导读:本文包含了开放读码框论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:单纯疱疹,单纯疱疹病毒1型(HSV-1),UL57,开放读码框
开放读码框论文文献综述
佘明敏,蒋海芳,陈晓湘[1]（2019）在《单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定》一文中研究指出单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重迭存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。(本文来源于《病毒学报》期刊2019年01期）
雷青松[2]（2018）在《戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白在HEV免疫逃逸中的作用及机制研究》一文中研究指出戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染是世界性的公共卫生问题,全球每年约2000万人新发感染HEV。尽管临床上戊型肝炎病程多呈急性自限性,但在部分特殊患者如器官移植、HIV、孕妇等人群中,极易发生肝衰竭或戊型肝炎慢性化。HEV感染慢性化、致肝硬化等患者及孕妇高病死率的机制尚不明确,亟待进一步研究。巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,不仅可以吞噬并分泌多种炎性因子来消灭入侵的病原体,还可以起到抗原提呈作用连接天然免疫和特异性免疫应答,协助清除被感染的细胞。同时,病毒感染会通过模式识别受体启动先天抗病毒免疫反应,诱导宿主细胞分泌干扰素来限制病毒复制及扩散。但大部分病毒都已经进化出多种不同的策略来逃避宿主的免疫清除。目前研究证实戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白(Open Reading Frame 3,ORF3)可以与宿主细胞内蛋白相互作用为HEV复制和疾病进展创造良好的环境,在HEV感染和传播过程中起着关键作用。因此,我们推测HEVORF3可能会影响巨噬细胞的免疫功能及其吞噬功能等,从而为HEV感染的慢性化,甚至继发肝纤维化和肝硬化提供良好的免疫抑制环境。另外,HEVORF3还可能会影响模式识别受体来抑制宿主细胞内的抗病毒免疫反应,帮助HEV逃逸免疫,维持持续复制状态。目的:1.构建HEV ORF3过表达载体,并建立不同感染模型的条件;2.明确HEVORF3对巨噬细胞极化的调控及对炎症因子、趋化因子表达的影响;3.研究HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能、吞噬相关受体的影响;4.研究HEV ORF3对宿主细胞模式识别受体及其内源性干扰素生成的调控作用,并进一步探究其可能的作用机制。方法:1.分别构建多种HEVORF3蛋白的过表达载体,包括慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行扩增和提纯;2.巨噬细胞模型采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导人急性单核细胞白血病(THP1)细胞系分化为PMA-THP1巨噬细胞,过表达上述过表达载体并筛选合适的试验条件;根据人正常肝脏细胞L02细胞系、人肝癌细胞HepG2及Huh7细胞系中TLR7的表达水平,选择合适的宿主细胞模型;3.PMA-THP1巨噬细胞中感染慢病毒或腺病毒载体后,给予细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,利用ELISA、实时荧光定量PCR、Western blot等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞炎症及趋化因子表达的影响,并进一步验证HEVORF3可以通过抑制NFκB信号通路来下调巨噬细胞炎症及趋化因子的释放;4.采用流氏细胞检测及吞噬试验等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用,并进一步采用实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选出受调节的吞噬相关受体蛋白,结合激动剂及抑制剂的使用,探讨可能的机制;5.分别在PMA-THP1巨噬细胞和L02细胞中过表达腺病毒及质粒载体,研究HEV ORF3对宿主细胞内源性干扰素的表达有调控作用。进一步采取实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选显着表达差异的模式识别受体,结合特异性信号通路调节剂,研究HEVORF3逃逸宿主细胞固有免疫作用的可能机制。结果:1.成功构建基因1型HEV ORF3片段的慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行了扩增和提纯;2.10ng/mL PMA持续诱导THP1分化24h后,换为完全培养基继续培养24h即分化为成熟巨噬细胞;L02细胞系作为人正常肝脏细胞的永生化细胞系仍有具有正常肝细胞的特征,且其TLR7的表达水平明显高于HepG2及Huh7细胞系,因此被本研究作为宿主细胞模型。3.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以下调LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞生成的炎症因子和趋化因子的表达和分泌,且可能是通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性发挥作用的;4.流式细胞检测及吞噬试验发现HEV ORF3可以明显抑制巨噬细胞的吞噬功能,RT-qPCR和western blot结果显示吞噬相关受体CD14和CD64的表达有明显降低,且CD14和CD64的下调可以通过JAK1/STAT1信号通路的特异性抑制剂ruxolinitib治疗后逆转;5.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以明显抑制PMA-THP1及L02细胞中Ⅰ型内源性干扰素的产生,而进一步的RT-qPCR及western blot结果显示TLR3和TLR7的表达有明显下降,结合特异性激动剂和抑制剂研究发现,HEVORF3过表达后可抑制多条信号通路包括p-P65、p-STAT1和p-JNK的活化水平,从而造成TLR7和干扰素的表达下调。结论:1.HEV ORF3可以通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性降低LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞的炎症和趋化因子的表达水平;2.HEV ORF3可以通过抑制JAK1/STAT1信号通路下调吞噬相关受体CD14和CD64的表达,并抑制巨噬细胞的吞噬功能;3.HEV ORF3蛋白可以通过下调TLR3和TLR7,抑制Ⅰ型内源性干扰素的产生。并且可以抑制多条信号通路包括NFκB,JAK/STAT和JNK/MAPK来下调TLR7蛋白的表达;4.HEV ORF3蛋白可以通过上述多种作用途径帮助HEV逃逸宿主免疫清除,为戊型肝炎慢性化的可能机制提供理论支持和补充。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2018-05-01）
钟菲菲,杨慧兰,吕芳彪,薛礼长,白利利[3]（2013）在《单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录本开放读码框的表达及其抗凋亡功能分析》一文中研究指出目的:研究单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体(LAT)开放读码框(ORF)对凋亡诱导剂诱导Vero细胞凋亡的影响。方法:PCR扩增LAT ORF1、ORF2、ORF3片段,构建重组质粒pEGFPORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3,重组质粒pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3转染Vero细胞;RT-PCR鉴定ORF1、ORF2、ORF3的表达。用凋亡诱导剂放线菌素D、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导Vero细胞凋亡,通过荧光显微镜观察细胞形态学的改变,MTT检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:双酶切和测序确认pEGFP-ORF1、pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3构建成功,RT-PCR表明这3个真核表达载体能在Vero细胞中高效表达。转染各种pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后,细胞形态正常。MTT结果表明转染了各种重组质粒pEGFP-ORF的Vero细胞经凋亡诱导剂诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但高于凋亡诱导剂诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2,且经凋亡诱导剂诱导的Vero细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果表明,转染各种重组质粒pEGFP-ORF且经凋亡诱导剂诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),而显着低于转染空质粒pEGFP-C2且经凋亡诱导剂诱导凋亡组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HSV-2 LAT ORF对凋亡诱导剂诱导的Vero细胞的凋亡具有抵抗作用。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2013年10期）
吕芳彪[4]（2013）在《单纯疱疹病毒II型LAT基因开放读码框1抗细胞凋亡作用的研究》一文中研究指出单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes Simplex Virus Ⅱ,HSV-2）具有易感染，容易传播，难治愈的特点。它主要引起生殖器疱疹（genital herpes,GH）。初次感染HSV-2后，病毒会终身潜伏在人体的骶尾神经节中。当受到体内外各种非特异性刺激时，病毒会被激活，造成复发感染，并出现相应的临床症状。目前疱疹病毒潜伏及再激活的机制一直未明，是临床上根治生殖器疱疹的难点所在。潜伏相关转录体是（Latency associated transcript,LAT）HSV-2在潜伏感染期间唯一大量表达的基因组转录产物。国外大量的研究表明，潜伏相关转录体在单纯疱疹病毒潜伏及再激活过程中起着至关重要的作用。目前有关LAT的作用假说很多，但具体是哪一种作用机制尚不明确。HSV-2起主要作用的LAT包含3个开放读码框（Open Reading Frame，ORF）。有研究表明单纯疱疹病毒LAT可以通过读码框编码蛋白的抗凋亡作用抑制宿主细胞的凋亡，维持病毒的潜伏感染状态。为此，本研究以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT ORF1，构建重组真核表达载体pEGFP-ORF1。借助于xfect转染试剂盒，转染重组子，研究其在Vero细胞中的表达及其抗凋亡作用。首先根据gene bank中的LAT ORFs序列设计引物，以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT ORF1片段。PCR产物纯化后同pEGFP-C2经EcoRI、KpnI双酶切后，用T4-ligase连接，转化进E.coli Top10感受态细胞，kan+抗性筛选阳性菌落，通过菌落PCR，双酶切和测序对所筛选的重组质粒进行鉴定。重组质粒转染入Vero细胞，24h后在荧光显微镜下观察HSV-2潜伏相关转录体LAT开放读码框ORF1融合绿色荧光蛋白的表达情况。RT-PCR确认ORF1mRNA在Vero细胞中成功转录。转染48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布情况，显微镜下可见重组质粒pEGFP-ORF1表达的绿色荧光主要集中在细胞核，大多数为圆形，形态规则，分布均匀。而空质粒pEGFP-C2表达的绿色荧光在细胞核和细胞质中都有分布，且不规则，与重组质粒组相比较，荧光强度较弱。本研究用凋亡诱导剂放线菌素D(ActD)诱导各组细胞凋亡，荧光显微镜及Hochest3328荧光染色观察凋亡诱导后各组细胞的形态特点。Gimesa染色观察各组细胞细胞核的变化；发现转染pEGFP-ORF1一组的细胞形态正常，与正常对照组细胞无差异。MTT结果表明转染了重组质粒pEGFP-ORF1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，但高于放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2且放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组，差异具有统计学意义(P<0.05)。流式结果表明，转染重组质粒pEGFP-ORF1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),而显着低于放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组，差异显着(P<0.05)；caspase-3活性检测表明转染重组质粒的Vero细胞组caspase-3活性与正常对照组无显着差异，而明显低于空质粒组差异有统计学意义综述以上研究结果表明，HSV-2LAT基因ORF1片段具有抗放线菌素D在Vero细胞中诱导的细胞凋亡的功能。本实验研究为探究有关HSV-2LAT介导的病毒的潜伏和复发的机制打下一定基础。(本文来源于《华南理工大学》期刊2013-05-01）
吕芳彪,杨慧兰,钟菲菲,高睿迪[5]（2013）在《单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框1(ORF1)真核表达载体的构建及表达》一文中研究指出目的:构建单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框1真核表达载体pEGFP-C2/LAT ORF1,并通过转染非洲绿猴肾细胞(Vero),验证载体的体外表达情况。方法:根据HSV-ⅡLAT ORF1基因序列设计一对引物,以HSV-Ⅱ333标准株基因组为模板PCR法扩增出ORF1基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C2载体上,并对重组子pEGFP-C2/LAT ORF1进行酶切鉴定以及测序;利用Xfect转染试剂盒将重组质粒pEGFP-C2/LAT ORF1转染vero细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达,并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达。结果:ORF1基因的体外扩增目的片段为741bp,所构建的真核表达载体pEGFP-C2/LAT ORF1经双酶切鉴定,与预期大小一致,测序结果与NCBI收录的ORF1基因序列一致;重组质粒pEGFP-C2/LAT ORF1转染vero细胞后,RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。结论:成功构建pEGFP-C2/LAT ORF1真核表达载体,并且实现其在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的表达,为进一步探讨HSV-ⅡLAT ORF1在HSV-Ⅱ潜伏复发中的作用奠定了基础。(本文来源于《2013全国中西医结合皮肤性病学术年会论文汇编》期刊2013-04-25）
陈蓉,饶颖竹,梁静真,邓富琳[6]（2012）在《半滑舌鳎GAPDH基因开放读码框的克隆及序列分析》一文中研究指出甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核生物中,对许多生理活动具有重要作用。参考金头鲷和斑马鱼的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计一对简并引物,提取半滑舌鳎肌肉组织总RNA,采用RT-PCR技术对GAPDH基因进行克隆测序及序列分析。结果表明,从半滑舌鳎肌肉组织中成功克隆了GAPDH基因的开放读码框(ORF),序列全长1 002 bp,编码333个氨基酸,分子量为36.0235 ku,等电点PI为7.75。序列同源性分析显示,该序列与其他鱼类的GAPDH氨基酸序列具有较高的同源性。(本文来源于《广东农业科学》期刊2012年19期）
王晶晶,张元杰,田德英[7]（2012）在《戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白抑制肿瘤坏死因子-α介导肝细胞p65的核转移》一文中研究指出目的:研究Ⅰ型和Ⅳ型戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框3蛋白(ORF3)对肝细胞系L02核因子-kap-pa B(Nuclear Factor kappa B,NF-κB)通路的影响。方法:分别用未转染质粒、转染Ⅰ型和Ⅳ型ORF3真核表达质粒及空载质粒的L02细胞,48小时后加入TNF(肿瘤坏死因子)-α刺激,采用免疫荧光观察细胞内p65的核转运,并用western blot检测p65蛋白的表达。结果:未转染质粒的L02细胞加入TNF-α刺激后,p65由胞浆转入胞核;转染空载的L02细胞加入TNF-α刺激后,与未转染的L02相似,p65由胞浆转入胞核;表达Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白的细胞,加入TNF-α刺激后,p65未见明显核转移。结论:Ⅰ型和Ⅳ型ORF3蛋白可抑制TNF-α介导的p65核转移。(本文来源于《中西医结合肝病杂志》期刊2012年01期）
薛礼长[8]（2011）在《单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT基因开放读码框3抗细胞凋亡作用的研究》一文中研究指出单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)是一种常见的人类病毒性疾病病原体,主要引起生殖器疱疹(genital herpes,GH)。HSV-2侵染人体后不但引起原发性感染,并可在骶尾神经节内以休眠的状态建立潜伏感染。这种潜伏往往是终生的,并伴随体内外各种非特异性刺激而活化,导致相关临床症状复发,造成复发感染。正因为这种潜伏复发机制导致HSV能够逃避免疫系统的消灭而难以根除。目前尚不明确单纯疱疹病毒的潜伏复发机制,这是临床上彻底治愈HSV-2感染的瓶颈所在。潜伏相关转录体(Latency associated transcript,LAT)是HSV潜伏感染期间唯一大量存在的转录物,多年的研究表明LAT在HSV潜伏的建立、保持和活化过程中起着不可替代的作用。学者们对LAT功能的研究,虽然已提出多种假说,但争议很大。HSV-2 LAT含有叁个开放读码框(Open Reading Frame,ORF),有研究指出LAT的开放读码框可以编码抗凋亡作用的蛋白来抑制其宿主细胞的凋亡,从而保持HSV-2的潜伏感染状态。据此,本研究构建了重组真核表达载体pEGFP-ORF3。将重组质粒pEGFP-ORF3转染Vero细胞后,研究其在Vero细胞中表达及抗顺铂诱导的凋亡作用。首先,以HSV-2 333株基因组为模板,PCR扩增获得LAT ORF3序列,PCR产物和质粒pEGFP-C2经EcoRI、KpnI双酶切后,T4连接酶连接,连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株,经抗性筛选后获得重组质粒pEGFP-ORF3,双酶切及测序鉴定重组质粒pEGFP-ORF3构建成功。Xfect转染试剂介导pEGFP-ORF3转染Vero细胞,48h后将细胞放在倒置荧光显微镜下,观察绿色荧光蛋白标记的ORF3片段的表达,RT-PCR确定其mRNA在Vero细胞中转录成功。重组质粒pEGFP-ORF3转染Vero细胞后,荧光显微镜观察到ORF3在细胞中高效表达;融合蛋白在细胞质中的分布量要显着少于细胞核中。本实验使用常见诱导剂顺铂对各组细胞进行凋亡诱导后,通过倒置荧光显微镜下观察各组细胞的形态特征及Giemsa染色观察细胞核的变化,发现转染重组质粒pEGFP-ORF3的细胞与正常细胞无显着差异;MTT法分析细胞增殖情况与正常细胞无差异而显着高于空质粒组;流式细胞术检测凋亡率与正常细胞无显着差异,而显着低于空质粒组。这些研究结果表明,HSV-2 LAT ORF3具有抵抗顺铂诱导的Vero细胞凋亡的功能。本研究构建的重组真核表达载体pEGFP-ORF3能在Vero细胞内高效表达,并证实了其抗细胞凋亡的功能,为进一步研究HSV-2 LAT介导的潜伏复发机制奠定了一定的实验基础。(本文来源于《华南理工大学》期刊2011-04-01）
徐晶,王傲雪,李新玲,徐香玲[9]（2008）在《羊草(Leymus chinensis)psbD基因开放读码框(ORF)的克隆及序列分析》一文中研究指出从羊草中提取总RNA,采用简并PCR方法,扩增出编码353个氨基酸的psbD基因开放读码框(Open read ing frame,ORF)cDNA序列,GenBank登陆号为FJ176573,并对其序列进行了分析.同时次基因组DNA为模板对psbD基因开放读码框区域进行了扩增,证明该基因无内含子,为其功能的进一步研究提供基因材料和理论依据.(本文来源于《哈尔滨师范大学自然科学学报》期刊2008年06期）
陈瑾,吴金明[10]（2008）在《乙型肝炎病毒开放读码框的结构及功能研究进展》一文中研究指出乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,其基因组至少含有4个开放读码框,分别为编码外膜蛋白的S基因区、编码核衣壳蛋白的C基因区、编码P蛋白的P基因区及编码X蛋白的X基因区。此外,还发现了两个新的区域,前-前-S区和前-X区。各结构区在病毒的复制、感染、致癌等方面发挥重要作用,文章就其结构和功能的研究进展作一综述。(本文来源于《国际消化病杂志》期刊2008年02期）
开放读码框论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染是世界性的公共卫生问题,全球每年约2000万人新发感染HEV。尽管临床上戊型肝炎病程多呈急性自限性,但在部分特殊患者如器官移植、HIV、孕妇等人群中,极易发生肝衰竭或戊型肝炎慢性化。HEV感染慢性化、致肝硬化等患者及孕妇高病死率的机制尚不明确,亟待进一步研究。巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分,不仅可以吞噬并分泌多种炎性因子来消灭入侵的病原体,还可以起到抗原提呈作用连接天然免疫和特异性免疫应答,协助清除被感染的细胞。同时,病毒感染会通过模式识别受体启动先天抗病毒免疫反应,诱导宿主细胞分泌干扰素来限制病毒复制及扩散。但大部分病毒都已经进化出多种不同的策略来逃避宿主的免疫清除。目前研究证实戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白(Open Reading Frame 3,ORF3)可以与宿主细胞内蛋白相互作用为HEV复制和疾病进展创造良好的环境,在HEV感染和传播过程中起着关键作用。因此,我们推测HEVORF3可能会影响巨噬细胞的免疫功能及其吞噬功能等,从而为HEV感染的慢性化,甚至继发肝纤维化和肝硬化提供良好的免疫抑制环境。另外,HEVORF3还可能会影响模式识别受体来抑制宿主细胞内的抗病毒免疫反应,帮助HEV逃逸免疫,维持持续复制状态。目的:1.构建HEV ORF3过表达载体,并建立不同感染模型的条件;2.明确HEVORF3对巨噬细胞极化的调控及对炎症因子、趋化因子表达的影响;3.研究HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能、吞噬相关受体的影响;4.研究HEV ORF3对宿主细胞模式识别受体及其内源性干扰素生成的调控作用,并进一步探究其可能的作用机制。方法:1.分别构建多种HEVORF3蛋白的过表达载体,包括慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行扩增和提纯;2.巨噬细胞模型采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导人急性单核细胞白血病(THP1)细胞系分化为PMA-THP1巨噬细胞,过表达上述过表达载体并筛选合适的试验条件;根据人正常肝脏细胞L02细胞系、人肝癌细胞HepG2及Huh7细胞系中TLR7的表达水平,选择合适的宿主细胞模型;3.PMA-THP1巨噬细胞中感染慢病毒或腺病毒载体后,给予细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,利用ELISA、实时荧光定量PCR、Western blot等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞炎症及趋化因子表达的影响,并进一步验证HEVORF3可以通过抑制NFκB信号通路来下调巨噬细胞炎症及趋化因子的释放;4.采用流氏细胞检测及吞噬试验等方法明确HEV ORF3对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用,并进一步采用实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选出受调节的吞噬相关受体蛋白,结合激动剂及抑制剂的使用,探讨可能的机制;5.分别在PMA-THP1巨噬细胞和L02细胞中过表达腺病毒及质粒载体,研究HEV ORF3对宿主细胞内源性干扰素的表达有调控作用。进一步采取实时荧光定量PCR、Western blot等方法筛选显着表达差异的模式识别受体,结合特异性信号通路调节剂,研究HEVORF3逃逸宿主细胞固有免疫作用的可能机制。结果:1.成功构建基因1型HEV ORF3片段的慢病毒、腺病毒及质粒载体,并进行了扩增和提纯;2.10ng/mL PMA持续诱导THP1分化24h后,换为完全培养基继续培养24h即分化为成熟巨噬细胞;L02细胞系作为人正常肝脏细胞的永生化细胞系仍有具有正常肝细胞的特征,且其TLR7的表达水平明显高于HepG2及Huh7细胞系,因此被本研究作为宿主细胞模型。3.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以下调LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞生成的炎症因子和趋化因子的表达和分泌,且可能是通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性发挥作用的;4.流式细胞检测及吞噬试验发现HEV ORF3可以明显抑制巨噬细胞的吞噬功能,RT-qPCR和western blot结果显示吞噬相关受体CD14和CD64的表达有明显降低,且CD14和CD64的下调可以通过JAK1/STAT1信号通路的特异性抑制剂ruxolinitib治疗后逆转;5.ELISA及RT-qPCR结果提示HEV ORF3可以明显抑制PMA-THP1及L02细胞中Ⅰ型内源性干扰素的产生,而进一步的RT-qPCR及western blot结果显示TLR3和TLR7的表达有明显下降,结合特异性激动剂和抑制剂研究发现,HEVORF3过表达后可抑制多条信号通路包括p-P65、p-STAT1和p-JNK的活化水平,从而造成TLR7和干扰素的表达下调。结论:1.HEV ORF3可以通过下调TLR4并抑制NFκB信号通路活性降低LPS诱导PMA-THP1巨噬细胞的炎症和趋化因子的表达水平;2.HEV ORF3可以通过抑制JAK1/STAT1信号通路下调吞噬相关受体CD14和CD64的表达,并抑制巨噬细胞的吞噬功能;3.HEV ORF3蛋白可以通过下调TLR3和TLR7,抑制Ⅰ型内源性干扰素的产生。并且可以抑制多条信号通路包括NFκB,JAK/STAT和JNK/MAPK来下调TLR7蛋白的表达;4.HEV ORF3蛋白可以通过上述多种作用途径帮助HEV逃逸宿主免疫清除,为戊型肝炎慢性化的可能机制提供理论支持和补充。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
开放读码框论文参考文献
[1].佘明敏,蒋海芳,陈晓湘.单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定[J].病毒学报.2019
[2].雷青松.戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白在HEV免疫逃逸中的作用及机制研究[D].重庆医科大学.2018
[3].钟菲菲,杨慧兰,吕芳彪,薛礼长,白利利.单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录本开放读码框的表达及其抗凋亡功能分析[J].中国生物工程杂志.2013
[4].吕芳彪.单纯疱疹病毒II型LAT基因开放读码框1抗细胞凋亡作用的研究[D].华南理工大学.2013
[5].吕芳彪,杨慧兰,钟菲菲,高睿迪.单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框1(ORF1)真核表达载体的构建及表达[C].2013全国中西医结合皮肤性病学术年会论文汇编.2013
[6].陈蓉,饶颖竹,梁静真,邓富琳.半滑舌鳎GAPDH基因开放读码框的克隆及序列分析[J].广东农业科学.2012
[7].王晶晶,张元杰,田德英.戊型肝炎病毒开放读码框3蛋白抑制肿瘤坏死因子-α介导肝细胞p65的核转移[J].中西医结合肝病杂志.2012
[8].薛礼长.单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT基因开放读码框3抗细胞凋亡作用的研究[D].华南理工大学.2011
[9].徐晶,王傲雪,李新玲,徐香玲.羊草(Leymuschinensis)psbD基因开放读码框(ORF)的克隆及序列分析[J].哈尔滨师范大学自然科学学报.2008
[10].陈瑾,吴金明.乙型肝炎病毒开放读码框的结构及功能研究进展[J].国际消化病杂志.2008
标签：单纯疱疹; 单纯疱疹病毒1型(HSV-1); UL57; 开放读码框;