西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030
摘要：目的：探究罗布麻中黄酮类化合物抑菌作用。方法：采用纸片扩散法观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径作为评价标准。结果：粪肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对罗布麻叶中的黄酮类化合物低度敏感，金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌对罗布麻叶中的黄酮类化合物敏感性相对较弱。结论：罗布麻叶黄酮类化合物对大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪肠球菌无明显的抑制作用。
关键词：罗布麻；黄酮；抑菌
罗布麻（Apocynumvenetum，AV，又名野麻、红麻）罗布麻，又名夹竹桃麻、茶花麻、茶棵子等，属夹竹桃科，属多年生根的野生草本植物，能够在干旱的沙漠，半沙漠化土壤中生长，并且具有耐旱、耐寒、耐盐碱性，且能防风固沙，在黄河口地区分布广泛，其性微寒，味苦甘，具有很高的药用价值[1]，其产品具有一定的医疗保健功能和抗菌作用。早期研究表明，罗布麻叶中的提取物具有雌激素样作用，还有防治心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等多种药理活性[2-5]。目前，一些学者对罗布麻进行了研究，罗布麻的抑菌性能得到了学者们的广泛关注，但对罗布麻的抑菌性能产生的原因缺乏深入的研究。据目前国内外的研究现状，人们对罗布麻的抗菌性能和抗菌机理还没有一个明确的答案和准确的认识，甚至没有一个对罗布麻叶的抗菌性能进行测试的标准方法，并且由于抗生素的滥用，导致大量细菌发生了变异，对抗生素产生了抗药性。本课题就是在前人研究的基础上[6-9]，对罗布麻叶的抗菌性能进行深入的研究，并对罗布麻的抗菌机理进行探讨，为将来开发天然抗菌药物做理论基础。
1.材料与设备
1.1材料与试剂
1.1.1主要试剂
95%乙醇，氯仿，无水乙醇，丙酮，乙醚，硫酸亚铁溶液，6mmol/L水杨酸，50mmol/LTris-HCl缓冲液5.0mmol/L邻苯三酚溶液，0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.6），1%铁氰化钾溶液，0.1%三氯化铁，肝素钠，过氧化氢溶液，15%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸均购自上海生工有限公司。青霉素纸片购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.2供试菌种
大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）、肺炎双球菌（Dneumococcus）、金黄色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、粪肠球菌（Enterococcusfaecalis），由西北民族大学生命科学与工程学院微生物实验室提供。
1.1.3细菌培养基
牛肉膏，蛋白胨，氯化钠均购自北京奥博星生物技术有限公司。
1.2仪器与设备
球形烧瓶，冷凝管，坩埚，离心管，游标卡尺。
可调式电热套：MH-3000，北京科伟永兴仪器有限公司；电热恒温水浴锅：DK-526，上海精宏实验设备有限公司；离心机：TDZ4-WS低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；分光光度计：722E型可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-2000E，上海耀裕仪器设备有限公司；电子天平：YP1201N电子天平，上海精密科学仪器有限公司。
2.方法
2.1罗布麻总黄酮的提取[2]
2.1.1罗布麻的预处理
将罗布麻叶在60℃烘箱中烘24h，使其充分干燥，直至几乎不含水分，然后将其粉碎备用。
2.1.2罗布麻总黄酮的粗提
先称取50g罗布麻原材料粉末，将罗布麻的粉末按照料液质量体积比为1：10的比例加入65%乙醇，回流提取三次，每次2h，合并三次提取液。然后用旋转蒸发仪蒸发以上合并的提取液至原体积的1/4，得到浓缩液，接着将所得浓缩液，于90℃水浴锅中水浴2h至叶绿素完全析出，滤除叶绿素沉淀后加3倍体积95%乙醇静置48小时进行醇沉（醇沉3次），所得溶液为黄酮粗提取物即上样液。
2.1.3大孔树脂的预处理
大孔树脂的预处理，湿法装柱，将大孔树脂装入交换柱后，用蒸馏水反复洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清澈、无气味、无细碎树脂为止。用高于树脂层10cm的95%乙醇浸泡24h，放出浸液，再用蒸馏水洗至无醇味。
用2倍柱体积4-5%HCl溶液洗柱，浸泡4-8h，排去酸液，用蒸馏水洗至中性，再用2倍柱体积的2-5%NaOH溶液洗柱，浸泡4-8h，排除碱液，用蒸馏水洗至中性，备用。
2.1.4罗布麻总黄酮的精提
上样：将所得的黄酮粗提取物即上样液，以4-5ml/min速度分别上样，至色带前沿距柱出口5cm时，停止加样。
洗脱：吸附20min后，用蒸馏水洗脱除去杂质，然后分别用20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和90%进行洗脱，洗脱速度为4-5ml/min。
将上样液洗脱得到的化合物减压浓缩至一定体积，即所得纯化的总黄酮化合物，保鲜膜封口，备用。
将上样、洗脱后得到的总黄酮化合物减压浓缩至粘稠状得到浸膏，将浸膏倒入坩埚，沸水浴加热浓缩，即得到罗布麻总黄酮，称重，计算得率。
2.2罗布麻总黄酮含量测定
2.2.1标准曲线的制备
精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于10mL容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀，放置6min，加1mol/L氢氧化钠溶液4mL，再用60%乙醇溶液稀释至刻度，放置15min后，分别在510nm处测定其吸光度（以试剂空白做参比）以吸光度A为纵坐标，浓度c（ug/mL）为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合，得c与A的线性回归方程以及相关系数R^2。得到回归方程：A=0.0118C+0.0023（r=0.9998）。在4.12～12.36mg/103ml浓度之间，吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。
2.2.2提取物中总黄酮含量的测定
按标准芦丁-吸光度测定法，以样液空白参比，精密称取提取物约10mg，加蒸馏水定容至100mL，取出0.5mL置10mL具塞试管中，按照“标准曲线制备”项下操作，于350nm波长下测得样品吸光度值，根据标准曲线求总黄酮含量。
计算公式为：样品总黄酮含量（%）=0.03692（A+0.1644）/W
注：上式为通过回归方程转化而来，式中A为测得样品液的吸光度值，W为称样量。
2.3罗布麻叶黄酮类化合物的抑菌活性测试
2.3.1样品和培养基的制备
将上述罗布麻总黄酮配制成浓度为5Omg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.565mg/ml的DMSO溶液备用。
细菌固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000ml，pH7．0～7．2，121℃灭菌20min。
细菌液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7．0～7．2，121℃灭菌20min。
2.3.2受试菌的培养
在超净工作台上用移液器将4℃冰箱保藏的大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪肠球菌的菌液吸取1ml，加入到50ml液体培养基中，37℃，140r/min培养10h。
用血球计数板计数法，用移液器分别从每种受试菌的培养基上吸取1ml于10mL无菌水中，充分振荡摇匀后，滴一滴放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，浓度控制在107-108CFu/ml。
2.3.3样品抑菌活性测定（滤纸片法）
用打孔器制备直径是6mm的滤纸片，放入培养皿中，于121℃高压蒸汽灭菌30min，然后高温烘干。将灭菌、烘干后的滤纸片浸于上述药液中，浸泡24h后，无菌风干，备用平均每滤纸片含药量体积为10μL。
用不同浓度的罗布麻叶黄酮类化合物对大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪肠球菌的抑菌活性进行检测，以10U/μg的青霉素作为阳性抑菌对照，以DMSO溶液作为阴性抑菌对照。
取制备好的的牛肉膏蛋白胨固体平板置于超净工作台上，用移液器吸取500μL稀释后的菌悬液接种于固体平板上，用涂布器涂均匀，用镊子将干燥好的滤纸片放置在平板上，铺平，每个平板放置4个滤纸片，每个滤纸片之间间隔不小于2cm，每个浓度做三组平行，放入培养箱中，37℃倒置培养24h，观察结果。整个过程遵循无菌操作。
3.结果与分析
以滤纸片法对罗布麻叶的黄酮类化合物进行抑菌活性的测试，结果如下表所示（抑菌圈的尺寸是用游标卡尺进行量取）：
罗布麻叶黄酮类化合物对大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪肠球菌的抑菌活性测定结果（表1）能够看出粪肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的对罗布麻叶中的黄酮类化合物低度敏感，金黄色葡萄球菌对罗布麻叶中的黄酮类化合物敏感性相对较弱，肺炎双球菌对罗布麻叶黄酮类化合物没有敏感性。
4.讨论
近几年来，有关学者从罗布麻植物中分离鉴定黄酮、多糖等多种天然成分及药理活性物质在临床上具有较大的应用价值。但关于罗布麻优质品种的筛选及合理用药，仍需不断深入研究。本文对罗布麻叶黄酮类化合物的对不同菌种的抑菌效果进行了比较研究，从研究结果可以看出，罗布麻对五种细菌均有不同程度的抑菌效果，但罗布麻叶对对大肠杆菌、绿脓杆菌、粪肠杆菌有较低的抑菌效果，而对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的抑菌效果不明显，这与王慧娟在《罗布麻有效成分分离与抑菌活性研究》中报道的罗布麻对不同菌种有较好的抑制作用［9］的研究结果不同，这可能是由于罗布麻叶黄酮类化合物的提取部位以及分离工艺的不同，也有可能与罗布麻的品种有关。在醇提后的罗布麻进行浓缩时发现有许多提取物析出，这可能是由于罗布麻中有部分成分不易溶于醇，因此，进一步的优化试验仍需开展。
本试验对罗布麻叶黄酮类化合物的抗菌效果作了初步研究，为罗布麻叶黄酮类化合物抑菌活性的研究奠定了一定的基础。罗布麻叶黄酮类化合物更深一步的抗菌研究和其对病原菌的作用机制还有待于进一步的研究、探讨。
参考文献：
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会[编].中华本草[M].上海科学技术出版社，1999
[2]李艳提，赵金凤，张卫明等.罗布麻茶总黄酮含量测定方法研究[J].食品科技.2010，35（06）：274-278
[3]延玺，刘会青，邹永青等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].有机化学.2008，28（09）：1534-1544
[4]曹纬国，刘志勤，邵云等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报.2003，23（12）：2241—2247