马丽君1刘婷1李海2李玉奎1（通讯作者）
（1宁夏医科大学总医院干细胞研究所宁夏银川750004）
（2宁夏医科大学总医院结直肠外科宁夏银川750004)
【摘要】目的：从人结直肠肿瘤组织中分离培养CD47阳性肿瘤细胞并研究其免疫学特性。方法：无血清培养法对原代培养细胞进行筛选培养，采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞，流式细胞仪分选出细胞表面标记CD47阳性的细胞亚群；分离正常人外周血T淋巴细胞经PHA活化，实验分为3组：①空白对照组，②与CD47阳性肿瘤细胞(1:10)共培养组，③抗CD47单克隆抗体组（1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml）；MTT法检测培养72h后各组T细胞的增殖水平，ELISA法测定各组细胞培养液中IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达量。结果：三例原代培养的肿瘤细胞在无血清培养基中能够形成肿瘤球并获得可持续传代的克隆细胞；能够形成肿瘤球的原代培养细胞中CD47阳性细胞所占比例分别为99.8%，97.2%和99.9%；与活化的人T淋巴细胞共培养，加入（10μg/ml和20μg/ml）抗CD47单克隆抗体组比CD47阳性细胞组T细胞具有较强的增殖能力（P＜0.05），20μg/ml浓度组与10μg/ml浓度组比较无统计学差异（P＞0.05）；ELISA检测CD47阳性细胞组培养液中IFN-γ含量较空白对照组明显降低（P＜0.05），而IL-12、TNF-α的表达量与空白对照组比无明显差异（P＞0.05）。结论：人结直肠肿瘤CD47阳性细胞亚群能抑制活化的T淋巴细胞增殖并抑制其释放IFN-γ，为结直肠癌的靶向治疗提供实验依据。
【关键词】结直肠肿瘤；CD47；免疫逃逸
【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）14-0060-03
ImmunologicalCharacteristicsofCD47+TumorStemCellsinHumanColorectalCarcinoma
MALi-jun1，LIU-Ting1，LI-Hai2，LIYu-kui1，
(1.NingxiaHumanStemCellInstitute,theGeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,P.R.China;2.SurgicalDepartmentofColon,theGeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,P.R.China)
【Abstract】ObjectiveToisolateCD47+coloncancercellsfromhumancolorectalcarcinomaandstudytheimmunologicalcharacteristicsinvitro.MethodsPrimarycolorectalcarcinomacellswereculturedinserumfreeconditionswhichgiverisepreferentiallytoself-renewalstemcellspheres.TheexpressionofCD47wasanalyzedbyflowcytometry.PeripheralbloodTlymphocytesandCD47+cellswereco-culturedwiththeindicatedantibodiesthroughinvitroMTTassay.TheexpressionsofIL-12、IFN-γ、TNF-αineachgroupwereanalyzedbyELISAassay.ResultsThreeprimarycolorectalcarcinomacellsgrewintotumorspheres.TheCD47expressionsofeachcloneare99.8%，97.2%and99.9%.TheproliferationofperipheralbloodTlymphocytesoftheexperimentalgroups(10and20μg/mL)increasedsignificantlycomparedwiththeCD47+tumorcellgroup(P＜0.05).Statisticalanalysisshowedthatnosignificantdifferencewasfoundbetweenthetwogroups(10and20μg/mL)(P＞0.05).ELISAResultsshowedthattheconcentrationofIFN-γof10μg/mLgroupdecreasedsignificantly.ConclusionsCD47+colorectalcancercellshaveimmuneescape.ThemechanismisrelatedtoreducingIFN-γofTlymphocytes.
【Keywords】Colorectalcancer;CD47;Immuneescape
CD47分子又称整合素相关蛋白，是一种50kD的多次跨膜糖蛋白，在机体的各种细胞及组织上均有表达。属于免疫球蛋白（Ig）超家族的成员，CD47分子通过与其配体相互作用对机体发挥着重要的调控作用，如参与调节中性粒细胞(polymorphonuelearneutrophiles，PMN)的趋化、粘附、吞噬和迁移，有助于宿主产生炎症反应抗感染；促进血小板活化、聚集，肿瘤细胞和平滑肌细胞的趋化与扩散。最近肿瘤干细胞研究发现，膀胱肿瘤干细胞表达高水平的表面抗原CD47，并且膀胱肿瘤干细胞通过CD47的表达，抑制人体免疫系统对其的吞噬作用，并在动物实验证明，阻碍CD47对吞噬细胞的抑制作用可导致肿瘤生长抑制[1]，说明CD47的表达是膀胱癌细胞躲过人体免疫系统的机制之一，这一机制是否在结直肠肿瘤的发生与转移中存在是目前尚待回答的问题。
本研究将对人结直肠肿瘤组织中分离培养的肿瘤干细胞CD47阳性细胞群与人外周血单个核细胞来源的T淋巴细胞共培养，ELISA法测定培养液中IL-12、IFN-γ、TNF-α等免疫蛋白表达的变化以阐明CD47阳性细胞群在结直肠肿瘤生成与转移的免疫学特性，为临床治疗提供依据。
1.材料与方法
1.1临床资料
实验样本来源于宁夏医科大学总医院2009年结直肠外科手术标本，术前与患者签订标本使用知情同意书。
1.2主要试剂与仪器
DMEM、F12、HEPES、EGF、N2、胎牛血清均购于GIBCO；bFGF（R&D），鼠抗人CD47单克隆抗体、人IgG1-PE同型对照抗体购于BD公司，流式细胞仪（FACS，Caliber，美国BD），MTT和PHA购于美国sigma公司；IL-12、IFN-γ、TNF-αELISAkit（R&D）。
1.3结直肠肿瘤细胞的原代培养
结直肠肿瘤组织标本取自病理鉴定为肠腺癌的实体肿瘤组织。术中在无菌条件下取结直肠癌患者肿瘤组织标本。用眼科剪将组织反复剪切至1mm3的小块；加入胶原酶37℃水浴1小时，每10分钟充分震摇试管一次；离心(700rpm、4min)，弃上清；加入适量的含血清培养基（取DMEM培养基46mL，F12培养基46mL，向DMEM/F12混合培养基中加入5mLFBS，10?L200μg.mL-1的EGF，10?L100μg/mL的bFGF，100?L1000×ITS配成含50%DMEM，50%F12，5%FBS，1%Anti-Anti，1%PenStrep，1%HEPES，bFGF终浓度为10ng/mL，EGF终浓度为20ng/mL及ITS终浓度为1×的溶液）培养细胞；第二天观察细胞状态，若状态良好5～7天后换液并进行常规传代冻存培养。
1.4肿瘤细胞的无血清培养
将培养的原代肿瘤细胞消化后以2×102/mL种于培养皿中，培养基采用无血清培养基（DMEM50%，F1250%，1×N2，葡萄糖6mg/mL，1×谷氨酰胺，NaHCO31mg/mL，1×HEPES，1×Anti-Anti，1×PenStrep，肝素4μg/mL，人血清白蛋白0.5%，10ng/mLbFGF，20ng/mLEGF），细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养。每3～4天换液1次，连续观察细胞生长情况。
1.5流式细胞术检测
对原代培养细胞及克隆细胞进行流式分析，将细胞悬液计数并离心(80g,4min)，以105个/500?LPBS重悬细胞于流式管中，每管中加入相应的荧光标记抗体10μl，并设置同型对照，室温避光孵育15min后PBS洗涤一次，加500?LPBS重悬后上机检测。
1.6外周血单个核细胞的分离及T淋巴细胞的活化与培养
在无菌条件下采集健康成人外周血20ml，按1:1的比例与0.9%生理盐水混合后，加到淋巴细胞分离液上层，常温2100×g离心30min，取白膜层细胞(外周血单个核细胞层)，加入10ml生理盐水中洗涤，室温1000×g离心10min，重复洗涤3次，弃上清，再经尼龙毛柱获得T淋巴细胞。用RPMI1640完全培养基调整细胞密度至1×105/ml，培养液中加入PHA10μg/ml，接种于6孔培养板，2ml/孔，37℃、5%CO2培养箱培养，备细胞功能试验用。
1.7细胞功能实验
制备人CD47阳性肿瘤细胞单细胞悬液，调整细胞密度至1×106个/mL接种于上述备实验用的T细胞中。分别加入鼠抗人CD47单克隆抗体（1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml）培养72h后，收集T细胞和上清液进行MTT和ELISA检测。
1.8CD47阳性肿瘤细胞的免疫学特性研究
ELISA法测定培养液中IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达量。
1.9统计学分析
所有数据采用SPSS13.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-WayAnova)，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2.结果
2.1流式细胞仪分析克隆细胞的表面标记
在无血清培养条件下能够形成肿瘤球的三例原代培养细胞其CD47阳性细胞所占比例分别为97.2%，99.8%，99.9%（如图1B、C、D）
2.2CD47阳性细胞对T淋巴细胞增殖的影响
MTT实验结果显示：与活化的人T淋巴细胞共培养72h，CD47阳性细胞组明显抑制T细胞增殖（P＜0.01）；加入（10μg/ml和20μg/ml）抗CD47单克隆抗体组比CD47阳性细胞组T细胞具有较强的增殖能力（P＜0.05），20μg/ml浓度组与10μg/ml浓度组比较无统计学差异（P＞0.05）（表1）。
2.3ELISA法测定培养液中IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达量
空白对照组上清液中IFN-γ含量为(2105.21±90.42)ng/L，CD47阳性细胞组培养液中IFN-γ含量(1835.50±89.06)ng/L较空白对照组明显降低（*P＜0.05），10μg/ml和20μg/ml抗CD47单克隆抗体组IFN-γ含量为(1981.33±91.52)ng/L和(2110.14±106.30)ng/L，而IL-12、TNF-α的表达量与空白对照组比无明显差异（P＞0.05）(Fig2)。
3.讨论
本实验观察到从人结直肠肿瘤组织中分离培养CD47阳性肿瘤细胞能抑制外周血T淋巴细胞的增殖并抑制其释放IFN-γ，加入（10μg/ml和20μg/ml）抗CD47单克隆抗体组比CD47阳性细胞组T细胞具有较强的增殖能力。以往研究者的证实，CD47具有多种功能，参与轴突的延伸[2]、嗜中性粒细胞的迁移[3]和T细胞活化的共同刺激信号[4]。CD47的配体为信号调节蛋白alpha链（signalregulatoryproteinαchain，SIRPα），它是一种跨膜蛋白，在其胞外区共含有3个免疫球蛋白样超家族区域，其中N末端的区域介导与CD47的结合[5]。SIRPα主要表达于巨噬细胞和树突状细胞表面，和CD47组成细胞间通讯系统（CD47-SIRPα系统），在多种细胞进程中发挥重要作用，包括B细胞的粘附、T细胞的激活及细胞的迁移。此外，CD47-SIRPα系统还参与巨噬细胞吞噬作用的负性调节过程，CD47通过与SIRPα结合产生抑制性信号，降低巨噬细胞的吞噬作用[6]，通过用CD47单克隆抗体结合CD47-SIRPα复合体又能促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬。由此可见，CD47也参与调节肿瘤细胞凋亡的吞噬过程。作为红细胞的自身标志抑制红细胞的清除，参与溶血性贫血的发病机制；抑制单核细胞释放IL-12，抑制外源IL-12促进的Thl细胞进化，限制炎症反应的持久性和强度；诱导淋巴细胞凋亡等生理过程。
本研究于体外实验证实，抗CD47单克隆抗体在体外可促进T淋巴细胞增殖，而在体内实验中应用抗CD47单克隆抗体是否能够同样取得显著的效果尚需要进一步的研究证实。因此本研究结果为后续的实验研究提供了的实验依据和基础。
应用抗CD47单克隆抗体可明显增强巨噬细胞对人白血病干细胞的吞噬作用[7-9]；在膀胱癌的体外实验中，应用CD47单克隆抗体可明显促进巨噬细胞的吞噬活性[10]；在移植人非霍奇金淋巴瘤的免疫缺陷小鼠上，应用抗CD47单克隆抗体可显著降低淋巴瘤的负荷并延长总的存活期，而联合应用利妥昔单抗治疗时甚至能够使淋巴瘤消失而获得治愈[11-12]。由此可见应用CD47单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗中显示了强大的治疗作用[13-14]，也为结直肠癌的靶向治疗提供实验依据。
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基金项目：宁夏科技攻关计划项目（NO:79）;宁夏医科大学校级课题（NO:XM201135）.ProjectsupportedbytheResearchFoundationoftheScienceofNingxiaProvince（NO:79）;theResearchFoundationofNingxiaMedicalUniversity（NO:XM201135）
作者简介：马丽君（1981-），女，山东济南人，助理研究员，主要从事肿瘤干细胞研究.E-mail：53512756@qq.com
通讯作者：李玉奎(LiYukui,Correspondingauthor)，E-mail：yukuili@hotmail.com;