导读:本文包含了高恶性膀胱移行细胞癌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:高恶性膀胱移行细胞癌,显微切双向电泳,基质辅助激光解析,电离串联飞行时间质谱,mortalin
高恶性膀胱移行细胞癌论文文献综述
赵丽,张淑敏,赵园园,畅继武[1]（2011）在《高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白质组学研究及差异蛋白mortalin的表达验证》一文中研究指出目的:寻找高恶性膀胱移行细胞癌(BTCC)和正常膀胱黏膜的差异表达蛋白,并对筛选出的有潜在应用价值的差异蛋白进行再验证,试图发现与高恶性膀胱移行细胞癌发生、进展相关的生物学标记物。方法:联合手工显微切割、双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对高恶性膀胱移行细胞癌与癌旁相应正常膀胱移行上皮进行蛋白质的分离和鉴定。并采用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术对鉴定出的差异蛋白进行再验证。结果:共鉴定出11个差异表达蛋白,其中细胞角蛋白7(CK-7)、细胞角蛋白8(CK-8)、热休克蛋白60(HSP60)、膜联蛋白Ⅴ、抑制素这5个蛋白曾在文献中报道过,其表达失调与BTCC的发生发展可能相关;其余6个蛋白,包括mortalin、14-3-3ε蛋白、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白、膜联蛋白Ⅳ、结蛋白、微管蛋白β4,目前尚未见到与BTCC的相关报道。半定量RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示mortalin在高恶性膀胱移行细胞癌中mRNA和蛋白表达水平均高于正常膀胱移行上皮(P<0.01)。结论:高恶性BTCC的蛋白表达谱与相应正常的膀胱移行上皮相比有明显差异,由此表明膀胱移行细胞癌的发生是一个多基因多途径参与的复杂过程。mortalin蛋白在高恶性膀胱移行细胞癌中的表达明显上调与双向电泳的结果一致,mortalin可能成为一个潜在的、有应用价值的膀胱移行细胞癌的标记物。(本文来源于《中国肿瘤临床》期刊2011年04期）
赵丽[2]（2009）在《高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白质组学研究及mortalin的表达验证》一文中研究指出目的膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一。在我国泌尿、男生殖系统肿瘤中,膀胱癌的发病率和病死率均占首位,所以膀胱癌始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。90%的膀胱肿瘤为移行细胞癌,近年来畅继武教授发现,膀胱移行细胞癌从生物学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型,常被称之为两类癌。两类癌概念的提出为人们从分子水平与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角,并为阐明其发病机制与指导治疗,以及推测预后提供了更具科学性的依据,具有重要的理论与现实意义。因此,本研究以两类癌为基础,运用蛋白质组学的研究策略对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行了蛋白质表达谱的差异分析,并对筛选出的有潜在应用价值的差异蛋白进行再验证,试图发现与高恶性膀胱移行细胞癌发生进展相关的生物学标记物,并初步探讨其临床应用价值。方法1.收集高恶性膀胱移行细胞癌的膀胱全切标本,利用手工显微切割联合双向电泳、考马斯亮蓝染色,对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行蛋白分离。采用凝胶图像分析软件并结合人工比对从两块胶匹配点中筛选出差异3倍及其以上的蛋白点,为后续质谱分析奠定基础。2.对于双向电泳分离出的,凝胶图像选定的差异蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行蛋白质鉴定分析,对得到的肽质量指纹图谱和部分肽段氨基酸序列结合其等电点、分子量、物种来源、修饰情况等参数在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定。3.采用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术对从第一和第二部分筛选鉴定出的差异蛋白mortalin进行mRNA水平和蛋白水平的表达验证。扩展的免疫组织化学检测mortalin在34例初发膀胱移行细胞癌中的表达情况,联系临床病理资料,初步探讨其临床的应用价值。结果1.成功得到了高恶性膀胱移行细胞癌和相应正常膀胱移行上皮的双向电泳图谱,通过凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点,并从中筛选出了20个差异较大的蛋白点(差异3倍及以上)。2.利用MALDI-TOF/TOF-MS仪结合数据库检索对上述20个蛋白点进行鉴定。最后得到符合条件的差异表达蛋白11个,其中mortalin、角蛋白7(CK-7)、微管蛋白β4(Tubulin beta-Ⅲ)、抑制素(Prohibitin)、膜联蛋白Ⅳ(Annexin A4)、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白(PDIA6)、HSP60在肿瘤组织中表达上调;角蛋白8(CK-8)、14-3-3ε蛋白、膜联蛋白V(Annexin A5)、结蛋白(Desmin)在肿瘤组织中表达下调。运用蛋白数据库和文献数据库的大量信息,对上述11种蛋白进行相关信息的汇总分析,其中5个蛋白在文献中曾经报道过,其表达失调与膀胱癌的发生发展可能相关;其余6个蛋白目前尚未见到与膀胱癌的相关报道,包括:mortalin、14-3-3ε蛋白、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白、膜联蛋白Ⅳ、结蛋白、微管蛋白β4。3.半定量RT-PCR和免疫组织化学结果显示mortalin在高恶性膀胱移行细胞癌中mRNA和蛋白表达水平均高于正常膀胱移行上皮(P<0.01),与2-DE变化趋势一致。同时免疫组化证实mortalin主要定位在肿瘤细胞和移行上皮细胞的胞浆中。扩展的免疫组化研究表明:在膀胱移行细胞癌中mortalin的高表达与肿瘤的病理分级(R=0.601,P<0.01)和TNM分期(R=0.021,P<0.05)相关,mortalin的表达与其他临床病理特征,如肿瘤大小、部位、数目等未见明显相关。结论1.联合应用手工显微切割与蛋白组学技术,成功建立了高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常膀胱移行上皮差异蛋白组学的研究方法。2.高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白表达谱与相应正常的膀胱移行上皮组织相比有明显差异,经质谱鉴定了11个差异表达蛋白,表明膀胱移行细胞癌的发生是一个多基因多途径参与的复杂过程。3.Mortalin蛋白在高恶性膀胱移行细胞癌中的表达明显上调,结合扩展的免疫组化检测与临床病理资料相关性研究的结果表明:mortalin可能成为一种潜在的、有应用价值的预测膀胱移行细胞癌恶性程度及侵袭能力的肿瘤标记物。(本文来源于《天津医科大学》期刊2009-05-01）
牛海涛,孙光,张一兵,韩瑞发,王海涛[3]（2007）在《联合激光捕获显微切割与二维液相色谱串联质谱研究低恶性膀胱移行细胞癌蛋白表达谱和生物通路》一文中研究指出探索 Shotgun 蛋白质组学方法筛选浅表膀胱移行细胞癌的生物标记组,并分析肿瘤恶性变过程中的生物通路。使用激光捕获显微切割技术(LCM)获得纯化的浅表膀胱肿瘤细胞及正常移行上皮细胞250,000 shoots,提取细胞总蛋白,并测定蛋白浓度。胰蛋白酶消化蛋白质混合物。二维液相色谱电喷雾串联质谱(2D-LC-MS/MS)鉴定标本中的蛋白质表达,(本文来源于《第六次全国中西医结合泌尿外科学术会议暨第二届湖南省中西医结合泌尿外科学术会议论文汇编》期刊2007-06-01）
牛海涛[4]（2007）在《联合激光捕获显微切割与二维液相色谱串联质谱研究低恶性膀胱移行细胞癌蛋白表达谱和生物通路》一文中研究指出目的：膀胱癌是我国最常见的泌尿肿瘤。近年来研究发现，膀胱移行细胞癌从生物学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型(常被称之为两类癌)。两类癌概念的提出为人们从分子与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角，并为阐明其发病机制与指导治疗，以及推测预后提供了更具科学性的依据，具有重要的理论与现实意义。因此，本研究即是在其指引下，寻找其差异表达蛋白，探究低恶性膀胱移行细胞癌的生物标记以及发病机制，进而揭示其发病规律。同时，这也正是膀胱癌研究领域亟待解决的难题之一。目前高通量研究蛋白质表达差异的主流技术是双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoreus，2-DE)，它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦(IEF)电泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的分子量不同进行分离。经过2DE以后，二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白，这样不同的蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。目前已经有几项膀胱肿瘤的的差异蛋白质组学研究，但鉴定的蛋白质数目很有限，并不能体现出蛋白质组学技术中的高通量，而且2DE蛋白质组学技术存在操作繁琐、不稳定和低丰度的蛋白不易检测等缺点，发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法成为国际蛋白质组学技术研究最主要的目标。二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱—毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。这些蛋白质分离技术需要的样本含量低，分离的效率高，而且不受分子量和等电点的限制。在充分考虑了2DE技术的缺点并分析了蛋白质组学技术进展后，本实验决定中采用质谱鸟枪法(Shotgun)即2D-LC-MS／MS质谱联用策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。另一个重要的原因是在2DE蛋白质组学技术中需要样本含量大很难采用LCM技术，而shotgun策略中由于蛋白质混合物分离方法的改进，对蛋白质上样量的需求减少，从而使的LCM与2D-LC-MS／MS的联合应用成为可能。本研究在天津市应用基础研究重点项目(043114211)和国家自然基金项目(30371601／C03031903)资助下，采用美国Thremo公司的ProteomeX-LTQ，结合激光捕获显微切割鉴定了低恶性移行上皮癌以及相应正常尿路上皮的蛋白质表达谱。在蛋白质鉴定的基础上构建了低恶性膀胱癌全蛋白质组表达开放数据库，初步筛选出了与低恶性膀胱癌发病相关的候选差异表达蛋白质，并结合功能聚类分析工具ArrayTrack和GenMAPP初步描绘了低恶性膀胱移行细胞癌相关的生物通路。进一步的分析中通过与本课题组前期工作中鉴定的高恶性膀胱移行细胞癌蛋白质表达谱相比对，寻找出了两类癌发生发展中肿瘤表型差异的分子基础。方法：1．激光捕获显微切割获得正常膀胱移行上皮细胞以及肿瘤细胞：采用Pix CellⅡLCM激光捕获显微切割设备获得正常移行上皮以及肿瘤细胞各250，000shots，裂解后分别获得185.2μg、147.6μg总蛋白，为进一步质谱分析奠定基础。2．使用Finnigan线性离子阱串联质谱仪(LTQ)进行液相色谱一串联质谱鉴定正常上皮以及肿瘤细胞的蛋白质表达谱，将实验结果与目前已经证实的膀胱癌及肿瘤差异表达蛋白进行比较，同时选择2个差异表达蛋白质进行免疫蛋白印迹以及免疫组织化学验证。3．生物信息学工具分析鉴定的蛋白质：使用蛋白质分析工具鉴定蛋白质的基本理化性质，包括总体平均亲水性，跨膜区预测，分子量以及等电点。并初步对比正常上皮细胞蛋白质表达与肿瘤细胞表达蛋白的理化性质。4．以本表达谱中鉴定的蛋白质为基础为蛋白质生物标记寻找进行循证生物医学探索，以期得到生物标记蛋白基本理化性质的特点。5．GO软件分析肿瘤蛋白质表达谱以及差异表达蛋白质谱。GO分析的同时计算GO浓集／缺失表达，以了解肿瘤的细胞生理，并与尿液中蛋白质的GO分析比对，探索尿液中侯选生物标记蛋白的来源。5．数据库构建：Dreamweave以及XMLeditor为主要软件构建开放蛋白质表达数据库。数据库内容包括TurboSequest软件产生的原始数据以及整理后的蛋白质列表，同时包括LCM的实验细节，标本准备，2D-LC-MS／MS，以及GO分析结果。6．通路分析及可视化。将正常上皮细胞以及肿瘤细胞差异表达蛋白质的IPI标记号转化为SWISSPORT-ACC-NUMBER，然后输入ArrayTrack V.3.3.0软件包，对目前已知的生物通路进行基因差异表达分析，检索生物通路数据库为KEGG.。将差异表达蛋白质的IPI标记号转化为Protein-RefSeQ，按照软件要求的格式输入GenMAPP软件，实现生物通路的可视化。同样的方法分析高恶性移行上皮癌的蛋白质表达谱为进一步分析两类癌的不同分子机制奠定基础。结果：1．蛋白质表达谱结果：440个蛋白质表达于肿瘤细胞，其中24个假定蛋白，24个疏水性蛋白质(5.5％)，TMHMM程序预测跨膜蛋白38个(8.6％)，84个(19.1％)蛋白质PI＞9；76个(17.3％)蛋白质分子量＜10 kDa或者＞100 kDa。218个蛋白质表达于正常上皮细胞，其中19个假定蛋白，11个疏水性蛋白质(5.0％)；TMHMM程序预测跨膜蛋白13个(6.0％)，40个蛋白质(18.3％)PI＞9；42个蛋白质(19.3％)分子量＜10 kDa或者＞100 kDa。肿瘤细胞及正常细胞间差异表达的蛋白质为388个，305个特异表达于肿瘤细胞，83个特异表达于正常上皮细胞。差异表达蛋白质中分子量最大以及最小值分别为7.86和1005.20 kDa，PI分布范围为3.67-11.91。2．免疫蛋白印迹以及免疫组织化学结果显示：NHERF在肿瘤组织中的表达明显上调(P＜0.05)，TPD52在肿瘤组织中特异性表达(P＜0.05)。免疫组织化学结果显示：TPD52和NHERF在膀胱癌中的表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜中的表达阳性率，差异均有统计学意义(P＜0.01)。膀胱癌组织中TPD52的阳性表达率随着肿瘤病理分级的升高而增加(P＜0.05)，而与肿瘤浸润深度不具相关性(P＞0.05)。NHERF的表达与膀胱癌的病理分级、浸润深度均不具相关性(P＞0.05)。3．循证生物医学探索结果：129个蛋白质被定义为生物标记，其他蛋白为非生物标记，这两个蛋白组间PI，MW，GRAVY，跨膜区均没有统计学差异。按照PI区分蛋白质时，71个蛋白PI＞9，317个蛋白PI≤9，这两个组中分别有21和108个蛋白被定义为生物标记，这两个组之间的生物标记和非生物标记的PI均数以及标准差之间没有统计学差异。按照MW分组时，MW 10-100共305个蛋白，MW＜10或者＞100共83个蛋白。这两个组中分别有32和97个蛋白被定义为生物标记，这两个组之间的生物标记和非生物标记的MW均数以及标准差之间也没有统计学差异。2DE检测范围内蛋白中生物标记的检出率与检测范围外生物标记的检出率之间没有统计学差异。多元线形Logistic回归显示PI，MW，GRAVY，跨膜区与生物标记均没有相关性。4．GO分析结果：低恶性膀胱移行上皮癌中共鉴定440个蛋白质。按人类GO slim v1.8划分440个蛋白质中具有生物学途径、细胞成分、分子功能注解的蛋白质分别为312个(70.9％)、304个(69.1％)、346个(78.6％)。按照GO 4级分支术语生物学途径、细胞成分、分子功能中浓集／缺失表达的蛋白分别为41／22、25／11、23／20种。按人类GO slim v1.8划分差异表达蛋白质中具有生物学途径、细胞成分、分子功能注解的蛋白质分别为267个(68.8％)、256个(66.0％)、297个(76.5％)。细胞黏附、细胞增殖、细胞循环、细胞分化、细胞信号传导途径中的蛋白质分别为10、13、9、10、37个。5．数据库的构建：数据库包括4个主要内容：标本信息、实验过程、质谱鉴定数据、GO分析结果。质谱鉴定数据中包括蛋白质名称、蛋白质描述、多个蛋白质数据库的登陆号、MW以及PI、总体平均疏水性、跨膜结构。蛋白质的交叉数据库标记号也包括在质谱鉴定数据中，包括IPI，Swiss-port，TrEMBL，RefSeQ，Ensembl和H-Inv等。质谱鉴定数据采用XML格式。GO分析结果采用表格形式来描述蛋白质的生物学途径、分子功能以及细胞组分。按照GO分支术语将蛋白质聚类，储存于同一数据层，同时包括蛋白质的浓集／缺失表达分析。鉴定蛋白质的IPI标记号在数据库中与GO分支术语直接关联，因此拥有共同GO分支术语的蛋白列表于同一数据层，GO分析中同时包含GO浓集／缺失表达分析。在数据库中，用户可以在GO等级术语蛋白质列表中指定感兴趣的蛋白质，通过超链接可以获得储存于欧洲生物信息学研究所的GO术语信息以及蛋白质信息。同时为了方便用户查询，数据库中提供了简单的根据蛋白质标记号的查询服务。数据库储存于http://www.Proteome-NHTE.org.cn，及http://www.Proteome-SBTCC.org.cn。6．生物通路分析结果：ArrayTrack软件分析差异表达蛋白质，结果显示低恶性膀胱移行细胞癌中129个差异表达的蛋白定位于目前已知的生物通路，这些差异表达的基因主要属于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受体相互作用、Toll-like受体通路、细胞通信、聚合黏附、核糖体、MAPK信号通路等。高恶性移行细胞癌中181个差异表达的蛋白定位于目前已知的生物通路，通路分析结果显示，两类癌中涉及的差异通路基本一致，但每个通路中发生改变的蛋白并不相同。结果提示肿瘤发生发展过程中涉及多基因、多通路复杂的基因网络异常；两类癌存在不同的驱动机制。结论：1．本研究在国内首次联合应用激光捕获显微切割与蛋白质组学技术成功构建了膀胱癌差异表达蛋白谱。在低恶性膀胱移行细胞癌与相应正常膀胱粘膜之间选出388个差异表达蛋白质，其中包括305个特异表达于肿瘤细胞，83个特异表达于正常上皮细胞，说明膀胱癌发生发展过程中存在多蛋白质表达异常，这些差异表达蛋白质为膀胱癌分子机制研究提供了大量有价值的信息。2．在差异表达蛋白谱中挑取出2个差异蛋白TPD52，NHERF进行经典的免疫蛋白印迹检测，结果显示与正常膀胱粘膜比较，TPD52，NHERF水平在低恶性膀胱移形细胞癌中差异表达，而且这两个蛋白均通过一个肽段鉴定，证实了联合激光捕获显微切割与串联质谱进行表达谱研究的可靠性。应用免疫组化技术研究了TPD52和NHERF在膀胱癌组织中的表达及临床意义，结果显示：TPD52和NHERF在膀胱癌中表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜中的表达阳性率，差异均有显着意义(P＜0.05)。膀胱癌组织中TPD52的阳性表达随着肿瘤病理分级的升高而增加(P＜0.05)，而与浸润深度无相关性(P＞0.05)。NHERF的表达与浸润深度、病理分级均不具相关性(P＞0.05)。3．循证分析的结果显示：PI、MW不能预测生物标记，尚需要发展其他方法来指导2DE蛋白质组学技术中对差异表达蛋白质的选择性切胶；Shotgun策略不但扩大了蛋白质的检出范围，同样扩大了生物标记的检出；蛋白质的基本理化描述，包括PI，MW，跨膜预测，GRAVY对生物标记的发现没有预测意义；尚需要发展其他的生物信息学预测方法来预测为知蛋白成为生物标记的可能性。4．对肿瘤蛋白质表达谱的GO浓集／缺失表达分析对深入了解低恶性浅表膀胱移行细胞癌的细胞生物学、发生发展机制提供了理论依据，并根据PubMed文本信息挖掘揭示了倾向于在尿液中浓集表达的蛋白质类别，为制备小型蛋白质芯片从尿液中无创检测肿瘤提供了理论依据，并进一步证实了本实验结果的可靠性。5．按照国际蛋白质组学研究惯例，在蛋白质鉴定信息以及功能分析的基础上，建立了开放数据库，为蛋白质信息交流和比对提供了平台。GO分支术语以及蛋白质列表均与欧洲生物信息学中心建立超链接。用户可以在任何等级指定GO术语，或者选定列表中的蛋白质，通过超链接获得储存于QuickGO(http://www.ebi.ac.uk/ego/)的GO数据或者存放于欧洲生物信息学研究所数据库(http://www.ebi.ac.uk/IPI)的蛋白质信息。6．系统水平上的低恶性膀胱移行细胞癌、高恶性移行细胞癌差异表达蛋白质功能聚类分析显示，差异表达蛋白主要归属于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受体相互作用、Toll-like受体通路、细胞通信、聚合黏附、核糖体、MAPK信号通路等，但两类癌差异通路中涉及的具体蛋白并不相同。这些通路很可能在两类癌的发生和发展过程中发挥重要作用。与由此可见，基于整个生物通路水平上的蛋白功能聚类与生物通路分析，可能会有助于从系统生物学的角度对肿瘤发生和发展进行再认识。同时两类癌生物通路中的差异蛋白为发展蛋白质芯片监测肿瘤进展以及评价预后奠定了基础。7．进一步深入研究这些差异表达蛋白及功能通路不仅有助于阐明膀胱癌发生发展的机制，而且还可能会为膀胱癌提供新的诊断和治疗靶点。(本文来源于《天津医科大学》期刊2007-05-01）
李旭东[5]（2006）在《高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常上皮比较蛋白质组学的初步研究》一文中研究指出作为泌尿系统最常见的肿瘤,膀胱癌始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。膀胱肿瘤中的绝大多数病例为移行细胞癌(BTCC)。移行细胞癌中主要是浅表肿瘤,约占70%,可以通过化疗及经尿道电切手术治疗。但膀胱癌复发率高,其中一部分病情进展并发展为肌层浸润或转移,10—15%的肿瘤有可能进展为危及生命的高恶性肿瘤。目前病理分级和临床分期是评估治疗手段及临床效果的最主要因素。然而,病理分级无法预判肿瘤复发,也无法了解致癌机制。 为了提高膀胱癌的诊断水平及改善预后,迫切需要找到疾病的分子标记物。采用病人组织标本是发现诊断及预后标记的最直接及最有说服力的方式。BTCC的致癌机制涉及复杂的细胞变化。更好地了解致癌的分子机制有助于寻找更有力的治疗的分子靶点及评估病人复发的可能性。近来基因组学及蛋白质组学的进步使得我们可以更好地理解肿瘤形成的相关分子事件以及寻找分子标记及治疗靶点。 蛋白质是生命活动的直接执行者,本质上蛋白质组学反映了有机体的状态,而基因组则要稳定的多。更好地了解膀胱癌形成机制的重要一步是建立膀胱癌的蛋白质表达谱,并找出异常表达蛋白,即比较蛋白质组学。从高恶性BTCC与(本文来源于《天津医科大学》期刊2006-05-01）
齐湘杰[6]（2003）在《高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常上皮差异表达基因的克隆及功能研究》一文中研究指出膀胱癌的发生发展跟多种基因的突变和表达异常有关，要弄清楚其确切的机制，需要对选择性表达的基因进行分离、克隆和序列分析，并对其氨基酸组成、表达产物和结构功能等进行相应的研究。以往研究基因表达差异的方法很多，但最行之有效的方法是Diatchenko建立的抑制消减杂交技术，它不仅特异性高、灵敏度高、假阳性率低，而且能克隆高、低丰度基因。 本课题应用抑制消减杂交技术构建人膀胱移行细胞癌和正常膀胱上皮组织差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出BTCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。应用Northern blot技术对所克隆的高拷贝新基因片段进行差异表达分析；对其中有明显差异表达的膀胱癌特异的新基因片段应用SMART RACE技术进行全长克隆，应用免疫荧光原位杂交技术进行染色体定位，并初步推断所克隆的新基因全长序列的编码区和蛋白结构。应用反义核酸技术阻断该新基因在膀胱癌EJ细胞中的表达后，观察膀胱癌EJ细胞形态、生长、凋亡、死亡、转移、增殖活性等的变化，通过以上研究来探讨该新基因的功能。最后应用RT-PCR技术检测新基因在不同分级、分期临床膀胱癌标本中的表达及意义。 研究结果表明:应用SSH技术构建了具有高消减效率的人膀胧癌组织cDNA消减文库，文库中含有376个阳性克隆和83个阴性克隆，阳性克隆率为78%。随机挑出的100个阳性克隆中，89个克隆载有插入片段，片段插入率达84%，提示每一克隆均有插入特异片段的可能性。在89个克隆中，有76个克隆含有肿瘤差异表达的基因片段，4个克隆含有可能污染的基因片段，9个克隆含有未消减掉的来自正常组织的基因片段，说明SSH具有很高的消减效率。对76个克隆中的插入片段进行同源性比对分析，其中有66个克隆代表23种已知基因，其余的IC个克隆代表5种未知基因，这表明消减文库中37%的克隆代表着不同的基因。在23种差异表达的己知基因中，18种为跟膀肤癌有关的基因，其余5种基因目前尚无文献报道跟膀肤癌有关，这些差异表达基因的克隆为膀肤移行细胞癌的进一步研究提供了新的线索，可能从中筛选到膀肤移行细胞癌新的治疗靶点或瘤标。结合其他已发现的差异表达的已知基因，绘制膀肤移行细胞癌差异表达的基因谱，以利彻底阐明其发生、发展的分子生物学机制。 未知新序列中BQ135232共有3个拷贝。Northern杂交分析显示它在膀肤癌组织中明显表达，而在正常膀胧组织中无明显表达，这表明BQ135232是膀胧癌特异表达的新基因。应用SMART RACE技术获得BQI 35232的全长，经GENBANK检索证明其为序列和功能均未知的新基因。应用免疫荧光原位杂交染色体定位结果显示BQ135232位于第12号染色体近末端处。组织分布显示BQI 35232在膀脱癌组织和膀肤癌细胞株中特异性高表达，而在正常膀眺组织表达量极低甚至不表达，在肾癌、前列腺癌组织及非膀肤癌细胞株中表达则很低，在乳腺癌组织、j反津医科大学博d匕学位论文、肺癌组织、肝癌组织及宫颈癌组织中未见明显的表达。BQ135232反义寡核昔酸转染膀肮癌EJ细胞后，可明显抑制其生长、降低其增殖活性、减少核分裂、并诱导其持续性凋亡。应用RT一PCR技术检测BQI 35232在不同分级、分期膀胧癌标本中的表达，结果表明BQ 1 35232在高级、高期膀胧癌中的表达明显高于在低级、低期膀肤癌中的表达。本研究表明BQ135232是跟膀肤癌发生发展密切相关的新基因，它的表达与膀肤癌细胞的生长、增殖、抗凋亡密切相关。它的成功克隆为阐明膀胧癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径，为今后膀胧癌的诊断、治疗提供了新的理论依据。(本文来源于《天津医科大学》期刊2003-05-01）
高恶性膀胱移行细胞癌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一。在我国泌尿、男生殖系统肿瘤中,膀胱癌的发病率和病死率均占首位,所以膀胱癌始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。90%的膀胱肿瘤为移行细胞癌,近年来畅继武教授发现,膀胱移行细胞癌从生物学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型,常被称之为两类癌。两类癌概念的提出为人们从分子水平与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角,并为阐明其发病机制与指导治疗,以及推测预后提供了更具科学性的依据,具有重要的理论与现实意义。因此,本研究以两类癌为基础,运用蛋白质组学的研究策略对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行了蛋白质表达谱的差异分析,并对筛选出的有潜在应用价值的差异蛋白进行再验证,试图发现与高恶性膀胱移行细胞癌发生进展相关的生物学标记物,并初步探讨其临床应用价值。方法1.收集高恶性膀胱移行细胞癌的膀胱全切标本,利用手工显微切割联合双向电泳、考马斯亮蓝染色,对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行蛋白分离。采用凝胶图像分析软件并结合人工比对从两块胶匹配点中筛选出差异3倍及其以上的蛋白点,为后续质谱分析奠定基础。2.对于双向电泳分离出的,凝胶图像选定的差异蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行蛋白质鉴定分析,对得到的肽质量指纹图谱和部分肽段氨基酸序列结合其等电点、分子量、物种来源、修饰情况等参数在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定。3.采用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术对从第一和第二部分筛选鉴定出的差异蛋白mortalin进行mRNA水平和蛋白水平的表达验证。扩展的免疫组织化学检测mortalin在34例初发膀胱移行细胞癌中的表达情况,联系临床病理资料,初步探讨其临床的应用价值。结果1.成功得到了高恶性膀胱移行细胞癌和相应正常膀胱移行上皮的双向电泳图谱,通过凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点,并从中筛选出了20个差异较大的蛋白点(差异3倍及以上)。2.利用MALDI-TOF/TOF-MS仪结合数据库检索对上述20个蛋白点进行鉴定。最后得到符合条件的差异表达蛋白11个,其中mortalin、角蛋白7(CK-7)、微管蛋白β4(Tubulin beta-Ⅲ)、抑制素(Prohibitin)、膜联蛋白Ⅳ(Annexin A4)、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白(PDIA6)、HSP60在肿瘤组织中表达上调;角蛋白8(CK-8)、14-3-3ε蛋白、膜联蛋白V(Annexin A5)、结蛋白(Desmin)在肿瘤组织中表达下调。运用蛋白数据库和文献数据库的大量信息,对上述11种蛋白进行相关信息的汇总分析,其中5个蛋白在文献中曾经报道过,其表达失调与膀胱癌的发生发展可能相关;其余6个蛋白目前尚未见到与膀胱癌的相关报道,包括:mortalin、14-3-3ε蛋白、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白、膜联蛋白Ⅳ、结蛋白、微管蛋白β4。3.半定量RT-PCR和免疫组织化学结果显示mortalin在高恶性膀胱移行细胞癌中mRNA和蛋白表达水平均高于正常膀胱移行上皮(P<0.01),与2-DE变化趋势一致。同时免疫组化证实mortalin主要定位在肿瘤细胞和移行上皮细胞的胞浆中。扩展的免疫组化研究表明:在膀胱移行细胞癌中mortalin的高表达与肿瘤的病理分级(R=0.601,P<0.01)和TNM分期(R=0.021,P<0.05)相关,mortalin的表达与其他临床病理特征,如肿瘤大小、部位、数目等未见明显相关。结论1.联合应用手工显微切割与蛋白组学技术,成功建立了高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常膀胱移行上皮差异蛋白组学的研究方法。2.高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白表达谱与相应正常的膀胱移行上皮组织相比有明显差异,经质谱鉴定了11个差异表达蛋白,表明膀胱移行细胞癌的发生是一个多基因多途径参与的复杂过程。3.Mortalin蛋白在高恶性膀胱移行细胞癌中的表达明显上调,结合扩展的免疫组化检测与临床病理资料相关性研究的结果表明:mortalin可能成为一种潜在的、有应用价值的预测膀胱移行细胞癌恶性程度及侵袭能力的肿瘤标记物。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
高恶性膀胱移行细胞癌论文参考文献
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标签：高恶性膀胱移行细胞癌; 显微切双向电泳; 基质辅助激光解析; 电离串联飞行时间质谱; mortalin;