一、Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line（论文文献综述）
胡博[1]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中研究指明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
徐宾[2]（2021）在《Circ＿cse1l在结直肠癌中的表达及相关功能研究》文中研究表明第一部分:Circ＿cse1l在结直肠癌中的表达及意义目的:通过检测来源于CSE1l基因外显子环化所形成的circ＿cse1l（hsa＿circ＿0060745）在结直肠癌组织和正常的癌旁粘膜组织中以及在结直肠癌患者血清和正常人血清中的表达差异,进而分析circ＿cse1l的表达量与结直肠癌患者临床病理参数的关系。方法:1.于临床上取50例结直肠癌患者的肿瘤组织以及距离肿瘤组织约10cm以外的正常粘膜组织进行HE染色鉴别。2.利用circBanK以及qRT-PCR,琼脂糖电泳技术筛选来源于CSE1L基因的环状非编码RNA。3.利用qRT-PCR技术检测结直肠癌组织和正常粘膜组织,以及结直肠癌患者血清和正常人血清中circ＿cse1l的表达情况。4.进一步统计分析circ＿cse1l的表达量与结直肠癌患者临床病理参数的相关性。结果:1.利用qRT-PCR,琼脂糖电泳技术筛选CSE1L基因形成的环状RNA,确定circ＿cse1l（hsa＿circ＿0060745）作为研究对象通过检索circBan K数据库,结果发现CSE1L基因可形成多种环状RNA,针对其中12种环状RNA设计跨环化位点引物,并进行qRT-PCR检测,发现circ＿cse1l（hsa＿circ＿0060745）在结直肠癌组织中表达相对稳定,且表达量相对较高。所以选择其作为研究对象。2.Circ＿cse1l在结直肠癌组织和血清中的表达明显降低qRT-PCR检测结果发现,与对照组相比,circ＿cse1l在结直肠癌组织以及血清中的表达量均明显下降,且表达差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Circ＿cse1l的表达水平与肿瘤的浸润深度呈负相关利用t检验进一步分析circ＿cse1l表达量与结直肠癌患者临床病理资料之间的关系。发现circ＿cse1l的表达水平与肿瘤的浸润深度呈负相关关系（P<0.05）。与此同时发现,circ＿cse1l的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移、以及肿瘤的发生部位无明显相关性。小结:Circ＿cse1l在结直肠癌组织以及血清中的表达量明显降低,且其表达水平与肿瘤的浸润深度呈负相关,可在一定程度上评估结直肠癌患者的预后。第二部分:Circ＿cse1l对结直肠癌细胞株生物学行为的影响目的:通过在肿瘤细胞株中过表达circ＿cse1l,进而探究其对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭等方面能力的影响。方法:1.qRT-PCR技术检测circ＿cse1l在人正常结肠粘膜细胞系FHC,以及结肠癌细胞系HT29、HCT116及Lo Vo中的表达。2.利用质粒pcDNA3.1构建circ＿cse1l的过表达载体,进一步用Lipo8000TM转染试剂转染HT29、HCT116细胞系,qRT-PCR检测转染效率。3.CCK-8、平板克隆实验、划痕实验以及Transwell小室迁袭实验检测过表达circ＿cse1l后对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。结果:1.Circ＿cse1l在肿瘤细胞中的表达低于正常结肠粘膜上皮细胞Circ＿cse1l在肿瘤细胞系HT29、HCT116及Lo Vo中的表达均明显低于其在细胞系FHC中的表达,且差异有统计学意义（P<0.05）。2.在细胞系HT29、HCT116中成功过表达circ＿cse1l对过表达质粒转染的HT29、HCT116细胞进行检测,发现与对照组相比,过表达组中的circ＿cse1l的表达明显升高（P<0.05）。3.过表达circ＿cse1l可以抑制结直肠癌细胞的增殖能力CCK-8实验结果发现,与对照组相比,过表达circ＿cse1l后,HT29、HCT116细胞的增殖活力得到抑制。平板克隆实验则发现,过表达组的细胞克隆数明显减少（P<0.05）。以上实验表明circ＿cse1l可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖能力。4.过表达circ＿cse1l可以抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力细胞划痕实验结果表明:与对照组相比,过表达组细胞生长缓慢,细胞生长迁移能力得到抑制。Transwell实验结果表明:与对照组相比,过表达circ＿cse1l可以明显抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力（P<0.05）。小结:Circ＿cse1l在肿瘤细胞中的表达低于正常结肠粘膜上皮细胞,通过在HT29、HCT116细胞系中过表达circ＿cse1l,发现过表达circ＿cse1l可显着抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。第三部分:Circ＿cse1l抑制结直肠癌细胞增殖的分子机制目的:探究circ＿cse1l可能的抑制结直肠癌细胞增殖的分子机制。方法:1.Western blot检测过表达circ＿cse1l后,HT29及HCT116细胞系中增殖相关蛋白PCNA的表达。2.利用数据库Circ Interactome预测circ＿cse1l的可能的结合蛋白。3.RNA-binding protein immunoprecipitation（RIP）以及qRT-PCR验证circ＿cse1l和EIF4A3的结合。4.RNA-binding protein immunoprecipitation（RIP）、qRT-PCR以及琼脂糖电泳检测过表达circ＿cse1l后,在EIF4A3抗体沉淀的RNA-蛋白复合物中PCNA的m RNA水平表达情况。结果:1.过表达circ＿cse1l可以下调PCNA蛋白的表达通过Western blot检测过表达circ＿cse1l后,HT29、HCT116细胞中PCNA的表达情况,结果发现:与对照组相比,过表达circ＿cse1l后可以下调PCNA的蛋白表达（P<0.05）。2.EIF4A3是circ＿cse1l的结合蛋白通过利用数据库Circ Interactome预测,并进一步利用RNA-binding protein immunoprecipitation（RIP）验证,证实EIF4A3是circ＿cse1l的结合蛋白,两者存在相互关系。3.Circ＿cse1l通过与EIF4A3结合下调PCNA的表达与对照组相比,过表达circ＿cse1l后,在EIF4A3抗体沉淀的RNA-蛋白复合物中PCNA的m RNA表达水平降低,且差异具有统计学意义（P<0.05）。小结:Circ＿cse1l可能是通过下调PCNA的表达,来抑制结直肠癌细胞的增殖能力。此外证实EIF4A3是circ＿cse1l的结合蛋白,circ＿cse1l可能是通过结合EIF4A3,进而下调了PCNA的表达。结论:1.Circ＿cse1l在结直肠癌组织、血清以及结直肠癌细胞系中的表达量降低,其表达水平与肿瘤的浸润深度呈负相关,可在一定程度上评估结直肠癌患者的预后。2.过表达circ＿cse1l可显着抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。3.Circ＿cse1l可能是通过与EIF4A3的结合,下调了PCNA表达水平,进而抑制了结直肠癌细胞的增殖能力。
杨小进[3]（2020）在《长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究》文中认为目的:结直肠癌是世界范围内最常见的第三种肿瘤类型,也是全球癌症相关致死的第四大因素。结直肠癌对人类健康构成了极大的威胁。结直肠癌的发病机制仍不明确,普遍认为是环境因素和基因遗传共同长期作用的结果。研究显示KRAS等多种肿瘤致病基因的突变、P53等抑癌基因突变和表观遗传学修饰、信号通路调节异常、非编码RNA对基因表达的多层面调控等多种因素均与结直肠癌的发生发展相关。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是非编码RNA的主要类型,是一种至少包含200个核苷酸且不编码蛋白的RNA,通过基因表达调控在结直肠癌的许多生物学过程中发挥着重要作用。LncRNA-DANCR被证明在多种肿瘤中扮演原癌基因的作用,但其在结直肠癌中的生物学功能和机理不清楚。方法:我们依托所在医院收集了 20对结直肠癌旁正常组织和癌组织,以及84个包含病人5年生存期的结直肠癌组织,然后利用RNA-FISH对结直肠癌组织和癌旁组织中DANCR的表达情况进行了检测。在此基础上,我们依据DANCR的表达情况对DANCR与病人预后的相关性进行了统计分析。我们利用定量PCR对正常人结直肠上皮细胞和多株结直肠癌肿瘤细胞中DANCR的表达情况进行了检测,并利用RNA-FISH对DANCR在结直肠癌细胞中的分布情况进行了检测。为研究DANCR对结直肠癌细胞生长的调控作用,我们利用慢病毒介导的shRNA特异性的敲除SW480和HCT15细胞中DANCR的表达,然后在细胞水平利用CCK-8实验、克隆形成实验、流式凋亡检测和Hoechst染色对细胞的增殖能力、克隆形成和凋亡情况进行了检测。在动物水平的研究中,我们利用稳定敲除DANCR的SW480和HCT15细胞分别建立了皮下移植瘤模型,然后绘制肿瘤生长曲线,统计肿瘤重量。在明确DANCR促进结直肠癌生长的作用的基础上,我们利用western blotting对稳定敲除DANCR的SW480和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、cyto C、Bcl-2 和 Bcl-xL 的表达情况进行了检测;并利用免疫组化染色对SW480和HCT15皮下移植瘤组织中Caspase 3、p53和cyto C的表达情况进行了检测。结果:1)DANCR在结直肠癌组织中高表达,且与病人预后负相关:在对20对结直肠癌组织和癌旁正常组织的RNA-FISH染色结果表明DANCR在结直肠癌组织中显着高表达;DANCR在结直肠癌肿瘤细胞中高表达,且主要表达在细胞浆中;进一步的生存期分析表明DANCR高表达的结直肠癌病人常伴随更差的5年生存期。2)敲除DANCR通过促进细胞凋亡发生抑制结直肠癌细胞生长:利用慢病毒介导的shDANCR稳定感染SW480和HCT15细胞能显着抑制SW480和HCT15细胞中DANCR的表达;稳定敲除DANCR的表达在细胞水平上能显着抑制结直肠癌增殖和克隆形成,促进结直肠癌细胞凋亡发生;稳定敲除DANCR的表达在动物水平能通过促进结直肠癌皮下移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的发生抑制结直肠癌细胞皮下移植瘤的生长。3)敲除DANCR促进线粒体相关凋亡蛋白和p53蛋白的表达:敲除DANCR促进 SW480 和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Caspase 3阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中p53蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多p53阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中Cyto C蛋白的表达,同时抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Cyto C 阳性的细胞。结论:DANCR在结直肠癌组织中高表达,其表达情况与结直肠癌病人的良好预后呈显着负相关。DANCR主要定位于结直肠癌细胞的胞浆中,敲除DANCR的表达能通过促进线粒体相关凋亡的发生来抑制结直肠癌细胞的生长。以上研究表明DANCR是一个结直肠癌治疗和预后的潜在靶点。
杨晓燕[4]（2020）在《MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究》文中提出背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤,位于全球第三大癌症死亡原因。胃癌具有发病隐匿和早期症状不明显等特点,多数患者首诊时疾病已进入进展期,且伴有淋巴结或远处器官的转移,这已成为胃癌防治的难点。因此,通过各种研究技术和手段深入研究胃癌发生、发展、转移以及耐药的分子机制,寻找早期诊断的分子标志物以及药物靶标已迫在眉睫。最近的研究表明,非编码RNAs参与了肿瘤转移和恶性转化的过程。MiR-4295是一个新发现的微小RNA（microRNA）分子,通过生物信息学分析,我们发现miR-4295与lncRNA HOTAIR存在结合位点。因此,我们的研究就从非编码RNAs入手,研究微小RNA（miR-4295）和长链非编码RNA（lncRNA HOTAIR）在胃癌生长增殖和侵袭迁移中的功能及其机制。第一部分miR-4295通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中及胃癌组织中miR-4295的表达情况。构建miR-4295真核质粒过表达载体及其抑制剂载体（miR-4295 inhibitor）;采用瞬时转染法将构建好的载体转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中miR-4295的表达。CCK-8法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡率的影响;平板克隆法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞克隆能力的影响;划痕实验检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。采用生物信息学软件miRanda、TargetScan、Pictar2、RNAhybrid、miRDB、RNA22-HAS、Targetminer、EMBL-EBI、miRWalk、DIANA-microT、mirbridge、miRNAMap和PITA在线预测miR-4295的靶基因。结合DAVID与KOBAS对miR-4295的靶基因进行GO分析及KEGG信号通路分析,分析miR-4295在胃癌细胞生物学过程中可能的分子机制。通过STRING在miR-4295的潜在靶基因中筛选出蛋白作用网络（protein-protein interaction,PPI）起关键作用的核心基因（hub gene）。通过TCGA数据库GEPIA对miR-4295靶向hub gene在胃癌中的相关性及其与胃癌患者的生存分析。利用qRT-PCR、Western blot检测miR-4295的靶基因及PI3K/AKT信号通路中相关基因的表达水平。最后采用双荧光素酶报告系统实验对miR-4295的靶基因进一步验证,明确目的miR-4295与其靶基因在胃癌中的关系。结果:1.胃癌细胞和组织中miR-4295表达水平检测。qRT-PCR结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.832±0.120、2.421±0.187、1.328±0.102、1.000±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.962±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系miR-4295表达水平均升高,以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着;31例胃癌患者中,与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中miR-4295表达显着上调80.6%（25/31）;miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤大小及远端转移相关具有显着性（p<0.05）,而与胃癌患者的年龄、性别、组织学分级及淋巴结转移无显着相关性（p>0.05）。2.构建miR-4295过表达质粒载体和和miR-4295 inhibitor质粒载体。测序结果显示,重组的miR-4295及其inhibitor序列插入准确无误,说明重组的miR-4295和miR-4295 inhibitor质粒载体构建成功。qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平,结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着上调（p<0.05）;miR-4295inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂组细胞增殖活力显着降低（p<0.05）。4.流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂处理胃癌细胞后的凋亡率。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂处理的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着增加（p<0.05）。5.平板克隆形成实验检测转染后胃癌细胞的克隆能力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着减少（p<0.05）。6.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:上调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移间距小（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移间距大（p<0.05）。7.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移和侵袭数显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）;相较于miR-4295,miR-4295联合AKT inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。8.miR-4295的潜在功能及其机制。通过14个预测软件,结果共筛选出15353个miR-4295候选靶基因。选取同时由7个生物软件预测阳性结果,共选出600个miR-4295靶基因进行后续GO、pathway分析及靶基因分子网络分析。GO功能富集分析,结果显示24条信号通路显着富集于生物学过程中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）。KEGG信号通路分析,结果显示miR-4295靶基因显着富集于23条信号通路信息（p<0.01）。miR-4295靶基因蛋白互作（PPI）网络,共筛出15个hub genes,包括CUL3、PPARG、UBE2D1、FMR1、SUV39H1、RAB5A、AGO4、RNF2、PTEN、RUNX2、KMT2A、ITPKB、ESR1、DICER1和LDLR。miR-4295 hub gene PTEN与BCL2L11具有显着相关性。利用生物信息学软件预测miR-4295与PTEN及BCL2L11 3’UTR靶位点情况,结果显示:PTEN 3’UTR靶位点位于其3’UTR 412-418 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU;BCL2L11 3’UTR靶位点位于其3’UTR4093-4099 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU。PTEN 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的PTEN 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-PTEN-3’UTR与psiCHECK2-PTEN-mut-3’UTR重组质粒构建成功;BCL2L11 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的BCL2L11 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明GV272-BCL2L11-3’UTR与GV272-BCL2L11-mut-3’UTR重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组,PTEN 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合PTEN 3’UTR,抑制其表达;PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的PTEN 3’UTR结合,不能抑制其表达;PTEN3’UTR+miR-4295共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明PTEN 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因PTEN 3’UTR并抑制其表达。相较于BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组,BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合BCL2L11 3’UTR,抑制其表达;BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的BCL2L11 3’UTR结合,不能抑制其表达;BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明BCL2L11 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因BCL2L11 3’UTR并抑制其表达。采用qRT-PCR检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因及其相关基因mRNA表达的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着降低（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着增加（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异。采用Western blot检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因PTEN、BCL2L11及其相关蛋白表达水平的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着降低,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着上调,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。第二部分lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中HOTAIR的表达情况。通过基于TCGA与GTEx公共数据库的GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析HOTAIR在408例胃癌中的表达水平。化学合成siHOTAIR,采用瞬时转染法将构建好的siHOTAIR转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中HOTAIR的表达;CCK-8法检测siHOTAIR对胃癌细胞增殖活力的影响;划痕实验检测siHOTAIR对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测siHOTAIR对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。利用信息学软件UCSC（Version 2009）和StarBase v2.0预测miR-4295与HOTAIR的结合位点;采用双荧光素酶报告基因系统实验检测验证miR-4295与HOTAIR的位点结合情况。结果:1.胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28）分别进行HOTAIR表达水平分析。qRT-PCR检测结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.000±0.1000、0.370±0.040、0.280±0.030、0.310±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.190±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系HOTAIR表达水平均升高。以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着。利用GEPIA分析HOTAIR在胃癌组织中的表达比正常胃粘膜组织中的表达显着升高。2.将siHOTAIR与siNC分别瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测HOTAIR的表达水平。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）。4.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移间距大（p<0.05）。5.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。6.StarBase v2.0 software预测miR-4295与HOTAIR位点结合情况,结果显示,HOTAIR结合位点序列（5’-3’）为UUGCACU。HOTAIR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的HOTAIR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-HOTAIR与psiCHECK2-HOTAIR-mut重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于HOTAIR+miR-NC共转染组,HOTAIR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,且差异具有统计学意义,说明miR-4295能够结合HOTAIR;HOTAIR mut+miR-NC共转染组与HOTAIR mut+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的HOTAIR结合。以上结果说明miR-4295能够直接结合HOTAIR。结论:1.miR-4295、HOTAIR在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和胃癌组织中均高表达,miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤体积大小及远端转移呈正相关。2.miR-4295可促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移,而下调miR-4295的表达可抑制胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移;miR-4295联合AKT抑制剂能够降低胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,增加胃癌细胞凋亡率。3.PTEN、BCL2L11是miR-4295的直接靶基因;上调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加;下调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低。4.下调HOTAIR可抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移,且发现miR-4295与HOTAIR存在结合位点。
管智慧[5]（2020）在《lncRNA NCK1-AS1异常表达对前列腺癌的影响与分子机制的研究》文中认为前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是男性常见的恶性肿瘤之一,其发生发展与外在环境因素、内在细胞因素均密切相关。随着基因测序研究的展开,非编码区RNA在转录基因中的比重得到越来越多研究者重视。长的非编码核糖核酸（LncRNA）是非编码区RNA的一种,参与人体中包括癌症转移、侵袭、细胞分化及调亡等多种生理和病理过程。尽管其不能直接翻译成蛋白,但可在转录、转录后水平、表观遗传学、细胞分化等多层面调控基因的表达。lncRNA NCK1-AS1是在多种癌症异常表达的lncRNAs之一,在肿瘤的增殖、转移等生物学功能中扮演重要角色。多种LncRNA可以与TGF-β1信号通路蛋白相互作用从而影响肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、甚至耐药等过程。然而,1ncRNA NCK1-AS1在前列腺癌中的临床作用和潜在生物学功能尚不为人知。因此,本研究旨在探究lncRNA NCK1-AS1异常表达对前列腺癌的作用与分子机制。本论文由以下三部分组成:第一部分:NCK1-AS1区别PCa患者与BPH患者目的:探索NCK1-AS1在PCa、BPH患者及健康男性血清中的表达情况。方法:①分别采集前列腺癌PCa患者（n=60）,良性前列腺增生（BPH）患者（n=58）和健康男性（n=60）的血浆,通过荧光定量qRT-PCR法检测各组研究对象的NCK1-AS1,并通过单向ANOVA和Tukey检验分析表达数据。②依据NCK1-AS1的mRNA水平进行ROC曲线分析,以评估血浆NCK1-AS1对PCa的诊断价值。以PCa患者被用作真阳性病例,良性前列腺增生患者为真阴性病例,绘制受试者工作特征（ROC）曲线。以PCa患者被用作真阳性病例,以健康男性为真阴性病例,绘制ROC曲线。③根据患者的临床资料,分析NCK1-AS1的表达与患者Gleason评分和临床分期关系。结果:①PCa组的NCK1-AS1血浆水平显着高于其他两组,差异有统计学意义（p<0.05）。BPH患者和健康男性之间没有显着差异（p>0.05）。②以PCa患者被用作真阳性病例,BPH患者为真阴性病例,ROC曲线下面积（AUC）为0.95,标准误差为0.017,95%置信区间为0.92-0.99。以PCa患者被用作真阳性病例,以健康男性为真阴性病例,曲线下面积AUC为0.95,标准误差为0.018,95%置信区间为0.92-0.98。③随着Gleason评分的增加,NCK1-AS1水平略有增加,但无统计学意义（p>0.05）。随着临床分期增加,NCK1-AS1水平略有增加,其中III期的变化最为明显,但统计学分析表明,结果无统计学意义（p>0.05）。结论:血浆NCK1-AS1能够有效地将前列腺癌患者与良性前列腺增生及健康男性很好的区分开来,具有成为前列腺癌诊断标志物的潜在临床应用价值。由于NCK1-AS1水平不能很好地反映前列腺癌的临床分期,其作为前列腺癌术后的预后指标尚需要进一步研究。第二部分:NCK1-AS1异常表达对PCa细胞的影响目的:探讨过表达NCK1-AS1的DU145和22Rv1前列腺癌细胞株的迁移能力及侵袭能力的影响。方法:①荧光实时定量PCR检测DU145、22Rv1和RWPE-1细胞中NCK1-AS1的表达水平;②构建过表达NCK1-AS1的DU145和22Rv1细胞,分别用Transwell法检测DU145、22Rv1细胞与过表达NCK1-AS1的DU145、22Rv1细胞迁移能力（不含基质胶）与侵袭能力（含基质胶）。结果:①DU145细胞中NCK1-AS1的表达水平为RWPE-1细胞2.7倍,22Rv1细胞中NCK1-AS1的表达水平为RWPE-1细胞3.3倍（p<0.05）。②过表达NCK1-AS1的DU145、22Rv1细胞迁移能力显着高于DU145、22Rv1细胞,以及转染空载体的DU145、22Rv1细胞（NC组）,结果差异有统计学意义（p<0.05）。侵袭能力检测结果显示,相比于DU145、22Rv1细胞,以及转染空载体的DU145、22Rv1细胞（NC组）过表达NCK1-AS1的DU145、22Rv1细胞侵袭显着提高,结果差异有统计学意义（p<0.05）。结论:NCK1-AS1在前列腺癌细胞DU145、22Rv1中均有高表达,且明显高于前列腺正常细胞;过表达NCK1-AS1的DU145、22Rv1细胞的迁移能力及侵袭能力均强于正常的DU145、22Rv1细胞,NCK1-AS1可促进前列腺癌细胞的侵袭。第三部分:NCK1-AS1通过TGF-β1调节PCa细胞目的:探讨TGF-β1在NCK1-AS1促进PCa细胞侵袭中的作用。方法:①采用酶联免疫吸附ELISA法检测PCa患者血浆中的转化生长因子-β1（TGF-β1）。通过线性回归分析PCa患者血浆中TGF-β1和NCK1-AS1的相关性。②采用ROC曲线分析血浆TGF-β1对PCa的诊断价值。以PCa患者被用作真阳性病例,BPH患者为真阴性病例,绘制ROC曲线;以PCa患者被用作真阳性病例,以健康男性为真阴性病例,绘制ROC曲线。③构建NCK1-AS1和TGF-β1过表达载体,分别用蛋白印迹法和RT-PCR法检测过表达NCK1-AS1的DU145和22Rv1细胞中TGF-β1的蛋白水平、mRNA水平。RT-PCR法检测NCK1-AS1和TGF-β1过表达DU145和22Rv1细胞中NCK1-AS1水平。④分别用Transwell法检测过表达NCK1-AS1和TGF-β1细胞的迁移与侵袭能力。结果:①TGF-β1和NCK1-AS1呈显着正相关（p<0.05）。②以PCa患者被用作真阳性病例,BPH患者为真阴性病例,绘制ROC曲线,统计学分析曲线下面积AUC为0.96（标准误差:0.017;95%置信区间:0.92-0.99）。以PCa患者被用作真阳性病例,以健康男性为真阴性病例,绘制ROC曲线,统计学分析曲线下面积AUC为0.93（标准误差:0.019;95%置信区间:0.91-0.97）。③相比于对照组或转染空载体的细胞,NCK1-AS1过表达的PCa细胞中TGF-β1在mRNA和蛋白水平均显着上调,结果差异有统计学意义（p<0.05）。相比于对照组或转染空载体的细胞,TGF-β1过表达PCa细胞中的NCK1-AS1无显着性差异（p>0.05）。④过表达NCK1-AS1和TGF-β1细胞DU145和22Rv1细胞的侵袭力和迁移增加,结果差异有统计学意义（p<0.05）。用TGF-β抑制剂SB431542处理24小时后,过表达NCK1-AS1的细胞迁移与侵袭能力减弱,结果差异有统计学意义（p><0.05）。结论:血浆NCK1-AS1在PCa患者与PCa细胞中特异性上调,通过调节TGF-β1促进PCa癌细胞迁移与侵袭。
吴思奇[6]（2020）在《Y染色体上的长链非编码RNA编码的微肽在男性食管癌发生发展过程中的作用与机制研究》文中认为研究背景与研究目的:食管鳞状细胞癌是食管癌的主要亚型,在中国发病率排名第三且侵袭性极高,其发病率具有显着的性别差异:男性患者的数量为女性患者的二至四倍。而对这种性别差异的研究还处于比较匮乏的状态。在外界因素中,男性比较明显的特征包括吸烟、饮酒等不良嗜好,而传统观点上也将造成食管鳞状细胞癌发病率的性别差异的原因归结到这些方面。从内在的角度上看,男性与女性在激素层面和基因层面都有着显着的差异,而这些内在因素是如何导致食管鳞状细胞癌的性别差异的尚不清楚。在人类基因组中,只有1%-2%的区域包含着编码蛋白质的基因,绝大部分区域的转录产物为非编码RNA（non-coding RNA）,而在非编码RNA中,有一种被称作LncRNA（long non-coding RNA）的类型,其长度超过200个核苷酸,在近年来受到广泛的关注。LncRNA与人类多种疾病都相关联,在肿瘤研究领域,大量研究表明LncRNA通过染色体修饰、表观遗传修饰、转录调控、可变剪接调控等方式参与到肿瘤的发生发展过程中。尽管如此,具有性别差异表达的LncRNA是否导致了食管鳞状细胞癌的性别差异尚不清楚。因此,我们有必要对具有性别差异表达的LncRNA在食管癌发生发展过程中的作用及其分子机制进行研究和探索。研究方法:（1）深入分析一个包含179对食管鳞状细胞癌组织的表达谱芯片,从而鉴定男性患者特异性表达的Y染色体连锁差异表达LncRNA。（2）收集来自中国东部和中国南部双中心的食管鳞状细胞癌组织及其对应癌旁组织（共计569对）进行实时荧光定量PCR分析,从而对表达谱芯片分析结果进行验证。（3）通过生物信息学分析和免疫印迹法对LncRNA的编码性进行预测和验证。（4）通过CRISPR/Cas9、慢病毒转导等技术构建细胞敲除、敲降、过表达模型。（5）通过异种移植瘤模型分析LncRNA及其编码的微肽的作用。（6）RNA甲基化免疫共沉淀、RNAPulldown、RNA凝胶迁移实验、免疫印迹法和DNA甲基化分析共同分析吸烟及LncRNA的RNA甲基化修饰在食管鳞状细胞癌中的作用机制。（7）通过联合使用免疫共沉淀实验和液相色谱法-质谱联用分析鉴定LncRNA编码的微肽的靶蛋白及其作用机制。（8）通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）的数据分析及染色质免疫共沉淀实验、双荧光报告基因实验等方法分析LncRNA编码的微肽对下游信号通路的影响。（9）通过免疫组化分析、流式细胞术、TUNEL分析、CCK-8实验等手段对LncRNA编码的微肽在食管鳞状细胞癌中的作用机制进行深入研究。（10）通过细胞模型和异种移植瘤模型对LncRNA编码的微肽的抗癌作用进行探索。研究结果:通过生物信息学分析和双中心样本的实时荧光定量PCR验证,我们发现了一个男性食管鳞状细胞癌患者特异性的、Y染色体连锁的低表达LncRNA—LINC00278,并发现其与食管鳞状细胞癌的预后显着相关。LINC00278能够编码一个结合于YY1蛋白上的微肽YY1BM,其作用为抑制YY1与AR的结合,从而抑制它们共同调控的基因eEF2K的转录。在食管鳞状细胞癌组织和细胞中低表达的YY1BM导致了 eEF2K的高表达,抑制了癌细胞在营养缺乏条件下的凋亡,从而使得癌细胞具有更强的生存能力。在这个调控过程中,吸烟可通过减少LINC00278的m6A修饰进一步减少YY1BM的翻译,从而参与到食管鳞状细胞癌的发生发展过程中。同时,人工合成的YY1BM具有生物活性,对男性食管鳞状细胞癌具有抑制作用。研究结论:我们的研究鉴定了一个在男性食管鳞状细胞癌中将AR相关通路和吸烟联系在一起的Y染色体连锁长链非编码RNA—LINC00278,其特殊的作用机制是造成食管鳞状细胞癌性别差异的原因之一,且其编码的微肽具有作为抗癌药物的潜力。
郑晓[7]（2020）在《环状RNA circPPP1R12A在结肠癌进展中的作用及其机制研究》文中研究说明目的:结肠癌（colon cancer）是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均位于第三。由于诊断的滞后及肿瘤的转移和复发,在中国,结肠癌五年生存率仅为31%。因此,进一步研究和揭示结肠癌的未知生物学机制,寻找结肠癌治疗的新靶点,具有重要的临床意义。随着新一代测序技术的迅速发展,越来越多的转录本被发现。非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）与大多数转录本一样,由于在生物体中缺乏明显的开放阅读框（open reading frames,ORFs）而不能被翻译成蛋白质。环状RNA（circular RNA,circRNAs）是一类由上游剪接受体和下游剪接供体组成的circRNAs分子,近年来被报道在真核生物中广泛分布。由于circRNAs的丰富和稳定,某些circRNAs可以通过作为miRNA的内源竞争性吸附RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）或蛋白结合RNA,调控基因的转录和翻译,从而广泛地调节生物学活动。研究发现多种circRNAs可以编码蛋白质调控肿瘤的进展。然而,在结肠癌发生发展过程中是否存在蛋白编码的circRNAs仍然尚未明确,其功能产物亦仍不明确。本研究采用circRNAs芯片进行结肠癌组织和癌旁组织中circRNAs表达谱分析,筛选差异表达的circRNAs,并探索circRNAs的潜在多肽表达功能及在结肠癌发生发展过程中的分子调控机制,旨为结肠癌的靶向治疗提供新的思路。方法:利用Human Arraystar circRNA芯片,筛查10对新近收集的结肠癌组织及癌旁组织中显着差异表达的circRNAs,并通过定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase reaction,qRT-PCR）验证显着上调的 10种circRNAs在结肠癌和癌旁组织中的差异。随后,通过qRT-PCR和原位杂交（in situ hybridization,ISH）进一步验证最显着上调的circRNA在结肠癌组织和结肠癌细胞株中的表达差异。经组分qRT-PCR和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）验证circRNA的亚细胞分布后,通过慢病毒介导的稳定上调和下调,构建circRNA稳定过表达和下调的结肠癌细胞株。通过CCK8、细胞划痕和侵袭实验评估circRNA对结肠癌细胞株生物学功能的影响。通过生物信息学分析,评估circRNA的蛋白编码能力,并通过Flag标记和蛋白质谱进一步验证。通过构建蛋白编码位点突变的circRNA过表达载体,进一步体外和体内实验验证circRNA编码的蛋白对结肠癌细胞株生物学功能的影响。通过illumina RNA-seq表达谱进一步分析,circRNA编码的蛋白对结肠癌细胞转录表达谱的影响,选择可能的信号通路进一步验证。通过结肠癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）共培养体系,评估circRNA编码的蛋白对TAMs细胞极化的影响。通过制备特异性识别circRNA编码蛋白的抗体和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）板,评估circRNA编码的蛋白在结肠癌患者血清中的表达及临床意义。结果:在10对结肠癌组织/癌旁组织中筛选出差异表达最明显的circRNAs（110个高表达、16 个低表达,fold change>1.5,P<0.05）。其中 hascirc0000423（circPPP1R12A）在癌组织中上调表达最为显着（P<0.001）。通过Convergent引物和Divergent特异性引物以及抗RNase R酶降解实验,证实circPPP1 R12A在结肠癌细胞中的存在。circPPP1R12A在结肠癌患者组织中显着高表达,并且circPPP1R12A相对高表达的患者,预后更差。通过核/胞浆组分分离及荧光原位杂交（FISH）检测发现,circPPP1R12A主要存在于结肠癌细胞的胞浆中。通过构建circPPP1R12A稳定过表达的结肠癌细胞株,发现circPPP1R12A过表达促进结肠癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,并且显着促进细胞的迁移和侵袭能力;另一方面,circPPP1R12A沉默显着抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。进一步研究发现,circPPP1R12A可以编码一段73个氨基酸（amino acid,aa）大小的蛋白（circPPP1R12A-73aa）,通过体外和体内实验证明circPPP1R12A对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的生物学功能的调控作用依赖于其编码的circPPP1R12A-73aa蛋白对Hippo-YAP1信号通路的激活。此外,我们发现circPPP1R12A-73aa除了在细胞内调控结肠癌细胞功能外,亦可以分泌至胞外,参与调控结肠癌肿瘤免疫微环境中TAMs的M2型极化,维持免疫抑制性的肿瘤微环境。最后,通过比较结肠癌患者和健康志愿者血清中circPPP1R12A-73aa蛋白含量,我们发现结肠癌患者血清circPPP1R12A-73aa的表达水平明显高于正常对照组。血清circPPP1R1 2A-73aa作为分子标记物,在结肠癌的诊断中具有较高的敏感度和特异度,与血清CEA表达水平呈显着正相关。结论:本研究阐明了在结肠癌中呈显着高表达的circPPP1R12A一方面通过编码蛋白circPPP1R12A-73aa,激活Hippo-YAP1信号通路,促进结肠癌细胞增殖和转移。另一方面,circPPP1R12A-73aa可以调控结肠癌肿瘤免疫微环境中TAMs的M2型极化,维持肿瘤抑制性的免疫微环境。血清circPPP1R12A-73aa可作为潜在的新型分子标记物,为结肠癌的筛查、诊断和治疗提供新思路和新方法。
白易[8]（2020）在《肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:本研究旨在探索Ras同源基因家族成员A（Rashomologgene family,member A,RhoA）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者中的mRNA和蛋白表达水平,并探讨RhoA对肝癌的诊断价值和预后意义。实验方法:基于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库比较肝脏正常组织和癌组织中RhoA的mRNA和蛋白质水平差异。用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中的数据建立RhoA相关的预后模型,并在两个基因表达汇编（Gene Expression Omnibus,GEO）队列中进行外部验证。分别采用实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）方法对北京协和医院（Peking Union Medical College Hospital,PUMCH）标本进行基因和蛋白定量分析。建立了基于RhoA蛋白水平的诊断模型。通过Xena浏览器网络工具对肝癌中RhoA的组织学类型、体细胞突变、拷贝数变异、基因表达和DNA甲基化进行可视化。通过相关分析确定临床特征与RhoA基因表达的关系。以TCGAHCC mRNA表达数据为基础,采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）方法对高RhoA水平组和低RhoA水平组的主要京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路进行富集分析。高RhoA水平组主要富集在溶酶体、致病性大肠杆菌感染、嘌呤代谢和嘧啶代谢等信号通路,而RhoA低水平组则主要富集Hedgehog信号传导、亚油酸代谢、嗅觉转导和味觉转导等信号通路。实验结果:肝癌组织中RhoA mRNA和蛋白的表达明显高于正常组织。mRNA和蛋白水平的高表达与较差的预后相关。基于蛋白水平的诊断模型具有较高的敏感性（92.5%）和特异性（90.0%）。RhoA的表达主要受拷贝数变异的调控,而与甲基化修饰弱相关。实验结论:RhoA在HCC组织中普遍上调,其在mRNA和蛋白水平的表达与预后不良有关。值得注意的是,RhoA蛋白表达水平可以作为HCC的诊断生物标志物。研究背景:长非编码RNA（Longnoncoding RNA,lncRNA）的异常表达在肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）等生物学领域引起了越来越多的关注。实验方法:在本研究中,我们从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中获取了371例肝癌组织和50例正常组织中的lncRNA、小RNA（microRNA,miRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的表达谱数据,并鉴定了肝癌进展相关的特异性差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG;log fold change≥2,FDR<0.01）。我们不仅分析了这些DEG之间的相互作用,而且还分析了lncRNA的核质定位（细胞质、细胞核或两者均有）。然后,在排除了仅位于细胞核内的lncRNA后,构建了一个HCC相关的失调ceRNA网络,并进一步对该网络进行生存分析、多因素Cox回归和LASSO分析,最后构建一个基于ceRNA网络中13条lncRNA表达水平的风险评分系统,评估其在预测HCC患者生存时间方面的效能。实验结果:我们从TCGA队列中筛选了特异性差异表达的753条lncRNA,97条miRNA和1535条mRNA,根据彼此之间的互作关系构建了一个主要存在于细胞质中的由37条lncRNA,10条miRNA和26条mRNA组成的HCC相关的失调ceRNA网络。生存分析表明其中15条lncRNA,3条miRNA和16条mRNA与肝癌患者的总生存期显着相关（P<0.01）。通过多因素Cox回归和LASSO分析,我们进一步构建了基于13条lncRNA的风险评分系统,该系统对HCC患者生存时间具有良好的判别和预测能力。实验结论:这种基于lncRNA分布的ceRNA网络构建方法,不仅缩小了目标lncRNA的研究范围,而且为评估HCC的预后提供了特异的候选分子生物标志物,这将有助于我们增加对参与HCC早期发展的ceRNA机制的理解。研究背景:热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）在调节多个关键癌基因方面具有重要作用,因此被认为是一个潜在的癌症治疗药理学靶点,可能使包括肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）在内的多个癌种患者获益。然而,安全性问题限制了常规HSP90抑制剂的临床应用。因此,亟待开发一种新的方法来靶向HSP90或者其下游精确的促进癌变的蛋白。实验方法:通过对肝癌组织和配对的癌旁正常组织进行全转录组测序,筛选出差异表达的长非编码RNA（Long noncoding RNA,LncRNA）。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的HCC数据库中发现肺癌相关转录物1（Lung cancer associated transcript 1,LUCAT1）在HCC中的表达及其在判断预后中的临床作用,并在北京协和医院（Peking Union Medical College Hospital,PUMCH）的HCC患者队列中进一步验证。通过RNAscope和核质分离RNA qPCR,我们明确了LUCAT1的亚细胞定位。通过CCK8、细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭实验探索了LUCAT1在HCC进展中的作用。用CHIRP-MS实验发现了 HSP90与LUCAT1之间的相互作用,用蛋白质印迹实验（Western blot,WB）和RNA结合蛋白免疫共沉淀实验进一步验证了HSP90与LUCAT1之间的相互结合作用。我们通过核质分离蛋白WB和免疫荧光分析深入探究了 LUCAT1对HSP90的调控作用。为寻找二者之间具体的结合位点,我们使用了RNA pull down实验。免疫共沉淀实验验证了磷酸化-信号传导及转录激活蛋白 3（Signal transducer and activator of transcription3,STAT3）与HSP90之间的互作。通过体外实验对体内动物模型进行了验证。实验结果:LUCAT1是一种由肝癌中氧化应激诱导的细胞核内lncRNA,它可通过特异的位点（575-767）与HSP90结合,富集HSP90在核内的积聚继而维持STAT3的持续磷酸化。功能性获得及敲降实验表明,LUCAT1在体内和体外均能促进肝癌细胞生存、增殖和侵袭。实验结论:我们的实验结果表明上调的LUCAT1促进了肝癌的发生。此外,靶向LUCAT1的ASO可特异性消除HSP90在HCC中致癌作用而不影响其正常生理功能。
汪文杰[9]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中认为背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
张晓云[10]（2020）在《circZNF609在结直肠癌中的表达及参与细胞凋亡功能的研究》文中指出第一部分CircZNF609在结直肠癌组织及血清中的表达目的:探究CircZNF609在结直肠癌患者癌组织和血清中的表达是否存在差异。方法:1.将4%多聚甲醛固定的组织进行脱水、包埋、切片,之后进行HE染色;2.提取组织及血清RNA、反转录、RT-PCR检测并验证CircZNF609在结直肠患者癌组织和血清中的表达水平。结果:首先,针对CircZNF609设计特异性的扩增引物,证实CircZNF609在结直肠组织中存在表达。收集45例结直肠癌患者术后结直肠癌组织及癌旁正常组织标本,检测CircZNF609在癌组织及癌旁正常组织中表达,结果显示结直肠癌组织中CircZNF609的表达显着低于癌旁正常组织（P<0.05）。进一步结合患者临床病理参数分析,结果显示CircZNF609的表达与肿瘤直径密切相关（P<0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤分化、肿瘤形态、血管及神经浸润等临床病理因素无关。此外,患者血清检测结果表明结直肠癌患者血清中CircZNF609的表达低于健康体检人群（P<0.05）。结论:cir c ZNF609在结直肠癌癌组织中表达水平下降。CircZNF609在结直肠癌患者血清中表达水平下降,可以作为潜在的结直肠癌诊断生物分子标志物。第二部分CircZNF609参与结直肠癌细胞凋亡的发生目的:探究CircZNF609对CRC细胞生物学行为的影响,及其在结直肠癌发生发展过程中可能发挥的作用。方法:1.分子克隆技术构建circ Z NF609重组质粒;2.使用Lipofectamine 2000转染CircZNF609重组质粒,在细胞中过表达CircZNF609;3.提取细胞RNA、反转录、RT-PCR检测并验证CircZNF609的表达水平。4.CCK8实验检测细胞活力;5.平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;6.Western blot检测相关蛋白的变化;7.流式细胞术检测细胞凋亡。结果:CircZNF609在HCT116和HT29人结肠癌细胞中的表达显着低于正常结直肠粘膜细胞FHC（P<0.05）,且H CT116细胞中降低最为明显。CCK8实验结果显示与空载体组相比,过表达CircZNF609后可显着抑制HCT116细胞增殖活力（P<0.05）,且细胞克隆数目显着减少（P<0.05）。空载体对照组和过表达CircZNF609组两组PCNA蛋白和c-Myc蛋白的表达均没有显着变化。过表达CircZNF609后HCT116细胞发生凋亡的数目较对照组显着升高（P<0.05）。结论:c irc ZNF609在结直肠癌细胞系HCT116和HT29中表达水平下调。过表达CircZNF609不影响HCT116细胞PCNA和c-Myc蛋白的表达。过表达cir c ZNF609促进HCT116细胞发生细胞凋亡。第三部分CircZNF609促进细胞凋亡的分子机制目的:探究CircZNF609促进细胞凋亡发生的可能分子机制。方法:1.使用Lipofectamine 2000转染CircZNF609重组质粒,在细胞中过表达ci rc ZNF609;2.提取细胞RNA、反转录、RT-PCR检测相关RNA的表达水平。3.Western blot检测相关蛋白的变化。4.细胞免疫荧光染色观察蛋白质间的共定位。结果:与空载体对照组相比,过表达CircZNF609组HCT116细胞中Bax蛋白表达显着上调（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达显着下调（P<0.05）。进一步观察,过表达CircZNF609组HCT116细胞中p53蛋白表达显着上调（P<0.05）,然而p53 m RNA水平无明显变化（P>0.05）。检测Mdm-2蛋白的表达结果显示,过表达CircZNF609组HCT116细胞中Mdm-2蛋白表达显着下调（P<0.05）。细胞免疫荧光结果显示,过表达cir c ZNF609组中Mdm-2和p53蛋白的共定位强度较空载体对照组相比显着减少。结论:CircZNF609促进HCT116细胞中p53蛋白的表达,但不影响p53 m RNA的表达水平。CircZNF609抑制HCT116细胞中Mdm-2蛋白的表达。CircZNF609抑制Mdm-2和p53蛋白的结合。
二、Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）Circ＿cse1l在结直肠癌中的表达及相关功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 Circ_cse1l在结直肠癌中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Circ_cse1l对结直肠癌细胞株生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Circ_cse1l抑制结直肠癌细胞增殖的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 环状RNA在相关恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 慢病毒制备及感染细胞 |
| 2.3.3 RNA提取 |
| 2.3.4 RNA的质量检测 |
| 2.3.5 定量PCR实验 |
| 2.3.6 蛋白提取 |
| 2.3.7 BCA蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 细胞增殖活性检测 |
| 2.3.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.11 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.12 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.3.13 皮下移植瘤实验 |
| 2.3.14 TUNEL实验 |
| 2.3.15 免疫组化实验 |
| 2.3.16 FISH染色(细胞爬片) |
| 2.3.17 FISH染色(结直肠癌组织) |
| 2.3.18 siRNA瞬时转染 |
| 2.3.19 质粒瞬时转染 |
| 2.3.20 统计分析 |
| 实验结果 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌中高表达 |
| lncRNA-DANCR表达情况与结直肠癌进展相关 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌细胞中高表达,定位于胞浆中 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞凋亡的发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌皮下移植瘤生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤中细胞凋亡发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制调控结直肠癌细胞中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达调控结直肠癌皮下移植瘤组织中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结直肠癌相关长链非编码RNA研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（4）MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-4295 通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究 |
| 第1章 miR-4295在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA的提取、质量和完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.3 胃癌组织中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.4 miR-4295与胃癌临床病理特征相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 miR-4295对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miR-4295阳性克隆的测序结果 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平 |
| 2.3.3 miR-4295表达水平改变对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.4 划痕及Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.5 Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295的潜在靶基因筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miR-4295潜在靶基因的功能通路和蛋白分子互作(PPI)网络关系 |
| 3.3.2 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene在胃癌中的相关性分析 |
| 3.3.3 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene与胃癌患者的生存分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 miR-4295促进胃癌细胞增殖和侵袭转移的分子机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295 分别与PTEN及BCL2L11基因的靶向调控关系 |
| 4.3.2 q RT-PCR检测靶基因m RNA及其下游基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.3 miR-4295对PTEN蛋白及其下游蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.4 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞迁移的影响 |
| 4.3.7 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第二部分 lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究 |
| 第1章 lncRNA HOTAIR在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA提取、质量及完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中HOTAIR表达水平检测 |
| 1.3.3 HOTAIR在 TCGA数据库胃癌组织中表达情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 lncRNA HOTAIR对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中HOTAIR的表达水平 |
| 2.3.2 下调HOTAIR对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.3 划痕及Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.4 Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295与lncRNA HOTAIR相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295与HOTAIR的结合情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（5）lncRNA NCK1-AS1异常表达对前列腺癌的影响与分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分: NCK1-AS1区别PCA患者与BPH患者 |
| 1. 研究对象与材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: NCK1-AS1异常表达对前列腺癌细胞的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: NCK1-AS1通过TGF-B1调节PCA细胞 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA与前列腺癌的最新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（6）Y染色体上的长链非编码RNA编码的微肽在男性食管癌发生发展过程中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验细胞株 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 临床组织样本 |
| 5.1.4 双荧光报告基因载体 |
| 5.1.5 慢病毒表达载体 |
| 5.1.6 CRISPR/Cas9载体 |
| 5.1.7 实验仪器及试剂 |
| 5.1.7.1 实验仪器 |
| 5.1.7.2 实验试剂 |
| 5.1.8 常用试剂配方 |
| 5.1.8.1 磷酸盐缓冲液(PBS) |
| 5.1.8.2 SDS-PAGE分离胶 |
| 5.1.8.3 SDS-PAGE浓缩胶 |
| 5.1.8.4 10XSDS电泳缓冲液 |
| 5.1.8.5 10X转膜缓冲液 |
| 5.1.8.6 10XTBS缓冲液 |
| 5.1.8.7 1XTBST缓冲液 |
| 5.1.8.8 1XTBSTx缓冲液 |
| 5.1.8.9 3%BSA封闭液 |
| 5.1.8.10 5XTBE电泳缓冲液 |
| 5.1.8.11 50XTAE电泳缓冲液 |
| 5.1.8.12 20XSSC缓冲液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 食管鳞状细胞癌表达谱芯片分析 |
| 5.2.2 RNA提取 |
| 5.2.3 RNA逆转录 |
| 5.2.4 实时荧光定量PCR |
| 5.2.5 Northern blot |
| 5.2.6 细胞核质分离实验 |
| 5.2.7 RNA探针荧光原位杂交(RNA FISH)实验 |
| 5.2.8 开放阅读框预测 |
| 5.2.9 免疫印迹实验 |
| 5.2.10 翻译组学数据分析 |
| 5.2.11 免疫荧光染色实验 |
| 5.2.12 人源肿瘤异种移植模型 |
| 5.2.13 多核糖体图谱(polysome profiling)实验 |
| 5.2.14 异种移植瘤模型的构建 |
| 5.2.15 RNA免疫共沉淀实验(RIP) |
| 5.2.16 RNA凝胶迁移实验(RNA-EMSA) |
| 5.2.17 免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 5.2.18 RNA Pulldown实验 |
| 5.2.19 ChIP-seq数据分析 |
| 5.2.20 染色质免疫共沉淀实验 |
| 5.2.21 双荧光报告基因实验 |
| 5.2.22 CCK-8实验 |
| 5.2.23 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 5.2.24 免疫组化实验 |
| 5.2.25 TUNEL检测 |
| 5.2.26 营养剥夺实验 |
| 5.2.27 数据统计分析 |
| 结果 |
| 6.1 第一部分:LINC00278及其编码的微肽在男性食管鳞状细胞癌样本和细胞系中的表达验证及其对预后的影响 |
| 6.1.1 男性食管鳞状细胞癌相关LncRNA的筛选及鉴定 |
| 6.1.2 LINC00278的表达量与男性食管鳞状细胞癌患者的预后相关 |
| 6.1.3 LINC00278低表达和吸烟共同导致更为不良的预后 |
| 6.1.4 LINC00278的生物学特性 |
| 6.1.5 LINC00278具有编码微肽的能力 |
| 6.1.6 LINC00278-sORF1编码能力的验证 |
| 6.1.7 内源性LINC00278-sORF1的检测 |
| 6.1.8 LINC00278主要通过LINC00278-sORF1抑制肿瘤生长 |
| 6.2 第二部分:LINC00278的m~6A修饰对男性食管鳞状细胞癌发生发展的影响及作用机制 |
| 6.2.1 LINC00278的m~6A修饰能够促进LINC00278-sORF1的翻译 |
| 6.2.2 LINC00278m~6A修饰的相关蛋白鉴定 |
| 6.2.3 吸烟能够通过调节LINC00278的m6A修饰来影响LINC00278-sORF1的翻译 |
| 6.3 第三部分:LINC00278编码的微肽通过调控YY1和AR抑制男性食管鳞状细胞癌细胞凋亡的作用机制 |
| 6.3.1 LINC00278-sORF1能够抑制YY1与AR的相互作用 |
| 6.3.2 YY1能够与AR共同促进eEF2K的转录 |
| 6.3.3 YY1BM通过eEF2K通路削弱男性食管鳞状细胞癌细胞在营养剥夺的环境下的生存能力 |
| 6.3.4 食管鳞状细胞癌的异种移植瘤和组织样本中YY1BM的表达与细胞凋亡呈正相关 |
| 6.4 第四部分:LINC00278编码的微肽对男性食管鳞状细胞癌肿瘤的抑制作用研究 |
| 讨论 |
| 7.1 第一部分:LINC00278及其编码的微肽在男性食管鳞状细胞癌样本和细胞系中的表达验证及其对预后的影响 |
| 7.2 第二部分:LINC00278的m~6A修饰对男性食管鳞状细胞癌发生发展的影响及作用机制 |
| 7.3 第三部分:LINC00278编码的微肽通过调控YY1和AR抑制男性食管鳞状细胞癌细胞凋亡的作用机制 |
| 7.4 第四部分:LINC00278编码的微肽对男性食管鳞状细胞癌肿瘤的抑制作用研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA的研究进展 |
| 前言 |
| LncRNA简介 |
| LncRNA研究的进程 |
| LncRNA的种类 |
| LncRNA的作用机制 |
| 转录前调控 |
| 转录调控 |
| 转录后调控 |
| LncRNA参与可变剪接 |
| LncRNA调控mRNA稳定性 |
| LncRNA调控蛋白质的稳定性 |
| LncRNA调控蛋白质的翻译 |
| LncRNA作为microRNA的分子海绵 |
| LncRNA作为蛋白质的分子诱饵 |
| LncRNA翻译微肽并与蛋白质结合 |
| LncRNA与个体发育和细胞分化 |
| LncRNA与神经退行性疾病 |
| LncRNA与肿瘤 |
| 抑癌LncRNA |
| NBAT-1 |
| GAS5 |
| NORAD |
| LincRNA-p21 |
| 致癌LncRNA |
| H19 |
| HOTAIR |
| LUNAR1 |
| MALAT1 |
| NEAT1 |
| PVT1 |
| CCAT1/CCAT2 |
| PCAT-1 |
| LncRNA与肿瘤治疗 |
| 转录后水平上的LncRNA靶向治疗 |
| RNAi |
| ASO |
| 应用CRISPR/Cas9技术编辑LncRNA |
| 靶向反义链RNA上调抑癌基因 |
| LncRNA的空间阻断 |
| 小分子抑制剂 |
| LncRNA启动子疗法 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文 |
| 附录: 中英文缩略语对照表 |
（7）环状RNA circPPP1R12A在结肠癌进展中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 一、非编码RNA (non-coding RNAs,ncRNAs) |
| 二、环状RNA与结肠癌 |
| 三、Hippo-YAP信号通路与结肠癌 |
| 四、肿瘤相关巨噬细胞与结肠癌 |
| 参考文献 |
| 第一部分 环状RNA circPPP1R12A在结肠癌中的表达及临床意义 |
| 一、研究背景 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、研究结论 |
| 六、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 环状RNA circPPP1R12A在结肠癌细胞中的功能 |
| 一、研究背景 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、研究结论 |
| 六、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 环状RNA circPPP1R12A通过蛋白编码调控结肠癌细胞功能的分子机制 |
| 一、研究背景 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、研究结论 |
| 六、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 环状RNA circPPP1R12A编码的蛋白circPPP1R12A-73aa对结肠癌肿瘤免疫微环境的调控作用 |
| 一、研究背景 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、研究结论 |
| 六、讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 环状RNA circPPP1R12A编码的蛋白circPPP1R12A-73aa在结肠癌患者血清中的表达及临床意义 |
| 一、研究背景 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、研究结论 |
| 六、讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 环状RNA调控肿瘤细胞生物学功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TAMs在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录一 结肠癌患者病例资料(组织) |
| 附录二 结肠癌患者病例资料(血清) |
| 附录三 主要缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 攻读博士期间主持和参与的科研项目 |
| 致谢 |
（8）肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 RhoA在肝细胞癌诊断和预后中的作用 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生物信息学数据挖掘与处理 |
| 2.2 基于北京协和医院样本的实验验证 |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HPA中RhoA的mRNA和蛋白质表达谱 |
| 3.2 RhoA基因表达在肝癌患者中的预后作用 |
| 3.3 RhoA表达与性别相关 |
| 3.4 RhoA的mRNA和蛋白质表达验证 |
| 3.5 基于RhoA蛋白质水平的肝癌诊断模型 |
| 3.6 RhoA表达受基因扩增调控以及相关的KEGG通路富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 补充 |
| 第二部分 基于ceRNA网络分析得到的与肝细胞癌进展及预后相关的长非编码RNA |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据来源与加工 |
| 2.2 识别差异表达基因 |
| 2.3 构建ceRNA网络 |
| 2.4 DEmRNA的功能和信号通路分析 |
| 2.5 生存分析 |
| 2.6 构建风险评分系统 |
| 2.7 单因素与多因素Cox回归分析 |
| 2.8 DElncRNA和DEmRNA的回归分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 差异表达的lncRNA,miRNA和mRNA |
| 3.2 预测miRNA靶向的lncRNA |
| 3.3 预测miRNA靶向的mRNA |
| 3.4 lncRNA的细胞内定位和ceRNA网络 |
| 3.5 GO和KEGG富集分析 |
| 3.6 ceRNA网络相关基因的生存分析 |
| 3.7 构建lncRNA相关的风险评分系统 |
| 3.8 lncRNA和mRNA之间的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 补充 |
| 附录 |
| 第三部分 LUCAT1通过募集HSP90入核维持STAT3的磷酸化以促进HCC进展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物信息学数据挖掘和处理 |
| 2.2 北京协和医院队列的外部实验验证 |
| 2.3 细胞系培养 |
| 2.4 RNA提取,逆转录和qPCR |
| 2.5 siRNA或ASO转染 |
| 2.6 FFPE和细胞载玻片的RNAscope |
| 2.7 细胞核和细胞质RNA的提取和定量 |
| 2.8 慢病毒质粒的构建及稳定过表达细胞系的筛选 |
| 2.9 细胞增殖与凋亡的动态观察 |
| 2.10 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.11 细胞凋亡检测 |
| 2.12 细胞周期监测 |
| 2.13 细胞侵袭试验 |
| 2.14 LUCAT1顺式调控基因的鉴定及共表达分析 |
| 2.15 CHIRP-MS鉴定LUCAT1的潜在RNA结合蛋白 |
| 2.16 蛋白提取和蛋白印迹实验 |
| 2.17 内源性RNA结合蛋白免疫共沉淀分析 |
| 2.18 分别提取细胞核与细胞质中的蛋白质 |
| 2.19 免疫荧光实验 |
| 2.20 免疫共沉淀 |
| 2.21 体外转录实验和RNA pull down |
| 2.22 患者来源的肿瘤异种移植模型的建立及体内实验 |
| 2.23 免疫组织化学 |
| 2.24 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LUCAT1在HCC中上调并与氧化应激相关 |
| 3.2 作为一个独立预后因素,LUCAT1高表达的HCC患者预后较差 |
| 3.3 LUCAT1的细胞核定位提示反义寡核苷酸可作为其抑制剂 |
| 3.4 抗LUCAT1的ASO对HCC有很强的治疗潜力 |
| 3.5 肝癌中HSP90是LUCAT1的结合蛋白 |
| 3.6 LUCAT1改变HSP90在细胞内的分布,并维持STAT3的高磷酸化水平 |
| 3.7 PDX动物模型的体外验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 综述 LncRNA的分类和功能以及在肝癌中作为生物标志物,调控因子和药物靶点的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 LncRNA的产生和分类 |
| 3 LncRNA的功能 |
| 4 LncRNA作为肝癌诊断和预后生物标志物 |
| 5 LncRNA在主要肝癌信号通路中的功能和分子机制 |
| 5.1 LncRNA对肝癌Wnt/β-catenin信号通路的调控 |
| 5.2 LncRNA对肝癌JAK/STAT信号通路的调控 |
| 5.3 LncRNA对肝癌EMT过程的调控 |
| 5.4 LncRNA调控肝癌的其它机制 |
| 6 基于lncRNA靶点的肝癌治疗 |
| 7 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）circZNF609在结直肠癌中的表达及参与细胞凋亡功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 CircZNF609 在结直肠癌组织及血清中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CircZNF609 参与结直肠癌细胞凋亡的发生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CircZNF609 促进细胞凋亡的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 circRNA及其在消化道肿瘤中的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Construction of the Antisense Eukaryotic Vector for Proliferating Cell Nuclear Antigen Gene and Its Expression in Bladder Cancer EJ Cell Line（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [2]Circ＿cse1l在结直肠癌中的表达及相关功能研究[D]. 徐宾. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究[D]. 杨小进. 苏州大学, 2020(06)
- [4]MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究[D]. 杨晓燕. 南华大学, 2020
- [5]lncRNA NCK1-AS1异常表达对前列腺癌的影响与分子机制的研究[D]. 管智慧. 苏州大学, 2020(06)
- [6]Y染色体上的长链非编码RNA编码的微肽在男性食管癌发生发展过程中的作用与机制研究[D]. 吴思奇. 苏州大学, 2020(06)
- [7]环状RNA circPPP1R12A在结肠癌进展中的作用及其机制研究[D]. 郑晓. 苏州大学, 2020(06)
- [8]肝癌诊断和预后生物标志物的筛选策略及治疗靶点机制研究[D]. 白易. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [10]circZNF609在结直肠癌中的表达及参与细胞凋亡功能的研究[D]. 张晓云. 河北医科大学, 2020(01)