激巨噬细胞对中性粒细胞迁移的影响。结果:掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,巨噬细胞体积增大,伪足数量增加,细胞膜逐渐破裂。且两者体外均能显着诱导中性粒细胞迁移,其促迁移聚集作用与巨噬细胞释放炎症因子相关。结论:掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白诱导炎症与巨噬细胞介导密切相关。(本文来源于《中华中医药杂志》期刊2014年05期）
齐晓冉[7]（2014）在《家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究》一文中研究指出微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能够感染几乎所有的动物,是人类和多种经济动物的重要病原。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是家蚕微粒子病的病原,因其能够经卵垂直传播,对蚕业生产危害极大,所以它一直被各养蚕国家和地区列为法定检疫对象。凝集素是许多病原的重要毒力因子,具有介导细胞间粘附、病原感染宿主、机体的天然免疫防御、宿主吞噬细胞清除入侵病原等作用。比较基因组分析发现,家蚕微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、蜱虫微孢子虫、肠道微孢子虫、柞蚕微孢子虫及东方蜜蜂微孢子虫等微孢子虫中均具有编码Ricin B-凝集素蛋白的基因,并且这些基因均为多拷贝,以串联重复形式存在。这类基因分布如此之广、拷贝数如此之多,它们在微孢子虫生命活动以及在侵染宿主过程中扮演着什么样的角色?它们以什么样的形式发挥作用?目前尚不清楚。本研究聚焦家蚕微孢子虫Ricin B-凝集素蛋白的基因Nbrbl3,首先利用生物信息学方法对其序列特征及亚细胞定位进行了预测,并对其进行了分子克隆和原核表达,利用获得的重组蛋白制备了多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术分析了家蚕微孢子虫凝集素蛋白NbRBL3在家蚕微孢子虫成熟孢子中以及所侵染的宿主细胞内的亚细胞定位特征。通过对提取的家蚕微孢子虫孢壳蛋白、发芽液蛋白及感染家蚕微孢子虫细胞总蛋白进行免疫印迹分析,进一步探明了其在家蚕微孢子虫中的存在形式和定为特征。同时,利用杆状病毒表达系统在家蚕BmE细胞中高量表达NbRBL3,观察NbRBL3过量表达后对BmE细胞生长及增殖的影响,为下-步阐明NbRBL3在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的作用提供了参考。主要研究结果如下：1. NbRBL3的序列及转录特征分析NbRBL3由204个氨基酸构成,预测分子量为22.81kDa,等电点为7.86。NbRBL3的N端1～14位氨基酸为其信号肽,56-172位氨基酸为Ricin B-lectin结构域。预测翻译后修饰发现第168位的天冬氨酸为N-糖基化位点,此外,预测还发现了16个磷酸化位点和5个C端微体靶向信号。亚细胞定位预测发现NbRBL3无跨膜结构域,无GPI-膜锚定位点,而具有偏向胞外分泌的特征,暗示NbRBL3可能为分泌性蛋白。二级结构预测结果显示,该蛋白具有一个α螺旋,且该螺旋位于其信号肽区域,13个p折迭及15个无规则卷曲,这与典型的蓖麻毒素B链具有非常相似的结构。设计Nbrbl3基因的特异性PCR扩增引物,以感染家蚕微孢子虫1-10天的家蚕中肠为材料,RT-PCR分析结果表明感染家蚕微孢子虫后1～10天的材料中均能检测到Nbrbl3基因的转录。这暗示着Nbrbl3可能在家蚕微孢子虫侵染家蚕的过程中发挥着重要功能作用。2. NbRBL3的原核表达、抗体制备及免疫印迹分析以家蚕微孢子虫Nbrbl3基因为模板设计PCR扩增引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板进行PCR扩增和分子克隆,构建Nbrbl3的融合表达载体pKT30-Nbrbl3。转化大肠杆菌Rosetta菌株,诱导表达后获得了陔基因的重组蛋白,利用纯化的蛋白作为抗原免疫动物,制备了NbRBL3的多克隆抗体。玻璃珠震荡破碎法提取家蚕微孢子虫的总蛋白,利用制备的多克隆抗体为一抗进行Western blotting分析,结果发现在25kDa附近有一特异性条带,这表明在成熟家蚕微孢子虫中存在NbRBL3蛋白,但其较NbRBL3的理论分子量偏大,推测该蛋白可能存在翻译后修饰。3. NbRBL3的亚细胞定位为了检测家蚕微孢子虫成熟孢子内NbRBL3的表达分布特征,以纯化的成熟孢子进行间接免疫荧光分析(IFA),结果表明：灭菌水处理的孢子中没有荧光信号,2%SDS处理的孢子外周出现弥散荧光信号,而且经过1%Triton处理的孢子外周信号较强,经28℃、0.1MK2CO3处理的孢子中荧光信号变弱,经37℃、0.1MK2CO3处理6h后获得的孢壳中没有发现荧光信号。这表明NbRBL3蛋白可能位于成熟孢子的孢原质中,发芽后被分泌出孢原质。以纯化的成熟家蚕微孢子虫的孢壳为材料,提取孢壳蛋白,利用NbRBL3的抗体进行Western blotting分析,结果并未发现有杂交信号,而经0.1M K2CO3发芽处理获得的发芽液蛋白中,Western blotting检测发现在25kDa附近有一特异性条带。这进一步表明NbRBL3可能存在于成熟孢子的孢原质内,孢子发芽后可能被分泌到孢原质外。4.感染的家蚕BmE及血细胞中NbRBL3的检测基于家蚕微孢子虫成熟孢子中NbRBL3的定位信息,我们推测该蛋白为分泌蛋白。本研究以感染家蚕微孢子虫的BmE细胞及血细胞为材料,利用间接免疫荧光技术,以NbRBL3的鼠抗及兔抗对NbRBL3在感染细胞中的表达进行共定位。激光共聚焦结果显示,荧光信号除了分布于家蚕微孢子虫成熟孢子内部以外,还存在于家蚕细胞的细胞膜及核膜上。这一结果表明NbRBL3为外泌性蛋白,能够被分泌到宿主细胞的原生质体膜和核膜上从而发挥其生物学功能。收集感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞,裂解细胞后收集总蛋白上清液及沉淀。免疫印迹分析显示,在上清液中存在NbRBL3蛋白,这再次印证了NbRBL3作为一种分泌型蛋白在孢子侵染宿主细胞过程中发挥作用的结论。5. NbRBL3的功能初探本研究利用杆状病毒表达系统,将Nbrbl3基因克隆到斜纹银翅夜蛾核型多角体病毒转移载体pFastBacHTB上,将pFastBacHTB-Nbrbl3转化到DH1OBac感受态细胞,与Bacmid发生同源重组,最终获得重组转座子Bacmid-Nbrbl3;将构建的杆状病毒粒子感染家蚕BmE细胞,利用该系统在家蚕BmE细胞中获得可溶性分泌型重组蛋白NbRBL3,观察发现该蛋白高量表达能够导致家蚕BmE细胞的凝集。但这种凝集意味着什么,与NbRBL3发挥的功能作用有什么样的联系,还需要进一步研究。(本文来源于《西南大学》期刊2014-05-01）
潘耀宗,郁红礼,吴皓,陈叶青,王奎龙[8]（2014）在《掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用与巨噬细胞的相关性研究》一文中研究指出目的:探索掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白诱导炎症与巨噬细胞的相关性。方法:自掌叶半夏块茎中提取分离纯化掌叶半夏毒针晶与凝集素蛋白;采用SDS-PAGE凝胶电泳联合质谱分析鉴定凝集素蛋白;采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,以TNF-α和IL-1β为指标,研究掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白刺激巨噬细胞释放炎症因子的影响;采用扫描电镜法观察经掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激后巨噬细胞的形态变化;采用巨噬细胞-中性粒细胞体外共培养迁移模型,考察掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白分别刺激巨噬细胞对中性粒细胞迁移的影响。结果:掌叶半夏毒针晶和凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,巨噬细胞体积增大,伪足数量增加,细胞膜逐渐破裂。且两者体外均能显着诱导中性粒细胞迁移,其促迁移聚集作用与巨噬细胞释放炎症因子相关。结论:掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白诱导炎症与巨噬细胞介导密切相关。(本文来源于《第五届全国中医药博士生优秀论文专辑》期刊2014-04-19）
吉华松,魏京广,魏世娜,黄友华,黄晓红[9]（2013）在《斜带石斑鱼类C型凝集素蛋白的分子克隆和表达分析研究》一文中研究指出凝集素是非常重要的一类先天免疫因子,它参与病原体识别和细胞与细胞间的相互作用,而它的同源物也可能具有抗冻的功能。本文从斜带石斑鱼体内成功的克隆得到一种类C型凝集素基因(Ec-CTLP),其cDNA全长为905bp,含有522bp的开放性阅读框(ORF),编码174个氨基酸,其中包含一个19个氨基酸残基的信号肽序列,一个CLECT结构域和一个WND功能位点,与其他鱼类C型凝集素和冰结构蛋白的氨基酸序列的同源性在38%-70%。构建了重组载体pmal-c2x-11p,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达,SDS-PAGE检测结果显示其在预期目的蛋白处(61.5KD)有一明显的条带,表达产物经纯化后免疫B/C雄性小白鼠,制备了多克隆抗体,Western blottin9检测抗体的特异性和效价,其结果与预期结果相同。RT-qPCR枪测Ec-CTLP基因的组织分布情况,结果显示其在肝脏中表达量最大而在胃中表达量最小。构建了pEGFP-N3-EcLLP重组载体进行细胞内定位研究,结果显示Ec-CTLP基因主要分布在细胞质中。不同温度(16℃和4℃)刺激细胞后,收取不同时间点的细胞样品,经RT-qPCR检测Ec-CTLP在GS细胞中的表达量变化,结果显示低温时Ec-CTLP基因的表达量有不同程度的上调。对重组的石斑鱼类C型凝集素蛋白做了细菌(包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)保护实验,结果表明,细菌种存活率与重组行斑鱼类C型凝集素蛋白浓度呈正相关关系。这些结果将为行斑鱼C型凝集素的近一步研究奠定基础,也将有可能在遗传育种方面改善石斑鱼的抗寒能力。(本文来源于《热带海洋科学学术研讨会暨第八届广东海洋湖沼学会、第七届广东海洋学会会员代表大会论文及摘要汇编》期刊2013-05-01）
杜平平,黄兴奇,李定琴,余腾琼,程在全[10]（2012）在《苦参凝集素蛋白基因转化水稻的研究》一文中研究指出以水稻杂交品种‘云资粳41号’为受体材料,通过农杆菌介导法将苦参凝集素蛋白基因(SFL)导入水稻细胞,采用氯酚红法和PCR检测外源基因是否整合到水稻基因组中。结果显示:外源基因成功转入水稻基因组,并获得一批转基因水稻植株;转基因植株叶片离体接种稻瘟病菌的检测结果显示,转基因植株与对照(非转基因植株)相比有明显的抗性,证明SFL基因在水稻中得到表达。研究表明,基于SFL基因所具备的广谱抗菌作用,可以预期所得转基因水稻植株很可能对水稻的多种病原菌具有良好的抗性,为选育新的抗稻瘟病水稻新品种以及拓宽栽培稻抗病遗传基础增加抗稻瘟病基因奠定了基础。(本文来源于《西北植物学报》期刊2012年08期）
凝集素蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本试验采用质子化诱导处理黑芸豆(Phaseolus vulgaris L.)凝集素,将凝集素置于低于等电点(pI)的系列低pH环境中,对其进行质子化诱导,研究了凝集素结构变化与致敏性消减的构效关系,并进一步探究了质子化诱导处理后,溶液体系回调中性,对芸豆分离蛋白品质的影响。1、同源模建出芸豆凝集素的叁维结构,采用多种生物信息学工具预测出B和T细胞抗原表位,进一步通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、淋巴细胞增殖和细胞因子释放试验,对抗原表位进行体外验证,发现4个B细胞抗原表位(B1:NVNDNGEPTLSS、B2:VGSEPKDKGG、B3:NNYKYDSNAHT和B4:LYNVHWDPKPRH)和2个T细胞表位(T1:LQRDATVSS和T2:FNIDVPNNS),高疏水性正电荷性质的氨基酸残基在凝集素抗原表位构成中发挥重要作用。2、对芸豆凝集素进行质子化诱导处理,研究发现,凝集素结构在不同质子化条件,呈现逐渐展开的过程,并在8 h达到稳定状态。基于内/外源荧光光谱、SDS-PAGE、动态光散射(DLS)、分子排阻色谱(SEC)和差示扫描量热法(DSC)分析发现,质子化诱导可引起凝集素结构去折迭,甚至解聚,可能会掩埋、破坏或分裂凝集素表面抗原表位,并导致更多的凝集素胰蛋白酶酶切位点暴露。3、质子化诱导处理的芸豆凝集素与弗氏完全佐剂(CFA)混合乳化,连续腹腔注射致敏BALB/c小鼠5周,末次通过灌胃大剂量激发致敏。相对于Native组,经处理后的凝集素致敏的BALB/c小鼠致敏症状减轻、免疫球蛋白(IgE和IgG_1)、mMCPT-1、组胺和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ)含量均显着降低。圆二色谱(CD)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和分子动学(MD)模拟表明,质子化诱导可使凝集素α-螺旋含量显着降低,β-折迭含量升高,凝集素蛋白结构去折迭,更多的胰蛋白酶酶切位点暴露于蛋白表面。4、黑芸豆分离蛋白经质子化诱导处理8 h后,回调pH至中性(即质子化诱导还原处理),经冷冻干燥,得到芸豆蛋白粉。结构分析表明,经处理后的分离蛋白α-螺旋含量降低,β-折迭升高,分离蛋白结构解折迭,更多的疏水性氨基酸暴露,总-SH和游离-SH含量显着减少,二硫键(-S-S-)含量增加。功能性研究发现,处理后的分离蛋白,具有更高的乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)、起泡性(FC)和起泡稳定性(FS)、持油性(FHC)及凝胶性,而溶解性和持水性(WHC)降低。处理后的芸豆蛋白粉凝血活性和致敏性显着性降低,体外消化率明显改善。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
凝集素蛋白论文参考文献
[1].王卫.天南星科4种有毒中药凝集素蛋白促炎作用机制及炮制的影响[D].南京中医药大学.2019
[2].赵金龙.质子化诱导调控黑芸豆凝集素蛋白致敏性的构效关系研究[D].合肥工业大学.2019
[3].毛善虎,郁红礼,吴皓,王卫,李晓楠.掌叶半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞的致炎作用研究[J].中国中药杂志.2017
[4].郁红礼,毛善虎,赵腾斐,吴皓,潘耀宗.姜辣素拮抗半夏凝集素蛋白刺激巨噬细胞所致炎症因子TNF-α释放增加、ROS过量生成及RIP3表达增高[J].中国中药杂志.2015
[5].吴皓.天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性和炮制的影响[C].2014年全国中药炮制学术年会暨中药饮片创新发展论坛及协同创新联盟会议会议讲义.2014
[6].潘耀宗,郁红礼,吴皓,陈叶青,王奎龙.掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用与巨噬细胞的相关性研究[J].中华中医药杂志.2014
[7].齐晓冉.家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）功能基因组研究[D].西南大学.2014
[8].潘耀宗,郁红礼,吴皓,陈叶青,王奎龙.掌叶半夏毒针晶及凝集素蛋白的致炎作用与巨噬细胞的相关性研究[C].第五届全国中医药博士生优秀论文专辑.2014
[9].吉华松,魏京广,魏世娜,黄友华,黄晓红.斜带石斑鱼类C型凝集素蛋白的分子克隆和表达分析研究[C].热带海洋科学学术研讨会暨第八届广东海洋湖沼学会、第七届广东海洋学会会员代表大会论文及摘要汇编.2013
[10].杜平平,黄兴奇,李定琴,余腾琼,程在全.苦参凝集素蛋白基因转化水稻的研究[J].西北植物学报.2012