（1广州中医药大学祈福医院病理科广东广州511495）（2广州中医药大学祈福医院科教科广东广州511495）（3南方医科大学生物统计学系广东广州511495）
【摘要】目的：探讨程序性死亡受体１(programmedcelldeath-1,PD-1）与程序性死亡配体１(programmedcelldeath-ligand1,PD-L1）在结直肠癌（CRC）中的表达及其与临床病理参数的相关性。方法：采用免疫组织化学方法检测病例组（172例结直肠癌患者癌组织及82例对应淋巴结转移癌组织）与对照组（50例癌旁组织及50例非肿瘤肠黏膜组织）中PD-1、PD-L1的表达情况，分析其与各临床病理特征的相关性。结果：病例组PD-1、PD-L1的表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，癌细胞中PD-L1表达与年龄密切相关(P<0.01)，肿瘤浸润淋巴细胞中PD-L1表达与年龄、TNM分期以及浸润深度(P<0.05)密切相关。癌间质PD-1表达与性别和肿瘤大小(P<0.05)密切相关。结论：结直肠癌中PD-1、PD-L1表达显著升高，并与患者临床病理特征密切相关；二者可能成为预测结直肠癌进展和预后的新分子标志物，阻断PD-1/PDL1信号通路有望成为结直肠癌免疫治疗的新策略。
【关键词】结直肠癌；PD-1；PD-L1；肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）；免疫抑制
【中图分类号】R735.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）28-0018-03
ExpressionandclinicalsignificanceofPD-1andPD-L1inCarcinomaofthecolonandrectum(CRC)
HanLifang1,WangZhen2,GuanYing3
1DepartmentofPathology,CliffordHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong511495,China
2ScienceandEducadonSection,CliffordHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine.GuangzhouGuangdong511495,China
3DepartmentofStatistics,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong511495,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweentheexpressionofPD-1/PD-L1inCarcinomaofthecolonandrectum(CRC)andclinicopathologicfeatures.MethodsThestudycomprisedtumorsectionsfrom172CRCpatientstreatedwithcurativeresection,82matchedlymphnodes,50casesofadjacentnormaltissuesand50casesofhealthcontrols,whichwereevaluatedforPD-1andPD-L1proteinexpressionbyimmunohistochemistry.ResultsTheexpressionofPD-1andPD-L1inCRCwassignificantly(P<0.05)higherthanthatinnormaltissues,whichwerehighlypositivelycorrelatedwitheachother(P<0.001).TheexpressionofPD-L1incancernestswassignificantlycorrelatedwithage(P<0.01).andwhichintumorinfiltratinglymphocyteswascorrelatedwithage,TNMclassification,anddepthofinvasion(P<0.05).PD-1expressionininterstitiallymphocytewascorrelatedwithsexandtumorvolume(P<0.05).ConclusionPD-1andPD-L1areoverexpressedandsignificantlycorrelatedwithclinicopathologicfeaturesinCRC.PD-1/PD-L1expressionplaysacriticalroleinthepathogenesisofhumanCRC,suggestingthatitmightbeusedasanewbio-markertopredictthediseaseprogressionandprognosis.
【Keywords】Carcinomaofthecolonandrectum(CRC);PD-1;PD-L1;tumorinfiltratinglymphocytes(TIL);Immuneevasion
结直肠癌（CRC）作为最常见的恶性肿瘤之一，在全世界男性的发病率排名第３位，病死率第４位，女性的发病率排名第２位，病死率第３位。晚期结直肠癌(指局部晚期或远处转移），占所有结直肠癌的50%。我国结直肠癌的发病率和病死率呈明显上升趋势，且发病年龄有所提前。而针对结直肠癌的治疗，仍然是以手术为主、放化疗等为辅的综合治疗方法，以减少肿瘤细胞数量来达到治疗效果。但是，术后５年生存率低、复发转移率及耐药率高。目前，肿瘤免疫治疗是肿瘤领域的研究热点，是一种疗效显著的肿瘤治疗模式。肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，近期研究发现PD-1和PD-L1的抑制剂在多种肿瘤类型中疗效显著。本研究将收集既往结直肠癌病例，运用免疫组化方法检测癌组织、癌旁组织及其浸润淋巴细胞中PD-1/PD-L1的蛋白表达，分析其与临床参数，如性别、年龄、肿瘤大小、组织类型、TNM分期、淋巴结转移等的相关性，探讨PD-1/PD-L1的蛋白表达在结直肠癌早期诊断、免疫靶向治疗、预后评估中的应用价值。
1.资料与方法
1.1一般资料
收集广东祈福医院2012年1月－2018年10月期间结直肠癌标本172例作为病例组，随机选取其中50例距肿瘤组织＞5cm的癌旁组织及50例非肿瘤体检者正常肠粘膜作为对照组。病例组术前均未行放化疗，临床资料完整，其中男104例，女68例；年龄31～94岁，平均年龄64岁；肿瘤直径（癌结节）1.5～10cm，中位大小4.5cm；依据分化程度，低分化8例，中分化150例，高分化14例；按照AJCC（2010）第七版结直肠癌TNM分期标准[1]，Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期84例；有淋巴结转移者82例，无淋巴结转移者90例；有脉管癌栓者90例，无脉管癌栓者82例。
1.2方法
免疫组织化学法检测PD-1、PD-L1的表达及分布采用EnVision两步法，一抗室温孵育2h，二抗室温孵育30min，经DAB显色苏木精复染。鼠抗人PD-1（NAT）单克隆抗体即用型，兔抗人PD-L1（MXR003）单克隆抗体即用型，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3结果判定
免疫组化结果由2名中级以上病理医师双盲独立观察评估。PD-Ll和PD-l以细胞质或细胞膜出现黄至棕褐色颗粒为阳性显色。PD-Ll以阳性细胞数≥１%判为阳性，＜１%判为阴性[2]，分别评价肿瘤细胞及间质细胞的表达情况。PD-l表达于肿瘤间质浸润的淋巴细胞，以阳性细胞数≥5%判为阳性，＜5%判为阴性[3]。
1.4统计学处理
数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1PD-1、PD-L1在结直肠癌组织及淋巴结中的表达
PD-1蛋白表达定位于结直肠癌间质浸润的淋巴细胞中，阳性部位为细胞膜及细胞质，阳性率为32.6%（56/172）。PD-L1蛋白表达主要定位于癌细胞和癌间质淋巴细胞的细胞质和细胞膜，其总体阳性率为65.1%（112/172），其中癌细胞上表达阳性率为24.4%（42/172），癌间质淋巴细胞上表达阳性率为65.1%（112/172）。50例癌旁组织间质淋巴细胞可见少量PD-1和PD-L1表达，其中PD-1阳性率为6%（3/50），PDL-1阳性率为8%（4/50）。淋巴结转移癌中PD-1和PDL-1表达率分别为23.2%（19/82）和61.0%（50/82），与其对应的原发肿瘤组织表达高度一致；见图1。
图1A：PD-L1癌细胞阳性；
B：PD-L1癌间质浸润淋巴细胞阳性；
C：PD-1癌间质浸润淋巴细胞阳性
2.2结直肠癌组织中PD-1、PD-L1蛋白表达的相关性
χ2检验结果显示，PD-1、PD-L1两者的蛋白表达呈显著正相关，癌细胞及癌间质浸润淋巴细胞中PD-L1的表达均与PD-1表达具有显著差异(P＜0.001)，见表1。
3.讨论
PD-l正常表达在CD4—CD8—胸腺细胞上，诱导性表达于活化的Ｔ细胞、Ｂ细胞、骨髓细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞（NK）、单核细胞等，当抗原清除，免疫应答完成后，Ｔ细胞的PD-l表达减少。PD-l持续性表达在T细胞上会诱导T细胞的衰竭。因此PD-l属于免疫抑制受体，而其本身也是活化T细胞的一个标志。PD-L1是PD-l的配体，属于B7家族中的负性共刺激信号分子，正常生理状态下，主要表达于组织细胞、内皮细胞、活化T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞等，它与活化T细胞表面PD-l结合，抑制T细胞活化，诱导T细胞凋亡，使机体的免疫应答反应维持在一定动态平衡［4］。肿瘤发生时，肿瘤微环境会诱导浸润性T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞高表达PD-L1，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，PD-L1与PD-1联接后，T细胞功能被抑制，不能向免疫系统发出攻击肿瘤的信号［5］。PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答。已有研究证实多种恶性肿瘤[6-11]，如肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肾细胞癌等均通过表达PD-L1来诱导形成免疫抑制性的肿瘤微环境，逃避机体的抗肿瘤免疫反应。
目前对于PD-1、PD-L1在结直肠癌中的表达研究较少，本实验结果显示，结直肠癌组织中高表达PD-1、PD-L1，其中，PD-1蛋白表达定位于癌间质浸润的淋巴细胞中，阳性率为32.6%，PD-L1蛋白表达主要定位于癌细胞和癌间质淋巴细胞，其总体阳性率为65.1%，两者的表达均高于对照组。并且，PD-1、PD-L1蛋白表达与多项临床病理特征相关，癌细胞中PD-L1表达与年龄密切相关(P＜0.01)，癌间质PD-L1表达与年龄、TNM分期以及浸润深度密切相关(P＜0.05)。癌组织中PD-1表达与性别和肿瘤大小密切相关(P＜0.05)。因此推测，结直肠患者PD-1/PD-L1高表达可以作为PD-1/PD-L1抑制剂治疗的用药指标，同时联合临床病理参数，可作为疗效评估指标，有助于判断预后。另外，本实验结果显示结直肠癌组织中PD-1、PD-L1两者的蛋白表达呈显著正相关(P＜0.001)，此结果与马薇［12］、王也［13］在肺癌中的研究一致；在胃癌中，刘书漫［14］等发现PD-L1与PD-1的表达呈负相关，而吴圣［15］等的研究结果则显示两者之间的表达不存在明显的相关性；张伟［16］等在三阴性乳腺癌的研究中发现间质TIL中PD-L1的表达与PD-1表达有相关性，而肿瘤细胞PD-L1的表达与PD1表达无相关性。由此看来，PD-1、PD-L1在不同肿瘤中的表达模式及相关性有所不同，其意义仍有待进一步研究。
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