本文主要研究内容
作者王玲（2019）在《杜仲Dirigent蛋白编码基因EuDIR3克隆及遗传转化》一文中研究指出：杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）属于杜仲科杜仲属,为第三纪孑遗物种,其叶和树皮均可入药,是我国特有的传统中药材。杜仲富含多种药用功能成分。此外,杜仲还是重要的胶源植物。Dirigent蛋白不仅在植物次生代谢产物合成过程中发挥重要作用,还参与植物抗逆性。研究杜仲Dirigent基因可为杜仲的开发利用提供理论参考。本研究在本实验室前期构建杜仲基因组和转录组数据库基础上,克隆了一个杜仲Dirigent蛋白编码基因并定名为EuDIR3,对其进行遗传转化和表达分析研究。取得以下研究结果:1、EuDIR3基因克隆及序列分析以杜仲嫩叶为材料,提取其RNA并反转录成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,克隆得到杜仲Dirigent编码基因（EuDIR3）。该序列长351 bp,不含内含子,编码116个氨基酸;分析表明EuDIR3与咖啡、菠萝和蓖麻等同源性较高;系统发育树分析则表明EuDIR3基因与黄胡萝卜和菠萝等亲缘关系更接近,与梅花和樱花较远;该基因编码的Dirigent蛋白分子量为11.84 kD,理论等电点为4.66,属于不稳定疏水性蛋白;在细胞质、线粒体和细胞核中均有分布,其中在细胞质中分布最多（56.5%）;软件预测该蛋白有22个可能的磷酸化位点、没有信号肽且不含跨膜结构;二级结构分析显示该蛋白没有α螺旋,有6个β折叠,β折叠由7个无规则卷曲连接。2、EuDIR3基因空间表达模式为了解析EuDIR3基因的空间表达特征,本研究以杜仲EF1α（蛋白翻译延伸因子,Elongation factor 1 alpha）为内参基因,应用Real-time PCR技术对杜仲花期的树皮、雌花和叶以及幼苗的根、茎和叶中EuDIR3基因相对表达量进行分析。结果表明在开花期EuDIR3基因在杜仲树皮中的表达量显著高于在雌花和叶中的表达量;对于杜仲幼苗,该基因在叶中的表达量最高,其次是根和茎。推测该基因在花期对树皮的影响较大,而在幼苗时期对叶的影响较大。3、EuDIR3基因原核表达载体构建及表达以pET-28a-NAD1为初载体,利用一步克隆法成功构建了原核表达载体pET-28a-EuDIR3。将构建好的重组质粒pET-28a-EuDIR3转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,在21℃下以1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导12 h后,得到大量目的蛋白,该蛋白主要集中在沉淀,为包涵体。以15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定该重组蛋白,在相对分子质量约15 kD处检测到1条特异性蛋白条带,即为表达出的重组蛋白EuDIR3。4、EuDIR3基因植物表达载体构建及对杜仲的遗传转化以pGM626-Act1-EuABP2为初载体,利用一步克隆法成功构建了以Act1启动的EuDIR3表达元件、Bar::GUS为筛选标记基因的植物表达载体pGM626-Act1-EuDIR3。为了提高杜仲不定芽的获得率及生根率,选用B5、MS和WPM 3种培养基,以杜仲下胚轴为外植体,利用农杆菌介导pGM626-Act1-EuDIR3和pSH737-35S-EuDIR1遗传转化杜仲,并将浸染后的各外植体分别接种于3种不同培养基上,观察记录各培养基上外植体的生长情况,通过GUS染色检测和PCR验证统计得到阳性芽数。结果表明:转化质粒在B5、MS和WPM培养基上的平均出芽率分别为14.79±6.20%、7.68±2.37%和4.05±0.64%,相较于MS和WPM培养基,B5培养基上的愈伤组织生长旺盛,色泽鲜艳呈绿色,质地紧密脆嫩,平均出芽率显著高于另外2种培养基,但是WPM培养基的生根率显著高于另外两种培养基,WPM和B5培养基的生根率分别为53.85%和3.57%,在MS培养基上的阳性芽并未生根。因此,在杜仲遗传转化过程中,B5培养基更适于诱导不定芽,WPM培养基利于不定芽生根。
Abstract
du zhong （Eucommia ulmoides Oliver）shu yu du zhong ke du zhong shu ,wei di san ji jie wei wu chong ,ji xie he shu pi jun ke ru yao ,shi wo guo te you de chuan tong zhong yao cai 。du zhong fu han duo chong yao yong gong neng cheng fen 。ci wai ,du zhong hai shi chong yao de jiao yuan zhi wu 。Dirigentdan bai bu jin zai zhi wu ci sheng dai xie chan wu ge cheng guo cheng zhong fa hui chong yao zuo yong ,hai can yu zhi wu kang ni xing 。yan jiu du zhong Dirigentji yin ke wei du zhong de kai fa li yong di gong li lun can kao 。ben yan jiu zai ben shi yan shi qian ji gou jian du zhong ji yin zu he zhuai lu zu shu ju ku ji chu shang ,ke long le yi ge du zhong Dirigentdan bai bian ma ji yin bing ding ming wei EuDIR3,dui ji jin hang wei chuan zhuai hua he biao da fen xi yan jiu 。qu de yi xia yan jiu jie guo :1、EuDIR3ji yin ke long ji xu lie fen xi yi du zhong nen xie wei cai liao ,di qu ji RNAbing fan zhuai lu cheng cDNA,yi ci wei mo ban jin hang PCRkuo zeng ,ke long de dao du zhong Dirigentbian ma ji yin （EuDIR3）。gai xu lie chang 351 bp,bu han nei han zi ,bian ma 116ge an ji suan ;fen xi biao ming EuDIR3yu ga fei 、bo luo he bi ma deng tong yuan xing jiao gao ;ji tong fa yo shu fen xi ze biao ming EuDIR3ji yin yu huang hu luo bo he bo luo deng qin yuan guan ji geng jie jin ,yu mei hua he ying hua jiao yuan ;gai ji yin bian ma de Dirigentdan bai fen zi liang wei 11.84 kD,li lun deng dian dian wei 4.66,shu yu bu wen ding shu shui xing dan bai ;zai xi bao zhi 、xian li ti he xi bao he zhong jun you fen bu ,ji zhong zai xi bao zhi zhong fen bu zui duo （56.5%）;ruan jian yu ce gai dan bai you 22ge ke neng de lin suan hua wei dian 、mei you xin hao tai ju bu han kua mo jie gou ;er ji jie gou fen xi xian shi gai dan bai mei you αluo xuan ,you 6ge βshe die ,βshe die you 7ge mo gui ze juan qu lian jie 。2、EuDIR3ji yin kong jian biao da mo shi wei le jie xi EuDIR3ji yin de kong jian biao da te zheng ,ben yan jiu yi du zhong EF1α（dan bai fan yi yan shen yin zi ,Elongation factor 1 alpha）wei nei can ji yin ,ying yong Real-time PCRji shu dui du zhong hua ji de shu pi 、ci hua he xie yi ji you miao de gen 、jing he xie zhong EuDIR3ji yin xiang dui biao da liang jin hang fen xi 。jie guo biao ming zai kai hua ji EuDIR3ji yin zai du zhong shu pi zhong de biao da liang xian zhe gao yu zai ci hua he xie zhong de biao da liang ;dui yu du zhong you miao ,gai ji yin zai xie zhong de biao da liang zui gao ,ji ci shi gen he jing 。tui ce gai ji yin zai hua ji dui shu pi de ying xiang jiao da ,er zai you miao shi ji dui xie de ying xiang jiao da 。3、EuDIR3ji yin yuan he biao da zai ti gou jian ji biao da yi pET-28a-NAD1wei chu zai ti ,li yong yi bu ke long fa cheng gong gou jian le yuan he biao da zai ti pET-28a-EuDIR3。jiang gou jian hao de chong zu zhi li pET-28a-EuDIR3zhuai ru da chang gan jun BL21（DE3）jun zhu zhong ,zai 21℃xia yi 1 mmol/Lyi bing ji liu dai β-D-ban ru tang gan （IPTG）you dao 12 hhou ,de dao da liang mu de dan bai ,gai dan bai zhu yao ji zhong zai chen dian ,wei bao han ti 。yi 15%shi er wan ji liu suan na -ju bing xi xian an ning jiao dian yong （SDS-PAGE）jian ding gai chong zu dan bai ,zai xiang dui fen zi zhi liang yao 15 kDchu jian ce dao 1tiao te yi xing dan bai tiao dai ,ji wei biao da chu de chong zu dan bai EuDIR3。4、EuDIR3ji yin zhi wu biao da zai ti gou jian ji dui du zhong de wei chuan zhuai hua yi pGM626-Act1-EuABP2wei chu zai ti ,li yong yi bu ke long fa cheng gong gou jian le yi Act1qi dong de EuDIR3biao da yuan jian 、Bar::GUSwei shai shua biao ji ji yin de zhi wu biao da zai ti pGM626-Act1-EuDIR3。wei le di gao du zhong bu ding ya de huo de lv ji sheng gen lv ,shua yong B5、MShe WPM 3chong pei yang ji ,yi du zhong xia pei zhou wei wai zhi ti ,li yong nong gan jun jie dao pGM626-Act1-EuDIR3he pSH737-35S-EuDIR1wei chuan zhuai hua du zhong ,bing jiang jin ran hou de ge wai zhi ti fen bie jie chong yu 3chong bu tong pei yang ji shang ,guan cha ji lu ge pei yang ji shang wai zhi ti de sheng chang qing kuang ,tong guo GUSran se jian ce he PCRyan zheng tong ji de dao yang xing ya shu 。jie guo biao ming :zhuai hua zhi li zai B5、MShe WPMpei yang ji shang de ping jun chu ya lv fen bie wei 14.79±6.20%、7.68±2.37%he 4.05±0.64%,xiang jiao yu MShe WPMpei yang ji ,B5pei yang ji shang de yu shang zu zhi sheng chang wang cheng ,se ze xian yan cheng lu se ,zhi de jin mi cui nen ,ping jun chu ya lv xian zhe gao yu ling wai 2chong pei yang ji ,dan shi WPMpei yang ji de sheng gen lv xian zhe gao yu ling wai liang chong pei yang ji ,WPMhe B5pei yang ji de sheng gen lv fen bie wei 53.85%he 3.57%,zai MSpei yang ji shang de yang xing ya bing wei sheng gen 。yin ci ,zai du zhong wei chuan zhuai hua guo cheng zhong ,B5pei yang ji geng kuo yu you dao bu ding ya ,WPMpei yang ji li yu bu ding ya sheng gen 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自贵州大学的王玲，发表于刊物贵州大学2019-07-16论文，是一篇关于杜仲论文,克隆论文,表达分析论文,原核表达论文,遗传转化论文,贵州大学2019-07-16论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自贵州大学2019-07-16论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。