一、IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中提出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
王春丽[2]（2021）在《猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对成骨细胞和骨骼肌细胞分化的影响及机制研究》文中研究指明小型猪在解剖学、形态学和生理学等方面与人类有许多相似之处,具有作为生物医学动物模型不可替代的优势。了解小型猪的遗传背景和矮小体型形成机理是利用小型猪模型进行科学研究的前提,但目前缺乏对小型猪体型矮小形成机制的系统研究。动物体骨大小（骨量、体积）、骨生长和肌肉生长发育被认为是哺乳动物体型的重要指标,并且受生长因子和激素调控的细胞信号通路的影响。大型猪与小型猪在GH-IGF-1生长轴上积累了大量的可遗传变异。其中,胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）的胞外结构域（ECD）通过与IGF-1结合进而激活下游信号通路,在调节机体生长、骨基质矿化及肌肉发育等方面起到至关重要的作用。因此阐明Igf1r基因上变异的作用机制能够为探索小型猪体型矮小的形成机制提供理论支持。课题组前期在大型猪和小型猪Igf1r编码区序列（CDS）筛选得到9个强连锁同义突变,其中4个位于胞外域（ECD）编码区,5个位于胞内域（ICD）编码区,且研究发现Igf1r胞内结构域的同义突变影响细胞增殖并改变激酶活性。在此基础上,本研究拟阐明Igf1r ECD编码区4个同义突变形成的两种单倍型对成骨细胞和骨骼肌细胞分化的影响及机制。本实验首先利用CRISPR/Cas9技术构建Igf1r敲除细胞系,命名为MC3T3-KO细胞（KO组）,以避免细胞内源Igf1r的干扰。同时构建了两对包含大型猪（LP）和小型猪（BM）Igf1r不同单倍型的表达载体,分别命名为p B513B-LP、p B513B-BM、pc DNA.3.1-LP和pc DNA.3.1-BM。利用piggy Bac转座系统,将包含Igf1r两种单倍型（p B513B-LP和p B513B-BM）载体分别转入到MC3T3-KO细胞中,免疫荧光和免疫印迹法验证Igf1r两种单倍型的表达情况。结果显示,Igf1r两种单倍型在MC3T3-KO细胞中稳定表达,并分别命名为MC3T3-LP细胞（LP组）和MC3T3-BM细胞（BM组）。利用q RT-PCR和Western Blot检测Igf1r两种单倍型的表达量,结果表明,在转录水平和翻译水平BM组IGF-1R的表达量均显着低于LP组（P<0.05）。随后将pc DNA.3.1-LP和pc DNA.3.1-BM载体分别转染至猪骨骼肌卫星细胞和成肌细胞中,Western Blot检测结果表明,在翻译水平,两种细胞中BM组Igf1r的表达量均显着低于LP组（P<0.05）。为了进一步探究Igf1r ECD的4个同义突变影响基因表达的分子机制,利用软件预测表明Igf1r ECD的4个同义突变改变了Igf1r编码基因的m RNA二级结构。进一步通过Act D和CHX处理实验探究Igf1r单倍型对其m RNA稳定性和蛋白质稳定性的影响,结果表明,BM组Igf1r的m RNA稳定性和蛋白质稳定性均显着高于LP组（P<0.05）。由于其同义突变编码的氨基酸位于与IGF-1结合区域附近,利用免疫共沉淀技术检测Igf1r两种单倍型对其与IGF-1结合效率的影响,结果表明,BM组的IGF-1R与配体IGF-1的结合率显着低于LP组（P<0.05）。由于受体在细胞膜表面与配体结合并发挥功能,利用流式细胞术检测了两组细胞细胞膜表面IGF-1R的分布情况,结果显示,BM组IGF-1R的相对膜表达率低于LP组（P<0.05）。为进一步探究可能导致IGF-1R与IGF-1结合差异的原因,利用构象敏感型IGF-1R抗体检测Igf1r两种单倍型对其蛋白质构象的影响。结果表明,Igf1r的四个同义突变产生的两种单倍型影响了IGF-1R蛋白质构象。利用CCK-8实验探究Igf1r的四个同义突变产生的两种单倍型对成骨细胞增殖的影响。结果显示,三组细胞中,KO组细胞增殖能力最低,且与BM组相比,LP组细胞表现出更好的细胞增殖能力（P<0.05）。进一步通过q RT-PCR和茜素红染色等检测成骨细胞分化指标,结果表明LP组和BM组的成骨细胞ALP活性明显高于KO组,BM组早期成骨分化明显,而LP组末期成骨分化较强（P<0.05）。对成骨分化关键基因（Col-1、Alp、Opn、Ocn、Runx2和Osx）的表达分析也与这一结果相符（P<0.05）;成骨矿化作为最后一步被检测,LP组晚期成骨矿化明显（P<0.05）。为探究Igf1r不同单倍型是否影响相关分化通路的激活,利用Western Blot检测结果表明,分化0-2d,BM组AMPK-T172的磷酸化水平显着高于LP组（P<0.05）;分化3-9d,BM组的AMPK-T172磷酸化水平显着低于LP组（P<0.05）;分化3-21d,BM组的AKT S473的磷酸化水平持续低于LP组（P<0.05）。通过CCK-8实验探究Igf1r的四个同义突变产生的两种单倍型对骨骼肌细胞增殖的影响,结果显示:与BM组相比,LP组细胞表现出更好的细胞增殖能力（P<0.05）。进一步利用Western Blot检测增殖相关因子和下游信号通路关键因子的表达来阐明其机制,结果表明,BM组Cyclin D1含量明显低于LP组（P<0.05）。通路检测结果显示,LP组比BM组更显着地促进PI3K/AKT信号通路（P<0.05）。为探究Igf1r两种单倍型对肌肉分化的影响,利用Western Blot检测分化相关因子和下游信号通路关键因子的表达,结果表明,与BM组相比,LP组表现出更好的细胞分化能力（P<0.05）。进一步检测分化相关因子结果显示,BM组Myo D分化因子表达量明显低于LP组（P<0.05）,通路检测与细胞分化结果一致,LP组比BM更显着地促进PI3K/AKT信号通路（P<0.05）。以上结果表明,Igf1r胞外域编码区的四个同义突变影响基因的转录、翻译、IGF-1R蛋白质构象以及其与IGF-1的结合情况,进而影响IGF-1R下游通路的激活,最终导致成骨细胞和骨骼肌细胞分化的差异,为小型猪的体型矮小形成机制提供理论数据。
王思瑶[3]（2021）在《IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析》文中进行了进一步梳理除环境、营养等因素的制约,动物的生长发育调控还受到长期的遗传选择,其中神经内分泌生长轴中的IGF-1基因被认为对机体生长发挥至关重要的作用。小型猪因独有的生理特性和其比例性矮小的体型而备受关注。为探究体型形成的潜在调控机制,课题组在观察到不同体型猪IGF-1表达差异的基础上,筛查出不同体型猪IGF-1基因外显子上仅有1个同义突变c.258A>G,并初步在细胞水平检测到了该同义突变对基因表达的影响。研究表明同义突变能够通过影响蛋白质合成过程中的多个方面来影响基因的表达,此外,还能通过改变新生肽链折叠方式进而在不改变氨基酸种类的前提下影响蛋白质的生物学功能。但目前对同义突变分子机制的解析仍局限于体外实验,因此,本实验首先构建动物单碱基突变模型旨在体内水平解析IGF-1基因同义突变c.258A>G的作用及作用机制。随着单碱基编辑技术的不断突破,本研究利用ABEmax碱基编辑器构建IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型。鉴定基因型和脱靶情况后,稳定遗传至F2代小鼠。为探究该同义突变是否影响IGF-1基因表达,本实验分别用RT-q PCR和Western Blot检测野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠在不同生长发育时期肝脏中IGF-1基因表达情况,并利用ELISA检测血清中IGF-1的分泌情况。实验结果发现相比较于野生型小鼠,6周龄和8周龄纯合突变小鼠肝脏IGF-1表达水平具有一定下降趋势,但无显着性差异（p>0.05）,而8周龄IGF-1 c.258A>G纯合突变小鼠血清中IGF-1分泌水平呈现出显着性降低（p<0.05）。与此同时,监测F2代野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠的生长曲线以及体长情况,计算8周龄小鼠的脏器指数,并利用X射线和组织形态学染色观察其骨骼发育情况。检测结果表明,各基因型小鼠的生长发育和全身骨骼未发现显着性差异,股骨骨骺和生长板发育也没有异常或畸形的表现,推测该同义突变对IGF-1含量的下调程度不大,可能受到其它代偿效应的弥补,因而不足以引起机体的生长发育和体型性状较大的波动。基于该同义突变所在密码子编码的氨基酸为丙氨酸（Ala）,本研究为探索t RNA种类和丰度以及序列上下文是否影响同义密码子的功能,将四种同义密码子替换IGF-1成熟肽序列中的所有Ala,另外互换GCG和GCA两种同义密码子的位置,并以普遍的大型猪种中IGF-1成熟肽序列为野生型作为对照。最终成功构建6组携带不同Ala同义密码子的IGF-1重组表达载体,并在重组IGF-1的C末端加入FLAG标签。分别将不同表达载体转染至PK-15细胞中,RT-q PCR和Western Blot检测细胞内FLAG的表达量。结果显示,四种同义密码子编码的IGF-1表达水平与t RNA丰度和密码子偏爱性趋势相一致,但均低于IGF-1-WT组的表达量（P<0.05）。为进一步探究不同Ala同义密码子影响IGF-1蛋白质合成的分子机制,本研究检测了mRNA二级结构和稳定性。结果表明,不同同义密码子组合编码的IGF-1具有不同的mRNA二级结构,并影响IGF-1转录和翻译水平的稳定性。除IGF-1-GCT组呈现出的IGF-1 mRNA衰减趋势与IGF-1-WT组基本一致外,其他组的mRNA稳定性都在一定程度上高于IGF-1-WT组。此外,在蛋白质水平上,根据蛋白质翻译起始速率和蛋白质半衰期的检测结果表明,携带不同Ala同义密码子的IGF-1蛋白质合成起始速率也各不相同。IGF-1-WT组的IGF-1蛋白质半衰期最短,而IGF-1-GCG组和IGF-1-GCC组的稳定性显着高于IGF-1-WT组（P<0.05）。进一步,为验证IGF-1基因编码区上的Ala同义突变替换是否干扰基因的生物功能,CCK-8实验结果显示各表达载体编码的IGF-1能够影响PK-15细胞的增殖情况。综上,本研究在动物水平上评估了潜在参与体型形成的关键基因IGF-1上同义突变c.258A>G对个体表型和基因表达及分泌的影响程度,进一步探索了同义密码子影响基因表达和生物学功能的分子机制。我们认为虽然不同同义密码子的使用具有偏好性,但最优的组合能够使得基因在表达、稳定性和生物学功能上维持相对优势的平衡。
胡志刚[4]（2021）在《北京鸭、汉中麻鸭与黑番鸭肌肉转录组分析及FKBP5功能研究》文中进行了进一步梳理骨骼肌是动物最重要的组织之一,约占体重的50%。骨骼肌参与机体运动、保护和代谢调节。畜禽的生长性能,尤其是骨骼肌的生长,是决定养殖户经济效益高低的因素之一,因此对畜禽骨骼肌发育的研究在畜牧业生产中具有重要意义。近年来,关于畜禽胚胎期肌肉发育的研究表明,肌纤维的形成机制涉及到祖细胞的激活、祖细胞增殖为单核成肌细胞并最终融合形成多核肌管等步骤。此外,许多基因和转录因子也参与了肌肉增殖和分化的调控。然而,鸭骨骼肌生长发育调控的内在机制仍不清楚。在我国,鸭肉的产量仅次于鸡肉,人们对鸭肉的需求也在不断增加。鸭骨骼肌生长在种、属间存在较大差异,如河鸭属的北京鸭生长速度快、体重大,兼用型的汉中麻鸭则具有生长速度慢、体重低等特点,而栖鸭属的黑番鸭体型大、生长速度较快。为解析不同品种及属间鸭骨骼肌发育的调控差异,提高鸭肌肉产量,本研究以北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌（胸肌和腿肌）为研究对象,比较并分析了胚胎期17 d、19 d、21 d、24 d和27 d（黑番鸭还包括胚胎期31 d和34d）以及6月龄鸭胸肌和腿肌的发育特征;通过检测影响鸭骨骼肌生长发育的部分基因（MyoG、MyoD、Myf5、MRF4、Pax3、Pax7和MSTN）的表达水平,确定不同生长阶段北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌表现出的品种间、属间及组织间的差异。通过RNA-Seq测序技术筛选北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌生长发育过程中的差异表达基因和相关调控通路,对本研究筛选得到的差异表达基因FKBP5的组织表达谱、CDS区序列及其核心启动子区进行了分析,并在细胞水平上研究了FKBP5基因对鸭成肌细胞增殖分化的影响。此外,本论文还研究了FKBP5基因SNPs与番鸭体重的关联分析。本研究的结果如下:1鸭不同生长阶段肌肉发育相关基因表达规律及骨骼肌肌纤维大小的研究荧光定量结果表明不同生长阶段鸭骨骼肌生长相关基因的表达存在品种间和属间差异,胚胎期北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌中的MRFs（MyoG、MyoD、Myf5和MRF4）、Pax3、Pax7和MSTN均高表达,且这些基因在鸭胚胎期的表达高于成年鸭。肌纤维大小在鸭不同品种和属间存在差异,且胸肌/腿肌肌纤维直径、胸肌/腿肌肌纤维横截面积随着生长发育而逐渐增加,而单位面积内胸肌/腿肌肌纤维数量都随发育时间而逐渐缩小,表明鸭骨骼肌在胚胎期发育迅速。2鸭不同生长阶段胸肌和腿肌的转录组分析对北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭胸肌、腿肌的RNA-Seq测序结果表明,鸭骨骼肌单核苷酸多态性（SNP）的注释主要分布在内含子（INTRON）、同义编码（SYNONYMOUS＿CODING）和3’UTR起始（UTR＿3＿PRIME）中;插入缺失（In Del）的注释主要分布在内含子（INTRON）、3’UTR起始（UTR＿3＿PRIME）和下游（DOWNSTREAM）中;可变剪切（AS events）主要是第一个外显子可变剪切（TSS）和最后一个外显子可变剪切（TTS）。以Fold change≥2和FDR<0.01作为筛选差异表达基因的标准,发现差异表达基因FKBP5、MYL4、SHISA2、CREBL2、RHEB、IGF2BP1、CSRP3、GDF6、SPP1和KLHL31,以及LAMB2、LAMA2、ITGB1、OPN、FAF1、RGS8、GRB10、SMYD3和TNNI2等主要富集于鸭骨骼肌生长发育的调控通路,包括氧化磷酸化、ECM-受体相互作用、局部粘附、碳代谢、氨基酸的生物合成、MAPK信号通路和肌动蛋白细胞骨架的调节等,说明上述基因可能对鸭骨骼肌生长发育具有重要的调控作用。此外,FKBP5在北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌中均有显着表达,表明FKBP5在鸭骨骼肌发育过程中起着重要的调控作用,后面的章节对其结构和功能进行了分析。3鸭FKBP5基因CDS区生物信息学分析及其在不同阶段各组织中的表达规律研究对北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌差异表达基因FKBP5 CDS区及其氨基酸序列理化性质进行了预测、比较和分析,鸭FKBP5基因存在1485 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸。鸭FKBP5属于不稳定、亲水性蛋白,没有氨基酸信号肽和跨膜结构域。氨基酸同源性分析结果表明,鸭FKBP5氨基酸序列与鹅和番鸭的同源性最高,分别为98.69%和98.18%;与鸡（96.20%）、鸵鸟（94.97%）、鹌鹑（92.66%）等鸟类的同源性也较高,但与猪（83.81%）、牛（84.03%）、人（82.71%）和家鼠（79.43%）的同源性较低,说明FKBP5氨基酸序列在生物的进化过程中具有较高保守性。这些结果为研究鸭FKBP5基因的结构与功能提供重要的参考。此外,FKBP5基因在北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭胚胎期各组织（心、肝、肺、肾、胸肌和腿肌）发育过程中均有较高水平的表达,且FKBP5基因在成年母鸭组织中（除肝外）的表达高于公鸭。4 FKBP5基因对鸭成肌细胞增殖分化的影响根据鸭FKBP5基因序列设计引物,合成基因CDS区序列并成功构建了FKBP5过表达载体（pc DNA-FKBP5）,转染后能显着提高鸭成肌细胞中FKBP5的表达（P<0.05）。CCK-8、Ed U、qPCR及Western blot检测结果显示,FKBP5基因能促进鸭成肌细胞的增殖和分化,这为FKBP5基因在鸭肌肉发育过程中的功能提供理论依据。5鸭FKBP5基因启动子区的分析及与番鸭体重的关联分析构建了鸭FKBP5基因启动子截短片段载体,双荧光素酶检测结果显示鸭FKBP5基因启动子区的核心活性区域为-888 bp/-688 bp,该活性区域包含Myf、CCAAT、TATA和SP1等转录因子结合位点。FKBP5基因与番鸭体重的关联分析结果显示,3个SNP位点（g.4819252 A>G、g.4821390 G>A、g.4830622 T>G）与番鸭的体重显着相关（P<0.05）,这些位点可以作为未来鸭育种计划中潜在的分子标记,以提高鸭骨骼肌的生长发育水平。综上所述,本研究从分子水平和细胞水平探讨了不同生长阶段北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌生长发育过程中的差异,为鸭骨骼肌生长发育表现出的品种间及属间差异提供有价值的信息,也为差异表达基因FKBP5调控鸭骨骼肌生长发育奠定理论基础。
宋宁[5]（2021）在《奶山羊αS1-酪蛋白基因功能及其调控乳蛋白合成的机理研究》文中研究指明牛奶和羊奶等乳制品富含蛋白质,为人体补充多种必需氨基酸和生物活性肽。乳蛋白分为酪蛋白和乳清蛋白两大类,其中酪蛋白细分为αS1-酪蛋白（CSN1S1）、αS2-酪蛋白（CSN1S2）、β-酪蛋白（CSN2）和κ-酪蛋白（CSN3）四种。乳蛋白营养价值高,但其引起的人体过敏问题不容忽视。相较于其他乳蛋白成分,αS1-酪蛋白容易引起人体过敏。羊奶中的αS1-酪蛋白含量远低于牛奶,是羊奶不易过敏的主要因素之一。αS1-酪蛋白的含量与乳蛋白致敏性密切相关,然而目前CSN1S1基因的功能及表达调控机制尚不明确。通过研究奶山羊乳腺上皮细胞CSN1S1基因对乳蛋白合成的调控作用,以及CSN1S1基因的转录和转录后表达调控机制,为降低乳中αS1-酪蛋白含量,改善乳蛋白在人体的消化吸收,提高反刍动物乳品质提供理论依据。本研究克隆奶山羊CSN1S1基因编码区序列,并对其进行了生物信息学分析;利用RNA干扰和腺病毒过表达技术探讨了CSN1S1基因对乳蛋白合成的调控机制;通过对奶山羊CSN1S1基因5’侧翼启动子区的克隆和转录活性研究,探讨了STAT5对CSN1S1基因的转录调控作用;通过克隆奶山羊CSN1S1基因3’非编码区（3’UTR）和转录后调控研究,探讨了miR-204家族成员对CSN1S1基因表达的调控机制。获得如下结果:1.奶山羊αS1-酪蛋白基因的克隆与生物信息学分析克隆得到奶山羊CSN1S1基因的完整编码区642bp,并对山羊、绵羊、牛等10种哺乳动物的CSN1S1基因氨基酸序列进行生物信息学分析,发现山羊和绵羊、牛的CSN1S1基因亲缘关系最接近,与小鼠、大鼠的亲缘关系较远,山羊和绵羊、牛的CSN1S1基因功能性模体和结构域相似,可能具有相似的功能。蛋白互作分析显示αS1-酪蛋白与αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白（LALBA）、β-乳球蛋白（BLG）等多种乳蛋白成分之间可能存在相互作用。通过测定αS1-酪蛋白和β-酪蛋白在不同泌乳期山羊乳腺组织中的表达及羊奶中的含量,发现泌乳盛期和中期乳腺CSN1S1和CSN2基因的表达趋势相反,羊奶中αS1-酪蛋白和β-酪蛋白含量呈现负相关关系。2.αS1-酪蛋白基因对乳蛋白合成的调控作用研究构建奶山羊CSN1S1基因腺病毒重组载体,在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中过表达CSN1S1基因显着下调CSN2基因的表达和β-酪蛋白的合成;使用si RNA干扰CSN1S1基因显着上调CSN2基因和β-酪蛋白的表达。CSN1S1基因的过表达和干扰不影响CSN1S2、CSN3、LALBA和BLG等乳蛋白基因的表达。检测与乳蛋白合成密切相关的JAK2/STAT5和m TOR通路的活性,发现CSN1S1基因显着抑制JAK2和STAT5a的活性,不影响m TOR的活性。通过挽救试验证实,CSN1S1基因通过下调STAT5a的磷酸化水平抑制CSN2基因的转录活性和β-酪蛋白的表达。说明,在GMEC中,抑制CSN1S1基因不仅降低αs1-酪蛋白的含量,同时上调β-酪蛋白的表达。3.αS1-酪蛋白基因启动子的转录活性研究克隆奶山羊CSN1S1基因的5’启动子区2201bp,包含1个TATA-box,位于转录起始位点上游-33～-26bp。通过JASPAR等网站预测了对CSN1S1启动子活性起重要作用的STAT5、C/EBPα、AP-1、GR和YY1等转录因子结合位点。逐段缺失试验表明CSN1S1启动子核心区域位于上游-110～-18bp,包含2个STAT5结合位点（GAS位点）。过表达STAT5a基因显着上调CSN1S1基因的启动子活性及m RNA水平;使用STAT5-IN-1抑制STAT5活性后,细胞核中的STAT5磷酸化水平显着下降,CSN1S1基因的启动子活性、m RNA及蛋白水平显着下调。通过对CSN1S1启动子区的3个保守GAS位点进行定点突变试验,发现核心区域的GAS1和GAS2均是STAT5的结合位点,染色质免疫沉淀（Ch IP）试验证实了STAT5与这两个位点的直接结合作用。因此,在GMEC中,STAT5通过GAS1和GAS2位点直接调控CSN1S1基因的转录,突变这两个位点抑制CSN1S1基因的转录和αS1-酪蛋白的合成。4.αS1-酪蛋白基因3’非编码区的转录后调控研究克隆奶山羊CSN1S1基因的3’UTR序列429bp,通过Target Scan等软件预测miR-204家族成员miR-204-5p和miR-211共同靶向CSN1S1基因3’UTR区275～281nt位点。在不同泌乳期山羊乳腺组织中,miR-204-5p和miR-211在泌乳盛期的表达均显着低于泌乳中期,与CSN1S1基因的表达趋势相反。位点突变试验证实miR-204-5p和miR-211通过靶向CSN1S1基因3’UTR特异序列协同抑制CSN1S1基因和αS1-酪蛋白的表达。此外,miR-204-5p和miR-211上调CSN2基因的表达和β-酪蛋白的合成,同时上调STAT5a的活性。挽救试验证实miR-204-5p和miR-211通过CSN1S1-STAT5a信号轴上调β-酪蛋白的表达,Ch IP试验说明其通过促进STAT5a的活性来上调CSN2基因的转录活性。表明,在GMEC中,miR-204-5p和miR-211靶向CSN1S1基因协同下调αS1-酪蛋白的合成、上调β-酪蛋白的合成。综上所述,在山羊乳腺上皮细胞中,CSN1S1基因负向调控β-酪蛋白的合成;通过转录和转录后途径均能下调CSN1S1基因的表达和αS1-酪蛋白的合成。本研究阐述了奶山羊CSN1S1基因的功能及其表达调控机制,为降低乳中αS1-酪蛋白的含量进而减轻反刍动物乳蛋白致敏性提供理论依据。
陈阳[6]（2020）在《卵形鲳鲹IGFBP3（TroIGFBP3）参与机体抗菌免疫应答研究》文中认为胰岛素样生长因子结合蛋白3（Insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP3）是IGFBP家族的重要成员之一。目前,在哺乳动物中有关IGFBP3的研究主要集中在调节细胞增殖、分化、生长、凋亡和先天免疫等方面,但在硬骨鱼类中有关IGFBP3的研究相对匮乏。为此,本文以卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）为研究对象,克隆并鉴定了卵形鲳鲹IGFBP3（Tro IGFBP3）基因,分析了其序列结构特征,并且对其在体内外的功能进行了初步研究。主要内容及结果如下:1.本研究从卵形鲳鲹肝脏中克隆得到了Tro IGFBP3,序列编码区长861 bp,共编码286个氨基酸,其中包含21个氨基酸的信号肽,其相对分子质量29 k Da,理论等电点为8.802。序列同源性分析表明,Tro IGFBP3与其他硬骨鱼IGFBP3有很高的同源性（58.1%～93.71%）。其中,与眼斑双锯鱼（Amphiprion ocellaris）同源性最高,达93.71%。系统进化树结果显示,Tro IGFBP3与同为鲈形目的眼斑双锯鱼聚为一个分支,亲缘关系最近。2.组织特异性分析的结果显示,Tro IGFBP3在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达,而在肝脏、脾脏和头肾等免疫器官中表达量较高,其中在肝脏的表达量最高,在皮肤中最低。在哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染24 h后,Tro IGFBP3在肝脏、脾脏和头肾中的表达量均显着上调,其中在肝脏中的表达量显着上调20.21倍、脾脏显着上调13.87倍、头肾显着上调13.91倍。3.本研究成功构建并诱导表达了Tro IGFBP3的融合蛋白r Tro IGFBP3。体外实验证明,r Tro IGFBP3与头肾巨噬细胞、外周血白细胞孵育后,可显着提高巨噬细胞的吞噬活性,并且促进外周血白细胞的增殖。此外,我们还发现,r Tro IGFBP3可以显着抑制小鼠肝癌细胞的增殖,并且促进小鼠肝癌细胞的凋亡。4.亚细胞定位的结果显示IGFBP3在卵形鲳鲹吻细胞的细胞核和细胞质中均有表达;体内实验的结果表明,在鱼体中过量表达IGFBP3后,可显着提高机体抗菌能力,肝脏、脾脏、头肾在V.harveyi侵染后,细菌数量相比对照组显着降低。与此一致的是,当干扰鱼体内Tro IGFBP3的表达后,机体的抗菌能力显着降低,V.harveyi侵染后,各组织中的细菌数量显着增多。综上所述,我们的实验结果表明卵形鲳鲹Tro IGFBP3能提高机体的抗菌免疫应答,并且能够促进小鼠肝癌细胞的凋亡。该研究将丰富我们对卵形鲳鲹抗细菌免疫机制的认知,为卵形鲳鲹人工养殖的健康持续发展提供新的研究思路。此外其抗肿瘤作用也将会给生物学、医学等领域提供新的研究视角。
朱晓锋[7]（2020）在《从江香猪GHR、IGF-1基因对成肌细胞增殖的影响研究》文中指出生长激素受体（GHR）是一个单次跨膜蛋白,属于Ⅰ型细胞因子超家族,通过与生长激素（GH）结合而发挥其生物学功能;类胰岛素生长因子1（IGF-1）能显着改变正常人机体成分的分布,如脂肪减少、肌肉比重增高、体重增加等,主要以分泌方式作用于肌肉、骨骼等靶器官上的受体,进而调节动物生长发育。本试验以从江香猪为研究对象,运用分子克隆技术、序列比对分析、组织特异性表达检测、原代细胞培养、基因过表达和mRNA干扰等方法,从分子和细胞水平进一步阐述了GHR和IGF-1基因对从江香猪成肌细胞增殖的影响。主要研究结果如下:（1）本试验利用同源重组的方法成功克隆了从江香猪IGF-1、GHR基因编码区序列,生物信息学分析得知,IGF-1基因全长片段为393 bp,共编码131个氨基酸,蛋白结构分析发现,从江香猪IGF-1为亲水性碱性蛋白质,属于分泌型蛋白,与NCBI中野猪的登录序列比对后得知,从江香猪存在一个G213A突变位点,为同义突变。GHR基因全长为1 917 bp,共编码639个氨基酸,存在一个A1446G同义突变位点,其蛋白为含有一个跨膜结构的亲水性酸性蛋白质,属于不稳定蛋白;IGF-1、GHR基因的核酸序列同源性均与野猪最高,所编码的蛋白定位不同,推测两者发挥生物学功能的场所不同。（2）采用qRT-PCR的方法检测从江香猪和大白猪不同组织间IGF-1和GHR基因mRNA的表达量差异,发现IGF-1 mRNA的表达量在从江香猪小肠、大肠、肺脏和背最长肌中的表达量最高,在不同组织比较中除背最长肌差异不显着外其他组织均显着低于大白猪（P<0.05）;GHR基因mRNA在从江香猪不同组织中的表达量分别为:脾脏>肝脏>肺脏>心脏>脂肪>肾脏>背最长肌>大肠>小肠,其中背最长肌、肾脏、大肠、小肠组织的表达量极显着低于大白猪（P<0.01）。（3）试验运用Ⅱ型胶原酶配合中性蛋白酶消化法、细胞差数贴壁的原理提取从江香猪原代成肌细胞,构建针对GHR基因的过表达载体p EGFP-C1-GHR和sh RNA干扰载体p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-GHR以及一条阴性对照p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-NC;针对IGF-1基因设计并构建过表达载体p EGFP-C1-IGF-1和sh RNA干扰载体p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-IGF-1和一对阴性对照p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-NC,经验证其正确性后,分别转染成从江香猪成肌细胞,在细胞水平验证其表达及细胞增殖的影响。结果显示,过表达GHR基因后,能显着提高IGF-1基因的表达,同时导致TAZ、YAP基因mRNA表达量显着降低且能促进成肌细胞的增殖;当干扰GHR基因的表达后,IGF-1、TAZ、YAP基因的表达量均极显着降低。过表达IGF-1基因后,IGF-1、TAZ、YAP基因mRNA的表达量均受到了抑制,干扰IGF-1基因表达后,对GHR和TAZ基因的抑制作用解除、但抑制了YAP基因的表达,分别对成肌细胞的增殖起到了促进和抑制的作用。本研究阐述了GHR和IGF-1基因对从江香猪成肌细胞增殖的促进作用。
甘宁[8]（2020）在《草鱼生长抑素受体的鉴定及其拮抗剂促生长作用的初探》文中指出生长抑素（Somatostatin,SS）,又被称为生长激素释放抑制因子（Somatotropin release-inhibiting factor,SRIF）,是一类在脊椎动物生长发育过程中发挥重要调控作用的激素。它可通过其特异性的G蛋白偶联受体—生长抑素受体（Somatostatin Receptor,SSTs）调节生长激素（Growth Hormone,GH）、胃泌素、胰岛素和胰高血糖素等激素的表达和分泌,进而调控动物机体的代谢和生长发育。特别地,在鱼类垂体中,SS可强烈抑制GH的合成和分泌,进而影响鱼类的生长。在硬骨鱼类中,由于全基因组复制使得SSTs具有多个亚型,并且这些亚型的表达具有组织特异性,这暗示SS在不同组织中的功能存在差异。因此,本研究以草鱼为模型,分离鉴定其SSTs,探究其组织分布特点,特别是检测它们在草鱼垂体中的表达情况,并针对性地筛选可能抑制垂体GH表达和分泌的SSTs拮抗剂,初步探究SSTs拮抗剂对草鱼生长发育的调节作用。本论文首先以草鱼不同组织混合cDNA为模板,克隆得到了7条草鱼SSTs的全长编码序列,分别命名为SST1a、SST1b;SST2a、SST2b1、SST2b2;SST3和SST5。这7个受体编码序列均无内含子,全长为1017 bp1452 bp,编码338483个氨基酸。从结构上来看,草鱼的7个SSTs均具有G蛋白偶联受体家族的特征—7次跨膜结构域和SSTs超家族特征序列YANSCANPI/VLY。多重序列比对结果表明,草鱼的7条SSTs氨基酸序列一致性为44.83%。同时,系统发育树结果显示,草鱼SSTs与斑马鱼的亲缘关系较近,与人和小鼠的亲缘关系较远。通过RT-PCR进行组织分布分析,发现草鱼SSTs各亚型mRNA在垂体、肝脏、脑等组织中均有所表达,但它们的表达分布特征不尽相同。其中,草鱼SST2a、SST3、SST5的mRNA在垂体中高表达,而SST2b1 mRNA的表达几乎只在肝脏组织中检测到。同时,我们还委托生物公司制备了这三种受体亚型的多克隆抗体,通过WB实验证明了抗体能够特异性识别垂体组织中高表达的草鱼SST2a、SST3和SST5蛋白。鉴于SS在垂体中抑制GH的表达和分泌的重要作用,我们选择垂体中高表达的SST2a、SST3、SST5作为进一步研究的对象。我们通过生物信息学的方法预测了草鱼SST2a、SST3、SST5的蛋白质三维结构,并借助分子对接软件模拟了配受体间的结合,将商品化的SSTs拮抗剂作为配体进行筛选,获知了可能分别与SST2a、SST3和SST5结合的特异性拮抗剂。同时,通过HE染色实验证明了幼龄草鱼垂体已具备成熟草鱼垂体的显微组织结构特征。于是,选择可特异性结合草鱼SST2a的拮抗剂MK-4256,以腹腔注射的方式在幼龄草鱼中进行了初步实验。结果发现注射该拮抗剂的实验组草鱼（100ng和300ng/10g体重）,相比于对照组体重增长率显着升高,但肥满度无显着变化。同时,还检测了实验组和对照组草鱼肝脏中胰岛素样生长因子IGF-1的mRNA水平,结果显示二者并无显着差异。而对肝体比和血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量的检测结果显示,注射MK-4256并未对草鱼肝脏造成累积损伤。本论文首次分离并鉴定了草鱼7个SST异构体,探究了它们的组织分布特征,并检测了腹腔注射SSTs拮抗剂对幼龄草鱼生长的影响,为初步探究SSTs在调控草鱼生长发育过程中的作用打下了基础。
程云云[9]（2018）在《小型猪GH、IGF-1基因多态性的筛选及功能解析》文中指出小型猪因体型矮小、近交系数高、易于操作等特点成为生物医学领域中应用最为广泛的非啮齿类大型实验动物;又因其生理特点、解剖学特征及疾病发生过程与人类相近而被作为人类疾病研究模型成为研究热点;近年来,小型猪是最适合的异种器官移植的潜在供体这一观点已成为国际移植领域的共识。因此,小型猪的研究和开发利用受到生物医药界的普遍关注,阐明小型猪矮小体型的形成机制将为对其更好地利用提供理论支持。动物的生长发育调控受到很多因素的影响,如遗传因素、环境因素、营养、激素等等,其中GH-IGF-1生长轴在影响机体生长中发挥至关重要的作用,而大型猪与小型猪在这些因素的长期影响下积累了大量的可遗传变异,那么阐明GH、IGF-1基因上的变异的作用机制具有重要意义。本研究利用我国丰富的小型猪和大型猪资源,首先在观察到不同体型猪IGF-1表达差异的基础上,筛查IGF-1基因外显子及其上游调控基因GH基因编码区存在的SNPs,分析这些SNPs可能的功能,筛选出具有研究意义的SNPs。结果显示同一生长阶段（出生后1周龄）大白猪（大型猪）IGF-1基因m RNA和蛋白质表达水平均显着高于巴马香猪（小型猪）（P<0.05）;在不同体型猪GH基因编码区中共检测到17个SNPs,其中6个与猪体型存在显着相关性（P<0.001）,分别是位于内含子1的g.237bp A>G,外显子2的g.283bp T>C、g.309bp A>G、g.318bp A>G及内含子2的g.540bp A>G和g.544bp A>G,其中位于外显子2的3个为错义突变,分别编码GH基因信号肽区第9位（p.Val9Ala）、22位（p.Gln22Arg）和25位（p.Asp25Gly）氨基酸,此外,基于猪体型大小,此3处错义SNPs存在强连锁效应,CGG为大型猪的优势单倍型,而TAA为小型猪的优势单倍型,且单倍型频率在大、小型猪间差异极显着（P<0.001）;不同体型猪IGF-1基因外显子仅筛查到1个同义突变c.258A>G,其中G为大型猪的优势等位基因,A为小型猪的优势等位基因,且此SNP位于IGF-1与IGF-1R结合的C区编码区内,经生物信息学在线软件预测发现,该同义突变改变了IGF-1C区编码基因的m RNA的二级结构及最小自由能,此外,密码子使用频率统计分析发现大型猪在c.258A>G所在密码子的使用频率较高,反之小型猪的密码子在此处的使用频率较低。基于猪GH基因信号肽编码区存在的3个错义突变,本研究将组合形成的8组信号肽编码序列插入至p EGFP-N1表达载体,使其与EGFP基因融合表达,形成重组载体p EGFP-N1-sp1-8。将p EGFP-N1-sp1-8及p EGFP-N1转染至GH3细胞中,48 h后Western blotting检测细胞内及上清中EGFP的表达量,结果显示,信号肽第9位的Val与Ala相比能促进蛋白的合成,22位为Gln及25位为Gly的信号肽能促进EGFP的分泌。为阐明不同信号肽影响蛋白质合成的分子机制,本研究进一步对m RNA稳定性进行了检测,结果证实8组信号肽组的m RNA稳定性存在差别,同时在线软件预测8组信号肽编码基因的m RNA二级结构及最小自由能均存在差异,且与m RNA稳定性结果基本一致。以上结果表明,猪GH基因信号肽区的错义突变显着的影响了蛋白质的合成及分泌,初步认为是其改变了m RNA的二级结构进而引起m RNA的稳定性变化造成的。鉴于猪IGF-1基因外显子区仅检测到1个同义突变c.258A>G及其改变了IGF-1基因C区编码基因的m RNA的二级结构,本研究构建了G等位基因和A等位基因的IGF-1表达载体,并转染至MC-3T3细胞中,结果表明在转录水平和翻译水平,等位基因为G的IGF-1的表达量均显着高于等位基因为A的IGF-1（P<0.05）;然后本实验进一步通过Act D和CHX干扰来检测该同义突变对m RNA和蛋白质稳定性的影响,结果证实等位基因为G的IGF-1的稳定性均显着低于等位基因为A的IGF-1,该结果与IGF-1基因C区编码基因m RNA的二级结构及最小自由能相一致。由于该同义SNP位于IGF-1与IGF-1R结合的关键区域,本研究选取了基因型分别为GG和AA的猪胎儿成纤维细胞,通过免疫共沉淀及免疫荧光双标记技术明确该同义突变对IGF-1与IGF-1R的结合率的影响,结果表明,相比于总IGF-1R,与其结合的GG基因型的IGF-1显着高于AA基因型的IGF-1。为揭示该突变影响IGF-1与IGF-1R结合率的原因,本研究采用免疫学方法,通过构象敏感性IGF-1抗体来检测此同义突变对蛋白质构象的影响,结果显示两种基因型的IGF-1蛋白质构象存在差异,提示同义突变c.258A>G改变了IGF-1的构象进而影响了其与IGF-1R的结合。以上结果解析了参与小型猪体型形成的关键因素GH-IGF-1生长轴上的重要基因GH和IGF-1基因的关键SNPs的功能,为小型猪的开发利用提供理论数据。
梁银银[10]（2018）在《卵形鲳鲹生长相关基因的克隆及其对不同食物类型的表达响应》文中提出卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）是中国华南沿海最重要的海水养殖鱼类之一。“下丘脑一脑垂体一肝脏（HPL）轴”是脊椎动物生长的主要调控轴,主要通过调控多种生长相关激素的表达来促进机体细胞广泛的分裂增殖最终达到促进生长的作用。生长激素（growth hormone,GH）、生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）、胰岛素生长因子（insulin-like growth factor,IGF）是该生长轴上重要的激素,具有促进生长、提高食物转化率、促进合成代谢、调节渗透压和繁殖行为调控等生物学功能。kisspeptin在调控机体生长发育、能量代谢和生殖活动中发挥重要的作用。为了解卵形鲳鲹生长调控机制,本实验室克隆了卵形鲳鲹GH、GHRs、IGFs和Kiss四种生长相关基因,研究四种生长相关基因对不同食物类型的表达响应。依据从转录组获得的GH、GHRs、IGFs和Kiss基因片段,通过RACE技术获得以上基因的c DNA全长序列,接着进行基因生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR）分析基因的组织表达分布。同时基于卵形鲳鲹全基因组测序得到目的基因的基因序列,然后进行基因结构分析、启动子预测和微卫星位点预测等。基于30个野生卵形鲳鲹个体利用荧光探针技术分析微卫星位点的多态性;利用冰鱿鱼（Loligo chinensis）、冰杂鱼（即冰竹荚鱼Trachurus japonicus）和商业粒状饲料（含有36%粗蛋白）投喂卵形鲳鲹3个月,研究基因对不同饵料类型的表达响应。具体研究结果如下:（1）To GH（Genbank登陆号:MF795138）c DNA全长850 bp,编码201个氨基酸。To GH氨基酸序列有一个信号肽和两个典型的GH/SL/PRL家族保守的结构域。To GH的5’-侧翼区有多个转录因子结合位点,分别为:1个Pit-1a、3个TATA boxes、3个GRE、2个TRE、2个ERE和2个HNF-3。To GH有12个微卫星位点,经验证均无多态性。To GH基因（Genbank登陆号:MF795139）全长4.0 kb,由6个外显子5个内含子组成。To GHR1（Genbank登录号:No.MF677853）和To GHR2（Gen Bank登录号:MF677854）的开放阅读框（ORF）分别为1869 bp和1758 bp,分别编码622个和585个氨基酸。多重序列比对分析的结果表明,To GHRs与其他脊椎动物GHRs一样均具有1个高度保守的FGEFS结构域和两个保守的Boxes。To GHR1有12个微卫星位点,只有3个位点具有多态性;To GHR2有1个微卫星位点且无多态性。在To GHRs的5’侧翼序列有均有SP1、C/EBPalp、GATA-1等转录因子结合位点。To IGF1（Gen Bank登录号:MH300904）、To IGF2（Gen Bank登录号:MH300905）和To IGF3（Gen Bank登录号:MH300906）c DNA全长分别为1718bp、1658bp和2272bp,分别编码185个、215个和194个氨基酸。To IGFs氨基酸序列与其他物种一样都由5部分组成,即信号肽、B domain、C domain、A domain、D domain、E domain。To IGF1无微卫星多态性位点;To IGF2和To IGF3分别有3个和1个微卫星多态性位点。To Kiss1（Genbank登陆号:MG843840）c DNA全长505bp,可编码104个氨基酸。To Kiss1氨基酸序列有1个信号肽和1个典型的kisspeptin-10结构域。To Kiss1无微卫星多态性位点。（2）组织分布表达结果显示,To GH主要在卵形鲳鲹肠、脑和肌肉组织内的表达量较高;To GHR1在肝脏、肌肉和心脏组织中的表达量较高;To GHR2在肝脏和肌肉中表达最高;To IGF1在肝组织中表达量最高,其次为脾组织、肌肉组织和精巢;To IGF2在鳃组织中表达量最高,其次为肠、胃、脑、精巢、卵巢和肝脏;To IGF3在鳃、卵巢和精巢中表达量最高;To Kiss1的m RNA在脑中的表达量最高,其次是肠、胃、脾、肌和心。组织分布结果表明,To GH、To GHRs、To IGFs和To Kiss的组织分布不仅仅局限在与生长相关的组织如脑、肌肉和肝脏等,在生殖、渗透压调节、摄食调控相关组织也有分布,这种情况与其他硬骨鱼类的相似,这反应了To GH、To GHRs、To IGFs和To Kiss具有广泛的生物学功能,需要进一步的挖掘和利用。（3）在饵料投喂实验中,与颗粒饲料组和冰鱿鱼组相比,冰杂鱼组的肝组织内To GH m RNA的表达最高。在肠组织中,颗粒饲料组To GH m RNA表达量显着高于冰鱿鱼组（P<0.05）,但冰杂鱼组与其他各组均无显着差异。经三种饵料类型投喂后,To GHR1 m RNA在冰鱿鱼组肝脏中表达量最高（P<0.05）。但To GHR2m RNA在冰鱿鱼组肝脏中的表达量最低（P<0.05）。在肠道中,To GHR1在冰杂鱼组中表达量最高（P<0.05）,To GHR2在肠组织中的表达无差异显着性。经三种饵料投喂后,To IGFs在不同组织中其表达水平展现出不同的变化模式。在肝脏中,To IGF1的m RNA在冰杂鱼组和冰鱿鱼组中的表达量无明显差异,但是其在颗粒饲料组中的表达量显着高于冰杂鱼组和冰鱿鱼组。To IGF2的m RNA在颗粒饲料组中的表达量最高,其次为冰杂鱼组,在冰鱿鱼组中的表达量最低。在肠组织中,To IGF1、To IGF2和To IGF3在颗粒饲料组中均具有最高的表达量。另外,冰杂鱼组中To IGF1的表达量显着高于冰鱿鱼组中To IGF1的表达量;冰鱿鱼组中To IGF2的表达量显着高于冰杂鱼组中To IGF2的表达量;两组之间To IGF3的表达量无显着差异。经三种食物类型喂养后,在肠组织中To Kiss1基因m RNA在喂食颗粒饲料的组中表达量最高,其次为喂食冰杂鱼的组,在喂食冰鱿鱼的组中表达量最低;在肝组织中,三组之间均无显着差异。
二、IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对成骨细胞和骨骼肌细胞分化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 小型猪实验动物化研究现状及应用前景 |
| 1.1 我国小型猪资源优势 |
| 1.2 小型猪生物学特性优势 |
| 1.3 小型猪在生物学及医学领域的研究前景 |
| 1.3.1 小型猪在内分泌系统方面的应用 |
| 1.3.2 小型猪在心血管系统方面的应用 |
| 1.3.3 小型猪应用于皮肤系统方面的优势 |
| 1.3.4 小型猪在器官移植方面的应用 |
| 第2章 胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的研究进展 |
| 2.1 IGF-1R的生物学功能 |
| 2.2 猪Igf1r基因、蛋白质结构概述 |
| 2.3 IGF-1R在生长发育及骨发育调控的研究进展 |
| 2.3.1 生长发育及肌肉分化信号调控 |
| 2.3.2 骨发育通路调控 |
| 2.4 Igf1r基因多态性与人矮身材、动物矮小品种的研究进展 |
| 2.4.1 IGF-1R含量影响体型大小的研究进展 |
| 2.4.2 Igf1r基因多态性与体型大小相关性的研究进展 |
| 第3章 同义突变功能的研究进展 |
| 3.1 同义突变对mRNA结构和稳定性的影响 |
| 3.2 同义突变对蛋白质的影响 |
| 3.2.1 同义突变对翻译速率的影响 |
| 3.2.2 同义突变对蛋白质表达的影响 |
| 3.2.3 同义突变对蛋白质稳定性的影响 |
| 3.2.4 同义突变对蛋白质构象的影响 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对基因表达及其与IGF-1 结合的影响及其机制 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞系 |
| 1.1.3 菌株及载体 |
| 1.1.4 试剂盒与抗体 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 细胞培养基配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 组织RNA提取及cDNA合成 |
| 1.2.2 载体构建 |
| 1.2.3 去内毒素质粒大提 |
| 1.2.4 MC3T3-E1细胞敲除Igf1r基因的制备 |
| 1.2.5 MC3T3-KO细胞稳定表达Igf1r基因两种单倍型 |
| 1.2.6 Igf1r两种单倍型表达载体瞬时转染SCs和 C2C12 细胞 |
| 1.2.7 蛋白质提取及浓度测定 |
| 1.2.8 Western Blot检测蛋白表达量 |
| 1.2.9 免疫荧光 |
| 1.2.10 RNA提取和qRT-PCR |
| 1.2.11 Igf1r胞外结构域不同单倍型mRNA二级结构和最小自由能预测 |
| 1.2.12 稳定性分析 |
| 1.2.13 免疫共沉淀 |
| 1.2.14 流式细胞术 |
| 1.2.15 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 sgRNA载体构建及敲除细胞系鉴定 |
| 1.3.2 MC3T3-KO细胞中Igf1r的两种基因型稳定表达 |
| 1.3.3 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对基因表达水平的影响 |
| 1.3.4 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对基因稳定性的影响 |
| 1.3.5 Igf1r胞外编码区的两种单倍型改变其与IGF-1 的结合亲和力 |
| 1.3.6 Igf1r胞外域编码区的两种单倍型对IGF-1R膜表面分布的影响 |
| 1.3.7 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对蛋白质构象的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对成骨细胞增殖和分化的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及表达载体 |
| 2.1.2 主要试剂盒及抗体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞增殖检测 |
| 2.2.2 碱性磷酸酶活性测定 |
| 2.2.3 qRT-PCR |
| 2.2.4 免疫印迹实验 |
| 2.2.5 茜素红染色测定 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对成骨细胞ALP活性的影响 |
| 2.3.3 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对成骨分化基因表达的影响 |
| 2.3.4 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对成骨矿化的影响 |
| 2.3.5 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对成骨分化信号输出的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对骨骼肌细胞增殖与分化的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 Igf1r两种单倍型的表达载体 |
| 3.1.3 主要试剂盒与抗体 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 两种单倍型载体的去内毒素质粒提取 |
| 3.2.2 不同单倍型表达载体瞬时转染猪骨骼肌卫星细胞 |
| 3.2.3 细胞增殖能力检测实验 |
| 3.2.4 骨骼肌细胞增殖 |
| 3.2.5 猪骨骼肌卫星细胞分化 |
| 3.2.6 细胞总蛋白质提取和免疫印迹实验 |
| 3.2.7 数据统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Igf1r胞外编码区两种单倍型对SCs和C2C12细胞增殖能力的影响 |
| 3.3.2 Igf1r胞外编码区两种单倍型对SCs和C2C12细胞增殖过程中相关基因表达的影响 |
| 3.3.3 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对SCs增殖过程中相关信号通路表达的影响 |
| 3.3.4 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对SCs和C2C12细胞分化过程中相关基因表达的影响 |
| 3.3.5 Igf1r胞外编码区的两种单倍型对SCs和C2C12细胞分化过程中相关信号通路表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育调控及体型性状的研究现状 |
| 1.1 小型猪在生物医学领域的研究进展及应用前景 |
| 1.1.1 我国小型猪作为实验动物的优势与挑战 |
| 1.1.2 小型猪在生物医学领域的研究进展和应用前景 |
| 1.2 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育调控机制的研究进展 |
| 1.2.1 GH-IGF-1生长轴的组成和生物学功能 |
| 1.2.2 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育的调控作用 |
| 1.2.3 GH-IGF-1生长轴对动物衰老的调控作用 |
| 1.3 IGF-1基因及其多态性对动物体型性状影响潜在机制 |
| 1.3.1 IGF-1基因及其多态性影响动物体型性状的研究进展 |
| 1.3.2 IGF-1基因多态性对基因表达影响的研究进展 |
| 第2章 真核生物基因同义突变的研究进展 |
| 2.1 同义突变的生物学特性 |
| 2.1.1 同义密码子的使用偏爱性 |
| 2.1.2 同义突变的进化保守性 |
| 2.1.3 同义突变发生的位置 |
| 2.2 真核生物同义突变的生物学效应及调控机制 |
| 2.2.1 真核生物同义突变在DNA水平的调控机制 |
| 2.2.2 真核生物同义突变在mRNA水平的调控机制 |
| 2.2.3 真核生物同义突变对蛋白质生物合成的调控机制 |
| 2.3 真核生物同义突变的研究前景 |
| 第3章 单碱基编辑技术研究进展 |
| 3.1 基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑器的原理 |
| 3.2 ABEs的发展史 |
| 3.3 ABEs的广泛应用 |
| 3.4 单碱基编辑技术的挑战与前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| G同义突变小鼠模型的构建'>第1章 IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 试剂配制方法 |
| 1.1.5 相关生物学软件 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 不同物种间IGF-1基因序列比对 |
| 1.2.2 IGF-1基因同义突变位点处密码子使用频率差异分析 |
| G位点的sgRNA设计'>1.2.3 基于小鼠IGF-1 c.258A>G位点的sgRNA设计 |
| 1.2.4 pUC57-Mus-IGF-1-sgRNA载体构建 |
| G同义突变pUC57-sgRNA载体的体外转录及纯化'>1.2.5 IGF-1 c.258A>G同义突变pUC57-sgRNA载体的体外转录及纯化 |
| 1.2.6 pCMV-ABEmax-Cas9质粒体外转录及纯化 |
| 1.2.7 小鼠受精卵胚胎注射 |
| 1.2.8 胚胎基因型分析 |
| 1.2.9 小鼠个体基因型分析 |
| 1.2.10 脱靶分析 |
| 1.2.11 小鼠的交配与繁殖 |
| 1.3 实验结果 |
| G同义突变发生的频率分布'>1.3.1 大型猪与小型猪IGF-1 c.258A>G同义突变发生的频率分布 |
| 1.3.2 不同物种间IGF-1 基因同源性比对及同义突变所在位点等位基因规律 |
| G同义突变所编码的丙氨酸密码子使用频率'>1.3.3 IGF-1 c.258A>G同义突变所编码的丙氨酸密码子使用频率 |
| G同义突变位点处设计sgRNAs'>1.3.4 在小鼠IGF-1c.258A>G同义突变位点处设计sgRNAs |
| 1.3.5 pUC57-sgRNA连接载体鉴定结果 |
| G同义突变单碱基编辑小鼠模型'>1.3.6 成功构建IGF-1 c.258A>G同义突变单碱基编辑小鼠模型 |
| G碱基编辑小鼠的脱靶鉴定'>1.3.7 IGF-1 c.258A>G碱基编辑小鼠的脱靶鉴定 |
| G碱基编辑小鼠的繁殖情况'>1.3.8 F2代IGF-1 c.258A>G碱基编辑小鼠的繁殖情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| G同义突变小鼠模型表型分析'>第2章 IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型表型分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制方法 |
| 2.1.5 相关生物学软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠体重、尾长及脏器指数测定 |
| 2.2.2 小鼠骨骼影像学分析 |
| 2.2.3 股骨组织形态学分析 |
| 2.2.4 组织RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.5 RT-qPCR检测不同基因型小鼠IGF-1基因mRNA水平的表达量 |
| 2.2.6 组织蛋白质的提取及蛋白质样品制备 |
| 2.2.7 Western Blot检测不同基因型小鼠组织中IGF-1蛋白质的表达量 |
| 2.2.8 不同基因型小鼠的血清学分析 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 F2代不同基因型小鼠体重生长曲线 |
| 2.3.2 F2代不同基因型小鼠尾长及脏器指数 |
| 2.3.3 F2代不同基因型小鼠骨骼发育情况 |
| 2.3.4 F2代不同基因型小鼠IGF-1分泌量的血清学分析 |
| 2.3.5 F2代不同基因型小鼠对IGF-1 mRNA水平表达量的影响 |
| 2.3.6 F2代不同基因型小鼠中不同类型E肽表达比例的检测及潜在机制预测 |
| 2.3.7 F2代不同基因型小鼠对IGF-1蛋白质水平表达量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| G同义突变影响基因表达的机制探索'>第3章 IGF-1 c.258A>G同义突变影响基因表达的机制探索 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞及表达载体 |
| 3.1.2 主要试剂盒及抗体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 携带不同Ala同义密码子的IGF-1表达载体构建 |
| 3.2.2 细胞培养及质粒转染 |
| 3.2.3 FLAG标签mRNA及蛋白质水平表达量检测 |
| 3.2.4 不同Ala同义密码子编码的IGF-1序列mRNA二级结构预测 |
| 3.2.5 不同Ala同义密码子编码的IGF-1 mRNA稳定性及蛋白质稳定性检测 |
| 3.2.6 不同Ala同义密码子编码的IGF-1的翻译起始效率检测 |
| 3.2.7 携带不同Ala同义密码子IGF-1的细胞增殖情况检测 |
| 3.2.8 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建携带不同Ala同义密码子的IGF-1 表达载体 |
| 3.3.2 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA及蛋白质表达 |
| 3.3.3 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA及蛋白质稳定性 |
| 3.3.4 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA二级结构 |
| 3.3.5 不同Ala同义密码子影响IGF-1蛋白质翻译起始效率 |
| 3.3.6 不同Ala同义密码子影响IGF-1生物学功能 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）北京鸭、汉中麻鸭与黑番鸭肌肉转录组分析及FKBP5功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 肌肉发育及FKBP5 基因的研究进展 |
| 1.1 鸭的基本简介 |
| 1.2 家禽肌肉转录组的研究进展 |
| 1.3 动物骨骼肌生长发育相关基因的研究进展 |
| 1.3.1 部分与骨骼肌生长发育相关的基因 |
| 1.3.2 骨骼肌生长发育的调控机制及相关信号通路 |
| 1.3.3 动物生长发育过程中骨骼肌的变化规律 |
| 1.4 FKBP家族的研究进展 |
| 1.4.1 FKBPs简介 |
| 1.4.2 FKBP5 功能的研究进展 |
| 1.5 目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 鸭不同生长阶段肌肉发育相关基因表达规律及骨骼肌肌纤维大小的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 动物与样品采集 |
| 2.1.2 RNA提取、cDNA合成及qPCR |
| 2.1.3 胚胎期北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭胸肌和腿肌肌纤维大小研究 |
| 2.1.4 数据统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 北京鸭肌肉生长相关基因的表达 |
| 2.2.2 汉中麻鸭肌肉生长相关基因的表达 |
| 2.2.3 肌肉生长相关基因在北京鸭与汉中麻鸭胸肌中的表达差异 |
| 2.2.4 肌肉生长相关基因在北京鸭与汉中麻鸭腿肌中的表达差异 |
| 2.2.5 黑番鸭肌肉生长相关基因在不同生长阶段的表达 |
| 2.2.6 胚胎期北京鸭、汉中麻鸭和黑番鸭骨骼肌肌纤维大小的研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 肌肉生长相关基因在鸭不同生长阶段的表达 |
| 2.3.2 北京鸭与汉中麻鸭肌肉生长相关基因的差异表达 |
| 2.3.3 不同孵化阶段鸭骨骼肌肌纤维大小的研究 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 鸭不同生长阶段胸肌和腿肌的转录组分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 动物与样品采集 |
| 3.1.2 RNA提取、文库构建及测序 |
| 3.1.3 转录组序列分析 |
| 3.1.4 SNP/InDel分析 |
| 3.1.5 可变剪接预测 |
| 3.1.6 新基因分析 |
| 3.1.7 差异表达基因分析 |
| 3.1.8 KEGG通路分析 |
| 3.1.9 蛋白质互作网络(PPI) |
| 3.1.10 qPCR验证转录组结果 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 转录组数据分析 |
| 3.2.2 SNP/InDel的注释与分类 |
| 3.2.3 可变剪接体的预测 |
| 3.2.4 新基因分析 |
| 3.2.5 鸭骨骼肌中DEGs分析 |
| 3.2.6 KEGG通路分析 |
| 3.2.7 DEGs的蛋白质互作网络分析 |
| 3.2.8 鸭骨骼肌中DEGs的 qPCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 骨骼肌发育过程中SNP/InDel的注释与分类 |
| 3.3.2 骨骼肌发育过程中AS分析 |
| 3.3.3 骨骼肌各发育时间点的DEGs分析 |
| 3.3.4 KEGG通路分析 |
| 3.3.5 蛋白互作网络分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 鸭FKBP5 基因CDS区生物信息学分析及其在不同阶段各组织中的表达规律研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 动物与样品采集 |
| 4.1.2 RNA提取、cDNA合成 |
| 4.1.3 FKBP5 基因的克隆、生物信息学分析 |
| 4.1.4 鸭不同阶段各组织中FKBP5 基因的表达规律 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 鸭FKBP5 基因的克隆 |
| 4.2.2 鸭FKBP5 基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 FKBP5 在北京鸭和汉中麻鸭不同组织中的表达谱 |
| 4.2.4 FKBP5 在黑番鸭不同组织中的表达谱 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 鸭FKBP5 CDS区生物信息学分析 |
| 4.3.2 FKBP5 在不同孵化阶段鸭组织中的表达谱 |
| 4.3.3 FKBP5 在成年公母鸭组织中的表达谱 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 FKBP5 基因对鸭成肌细胞增殖分化的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料和处理 |
| 5.1.2 鸭FKBP5 过表达载体的构建 |
| 5.1.3 鸭成肌细胞的培养与处理 |
| 5.1.4 FKBP5 过表达对鸭成肌细胞增殖的影响 |
| 5.1.5 FKBP5 过表达对鸭成肌细胞分化的影响 |
| 5.1.6 数据统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 pcDNA-FKBP5 过表达载体的构建 |
| 5.2.2 pcDNA-FKBP5和siRNA-FKBP5 在鸭成肌细胞中的表达 |
| 5.2.3 FKBP5 对鸭成肌细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 FKBP5 对鸭成肌细胞分化的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 鸭FKBP5 基因启动子区的分析及与番鸭体重的关联分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 样品采集和处理 |
| 6.1.2 鸭FKBP5 基因启动子区的克隆及生物信息学分析 |
| 6.1.3 鸭FKBP5 基因启动子区荧光素酶报告基因载体构建 |
| 6.1.4 荧光素酶报告基因载体的转染 |
| 6.1.5 鸭FKBP5 基因启动子活性区域的测定 |
| 6.1.6 鸭FKBP5 基因启动子区核心转录因子的预测 |
| 6.1.7 鸭FKBP5 基因SNP引物设计 |
| 6.1.8 DNA混池测序和PCR-RFLP |
| 6.1.9 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 鸭FKBP5 基因启动子区的克隆及生物信息学分析 |
| 6.2.2 鸭FKBP5 基因启动子荧光素酶报告基因载体构建 |
| 6.2.3 鸭FKBP5 基因启动子活性区域分析 |
| 6.2.4 鸭FKBP5 基因启动子区关键转录因子预测 |
| 6.2.5 番鸭FKBP5 基因的SNPs分析 |
| 6.2.6 番鸭FKBP5 基因遗传多样性 |
| 6.2.7 FKBP5 基因SNP位点与番鸭体重的关联分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 鸭FKBP5 基因启动子区的分析 |
| 6.3.2 鸭FKBP5 基因与番鸭体重的关系 |
| 6.4 小结 |
| 主要结论、创新点及下一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）奶山羊αS1-酪蛋白基因功能及其调控乳蛋白合成的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 乳蛋白组成与乳过敏 |
| 1.2 乳蛋白基因的功能研究 |
| 1.2.1 酪蛋白基因的结构特性 |
| 1.2.2 αS1-酪蛋白基因的功能 |
| 1.3 乳蛋白合成相关信号通路的研究 |
| 1.3.1 乳蛋白的合成途径 |
| 1.3.2 JAK2/STAT5和mTOR通路对乳蛋白合成的调控作用 |
| 1.3.3 营养物质对乳蛋白合成的调控作用 |
| 1.4 乳蛋白合成的表观调控研究 |
| 1.4.1 DNA和蛋白质修饰对乳蛋白合成的调控作用 |
| 1.4.2 miRNA对乳蛋白合成的调控作用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 奶山羊α_(S1)-酪蛋白基因克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料与仪器设备 |
| 2.1.2 乳样的采集及乳蛋白的测定 |
| 2.1.3 奶山羊乳腺组织的采集 |
| 2.1.4 乳腺总RNA的提取与q PCR |
| 2.1.5 奶山羊CSN1S1 基因的克隆与鉴定 |
| 2.1.6 奶山羊CSN1S1 基因的生物信息学分析 |
| 2.1.7 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 羊奶和牛奶中α_(S1)-酪蛋白含量的比较 |
| 2.2.2 羊奶中α_(S1)-酪蛋白和β-酪蛋白含量的相关性分析 |
| 2.2.3 乳腺组织中CSN1S1和CSN2 基因的表达分析 |
| 2.2.4 奶山羊CSN1S1 基因的克隆 |
| 2.2.5 CSN1S1 基因的生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 α_(S1)-酪蛋白基因调控乳蛋白合成的机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料与仪器设备 |
| 3.1.2 腺病毒过表达载体的构建、包装与扩繁 |
| 3.1.3 干扰RNA的设计 |
| 3.1.4 奶山羊STAT5a基因真核表达载体的构建 |
| 3.1.5 奶山羊CSN2 基因启动子报告载体的构建 |
| 3.1.6 山羊乳腺上皮细胞的培养与处理 |
| 3.1.7 细胞总RNA的提取与q PCR |
| 3.1.8 细胞蛋白提取与western blot |
| 3.1.9 报告载体的转染与荧光素酶活性检测 |
| 3.1.10 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 腺病毒重组载体Ad-CSN1S1 的构建、包装与扩繁 |
| 3.2.2 过表达CSN1S1 基因对乳蛋白表达的影响 |
| 3.2.3 干扰CSN1S1 基因对乳蛋白表达的影响 |
| 3.2.4 CSN1S1 基因对乳蛋白合成关键通路的影响 |
| 3.2.5 CSN1S1 基因通过JAK2/STAT5a通路调控β-酪蛋白的合成 |
| 3.2.6 CSN1S1 基因通过STAT5a调控CSN2 启动子的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 α_(S1)-酪蛋白基因启动子的转录活性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与仪器设备 |
| 4.1.2 奶山羊CSN1S1 基因启动子的克隆及序列分析 |
| 4.1.3 STAT5 位点突变型启动子报告载体的构建 |
| 4.1.4 细胞培养与处理 |
| 4.1.5 荧光素酶活性检测 |
| 4.1.6 细胞总RNA的提取与q PCR |
| 4.1.7 细胞蛋白提取与western blot |
| 4.1.8 染色质免疫沉淀 |
| 4.1.9 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 奶山羊CSN1S1 基因启动子的克隆 |
| 4.2.2 奶山羊CSN1S1 基因启动子序列分析 |
| 4.2.3 CSN1S1 基因启动子核心区域的确定 |
| 4.2.4 STAT5对CSN1S1 转录活性的影响 |
| 4.2.5 STAT5 结合位点突变对CSN1S1 启动子活性的影响 |
| 4.2.6 STAT5与CSN1S1 启动子的直接结合作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 α_(S1)-酪蛋白基因3’非编码区的转录后调控研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料与仪器设备 |
| 5.1.2 奶山羊CSN1S1 基因3’UTR报告载体的构建 |
| 5.1.3 奶山羊CSN1S1 基因真核表达载体的构建 |
| 5.1.4 奶山羊CSN2 基因启动子突变载体的构建 |
| 5.1.5 细胞培养与处理 |
| 5.1.6 荧光素酶活性检测 |
| 5.1.7 细胞总RNA的提取与q PCR |
| 5.1.8 细胞蛋白提取与western blot |
| 5.1.9 染色质免疫沉淀 |
| 5.1.10 数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 乳腺组织中miR-204-5p和 miR-211 的表达分析 |
| 5.2.2 奶山羊CSN1S1 基因3’UTR报告载体的构建 |
| 5.2.3 miR-204-5p和 miR-211对CSN1S1 基因的靶向作用 |
| 5.2.4 miR-204-5p和 miR-211 协同调控CSN1S1 基因的表达 |
| 5.2.5 miR-204-5p和 miR-211 通过CSN1S1 基因调控β-酪蛋白的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 存在问题及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）卵形鲳鲹IGFBP3（TroIGFBP3）参与机体抗菌免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 胰岛素样生长因子系统的概述 |
| 1.1.1 胰岛素样生长因子的发现 |
| 1.1.2 胰岛素样生长因子系统的组成 |
| 1.2 IGFBP3 |
| 1.2.1 IGFBP3的结构与功能 |
| 1.2.2 IGFBP3的作用机制 |
| 1.2.3 IGFBP3的体内作用 |
| 1.2.4 IGFBP3对肿瘤的作用 |
| 1.2.5 细胞核关联的IGFBP3的研究 |
| 1.2.6 鱼类IGFBP3的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 TroIGFBP3基因克隆与功能研究 |
| 2 TroIGFBP3基因克隆和序列分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 卵形鲳鲹总RNA提取 |
| 2.1.6 cDNA第一链合成 |
| 2.1.7 获取TroIGFBP3基因 |
| 2.1.8 TroIGFBP3的PCR产物胶回收 |
| 2.1.9 感受态细胞的制备 |
| 2.1.10 TA克隆 |
| 2.1.11 TroIGFBP3序列的生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 获取TroIGFBP3基因片段 |
| 2.2.3 TA克隆 |
| 2.2.4 TroIGFBP3氨基酸序列结构分析 |
| 2.2.5 TroIGFBP3氨基酸序列同源性分析和系统发育树构建 |
| 2.3 讨论 |
| 3 TroIGFBP3的亚细胞定位 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 引物及所用载体 |
| 3.1.4 质粒构建 |
| 3.1.5 细胞培养和转染 |
| 3.1.6 亚细胞定位 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 TroIGFBP3-Tsimple质粒提取及酶切 |
| 3.2.2 pTroIGFBP3-N3重组质粒构建 |
| 3.2.3 TroIGFBP3的亚细胞分布 |
| 3.3 讨论 |
| 4 TroIGFBP3基因组织特异性以及细菌刺激对其表达的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 健康卵形鲳鲹组织的取样 |
| 4.3.2 哈维氏弧菌刺激卵形鲳鲹后组织的取样 |
| 4.3.3 引物 |
| 4.3.4 总RNA提取 |
| 4.3.5 cDNA的制备 |
| 4.3.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.3.7 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 TroIGFBP3基因的组织特异性表达分布分析 |
| 4.4.2 哈维氏弧菌刺激后TroIGFBP3基因的组织表达变化分析 |
| 4.5 讨论 |
| 5 TroIGFBP3基因的原核表达及其功能研究 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验菌株、质粒和细胞 |
| 5.1.3 主要试验试剂 |
| 5.1.4 主要试验仪器 |
| 5.1.5 引物 |
| 5.1.6 质粒抽提 |
| 5.1.7 表达载体的构建 |
| 5.1.8 重组蛋白rTroIGFBP3的表达和可溶性鉴定 |
| 5.1.9 SDS-PAGE检测 |
| 5.1.10 重组蛋白rTroIGFBP3的纯化 |
| 5.1.11 蛋白浓度的测定 |
| 5.1.12 rTroIGFBP3对PBLs增殖活性影响分析 |
| 5.1.13 rTroIGFBP3对HKMs吞噬活性影响分析 |
| 5.1.14 rTroIGFBP3对小鼠肿瘤细胞增殖的影响 |
| 5.1.15 rTroIGFBP3对小鼠肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TroIGFBP3基因原核表达质粒的鉴定 |
| 5.2.2 重组蛋白rTroIGFBP3诱导表达 |
| 5.2.3 重组蛋白rTroIGFBP3的可溶性鉴定 |
| 5.2.4 重组蛋白rTroIGFBP3的纯化 |
| 5.2.5 重组蛋白的浓度测定 |
| 5.2.6 rTroIGFBP3促进淋巴细胞增殖分析 |
| 5.2.7 rTroIGFBP3促进巨噬细胞吞噬作用分析 |
| 5.2.8 rTroIGFBP3在Hepa1-6细胞凋亡和增殖中的作用 |
| 5.3 讨论 |
| 6 TroIGFBP3体内抗细菌免疫应答研究 |
| 6.1 实验材料与方法 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 常用试剂与载体 |
| 6.1.3 引物 |
| 6.1.4 RNAi引物设计 |
| 6.1.5 RNAi的合成 |
| 6.1.6 过量表达载体的构建 |
| 6.1.7 无内毒素质粒大提 |
| 6.1.8 pTroIGFBP3在鱼体内过量表达 |
| 6.1.9 TroIGFBP3在鱼体内干扰表达 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 TroIGFBP3过量表达对鱼体抗菌感染的影响 |
| 6.2.2 TroIGFBP3干扰表达对鱼体抗菌感染的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第三章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）从江香猪GHR、IGF-1基因对成肌细胞增殖的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.研究背景 |
| 1.1 IGFs家族基因概述 |
| 1.2 GHR基因的研究进展 |
| 2.细胞增殖相关因子的研究 |
| 2.1 TAZ基因与Hippo信号通路 |
| 2.2 YAP基因的研究进展 |
| 第二章 从江香猪IGF-1、GHR基因克隆、序列及组织表达分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 从江香猪IGF-1、GHR基因过表达以及sh RNA干扰载体构建 |
| 1.试验材料 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 1.3 试验试剂及配制 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 从江香猪IGF-1和GHR基因真核表达载体构建 |
| 2.2 从江香猪IGF-1、GHR基因sh RNA干扰载体构建 |
| 2.3 阳性菌保存及质粒提取 |
| 2.4 小鼠C2C12细胞转染及增殖相关基因的表达检测 |
| 2.5 数据统计学处理 |
| 3.结果与分析 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四章 从江香猪原代成肌细胞制备及增殖研究 |
| 1.试验材料 |
| 1.1 试验动物、质粒 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 实验器材 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 成肌细胞分离培养 |
| 2.2 细胞鉴定 |
| 2.3 细胞转染试验 |
| 2.4 CCK-8检测细胞增殖 |
| 2.5 相关基因的表达 |
| 2.6 细胞冻存 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 原代成肌细胞生长状态 |
| 3.2 细胞生长曲线 |
| 3.3 细胞鉴定 |
| 3.4 荧光定量标准曲线构建 |
| 3.5 CCK-8检测细胞增殖情况 |
| 3.6 增殖相关基因的表达调控 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 参与项目及发表文章 |
| 附录Ⅱ 缩略词表 |
（8）草鱼生长抑素受体的鉴定及其拮抗剂促生长作用的初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物生长抑素及其受体家族概述 |
| 1.1.1 生长抑素的发现及研究进展 |
| 1.1.2 生长抑素受体家族研究概况 |
| 1.2 硬骨鱼的生长抑素SS及其受体家族SSTs概述 |
| 1.2.1 硬骨鱼中SS的发现发展 |
| 1.2.2 硬骨鱼SSTs研究进展 |
| 1.2.3 SS调节硬骨鱼生长的研究现状 |
| 1.3 本论文的研究内容和意义 |
| 第二章 草鱼生长抑素受体SSTs的分离鉴定及组织分布 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法与操作 |
| 2.2.1 组织RNA的提取及CDNA的合成 |
| 2.2.2 草鱼SSTs的全长编码序列的确定 |
| 2.2.2.1 草鱼SSTs全长编码序列扩增 |
| 2.2.2.2 草鱼SSTs全长编码序列与pGEM T-Easy载体的连接 |
| 2.2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.2.4 阳性克隆挑选及测序 |
| 2.2.3 草鱼SSTs氨基酸序列分析 |
| 2.2.4 草鱼SSTs氨基酸序列的多重比对 |
| 2.2.5 草鱼SSTs的系统发育树构建 |
| 2.2.6 RT-PCR探究草鱼SSTs的组织分布特征 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 草鱼SSTs核苷酸及氨基酸序列 |
| 2.3.2 草鱼SSTs氨基酸序列的多重比对结果 |
| 2.3.3 草鱼SSTs的氨基酸序列特征 |
| 2.3.4 草鱼SSTs的系统发育树 |
| 2.3.5 草鱼SSTs在垂体、肝脏等组织中的分布特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 草鱼垂体显微结构及SSTs蛋白在垂体中的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法与操作 |
| 3.2.1 草鱼SST_(2a)、SST_3、SST_5多克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 草鱼组织中蛋白的提取制备 |
| 3.2.3 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.4 免疫印迹法(Western Blot,WB) |
| 3.2.5 石蜡包埋切片 |
| 3.2.6 苏木精—伊红染色(Hematoxylin-eosin Staining,HE) |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 幼龄草鱼垂体组织的显微结构 |
| 3.3.2 草鱼SST_(2a)、SST_3、SST_5蛋白在垂体中的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于分子对接的草鱼SSTs拮抗剂的筛选 |
| 4.1 实验方法与操作 |
| 4.1.1 草鱼SSTs蛋白三维模型的构建 |
| 4.1.2 草鱼SSTs蛋白活性位点的预测 |
| 4.1.3 生长抑素受体已知小分子拮抗剂的最优构象建立 |
| 4.1.4 草鱼SSTs与拮抗剂分子对接 |
| 4.1.5 基于配受体间结合能力的比较筛选草鱼SSTs特异性拮抗剂 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 草鱼SSTs蛋白的三维模型 |
| 4.2.2 草鱼SSTs蛋白活性位点预测结果 |
| 4.2.3 草鱼SSTs拮抗剂汇总表及最优构象图 |
| 4.2.4 草鱼SSTs与拮抗剂的分子对接结果 |
| 4.2.5 草鱼SSTs特异性拮抗剂筛选结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 SST_(2a)拮抗剂对草鱼生长发育的影响研究 |
| 5.1 实验动物与材料 |
| 5.1.1 草鱼的饲养管理 |
| 5.1.2 实验仪器和设备 |
| 5.1.3 实验主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法和操作 |
| 5.2.1 实验分组设置 |
| 5.2.2 草鱼生长性能的统计分析 |
| 5.2.3 草鱼血清的制备 |
| 5.2.4 血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶含量的测定 |
| 5.2.5 草鱼肝脏组织RNA的提取及cDNA的制备 |
| 5.2.6 实时荧光定量PCR |
| 5.3 统计与分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 SST_(2a)拮抗剂对草鱼生长与形体指标的影响 |
| 5.4.2 SST_(2a)拮抗剂对草鱼肝脏组织中IGF-1基因表达水平的影响 |
| 5.4.3 SST_(2a)拮抗剂对草鱼血清中谷丙转氨酶含量的影响 |
| 5.4.4 SST_(2a)拮抗剂对草鱼血清中谷草转氨酶含量的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 下一步工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（9）小型猪GH、IGF-1基因多态性的筛选及功能解析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 小型猪实验动物化研究现状及应用前景 |
| 1.1 小型猪在生物学及医学领域的研究前景 |
| 1.2 GH-IGFs生长轴对小型猪的生长发育调控研究进展 |
| 第2章 GH及IGF-1对动物生长发育的调控研究进展 |
| 2.1 GH及IGF-1基因结构和蛋白质结构概述 |
| 2.2 GH及IGF-1基因多态性对体型的影响及其分子机制 |
| 第3章 真核生物基因编码区SNPs的研究进展 |
| 3.1 真核生物基因编码区SNPs的分类 |
| 3.2 真核生物错义突变的功能研究 |
| 3.3 真核生物同义突变的功能研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 小型猪GH、IGF-1基因SNPs的筛选及分析 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 小型猪GH基因信号肽区SNPs的功能研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 猪IGF-1基因编码区同义突变对基因表达、基因稳定性、蛋白质构象及其与IGF-1R结合的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）卵形鲳鲹生长相关基因的克隆及其对不同食物类型的表达响应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 卵形鲳鲹简介 |
| 1.2 鱼类的生长调控机制 |
| 1.3 生长相关重要基因的研究进展 |
| 1.3.1 鱼类GH研究进展 |
| 1.3.2 鱼类GHRs研究进展 |
| 1.3.3 鱼类IGFs研究进展 |
| 1.3.4 鱼类Kiss研究进展 |
| 1.4 研究目的、意义及技术路线 |
| 1.4.1 研究目的、意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 四种生长相关基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织样品采集 |
| 2.2.2 DNA提取 |
| 2.2.3 总RNA提取及逆转录 |
| 2.2.4 基因序列获得及cDNA全长克隆 |
| 2.2.5 基因序列生物信息学分析 |
| 2.2.6 基因微卫星多态性分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ToGH序列生物信息学分析 |
| 2.3.2 ToGHRs序列生物信息学分析 |
| 2.3.3 ToIGFs序列生物信息学分析 |
| 2.3.4 ToKiss序列生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 ToGH讨论 |
| 2.4.2 ToGHRs讨论 |
| 2.4.3 ToIGFs讨论 |
| 2.4.4 ToKiss讨论 |
| 第三章 四种生长相关基因的组织表达特征分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 荧光定量模板逆转录合成 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ToGH的组织差异表达 |
| 3.3.2 ToGHRs的组织差异表达 |
| 3.3.3 ToIGFs的组织差异表达 |
| 3.3.4 ToKiss的组织差异表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 三种饵料对卵形鲳鲹四种生长相关基因在肝、肠组织中的差异表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RNA提取 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 ToGH对不同食物类型的表达响应 |
| 4.3.2 ToGHRs对不同食物类型的表达响应 |
| 4.3.3 ToIGFs对不同食物类型的表达响应 |
| 4.3.4 ToKiss对不同食物类型的表达响应 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]猪Igf1r胞外编码区不同单倍型对成骨细胞和骨骼肌细胞分化的影响及机制研究[D]. 王春丽. 吉林大学, 2021
- [3]IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析[D]. 王思瑶. 吉林大学, 2021(01)
- [4]北京鸭、汉中麻鸭与黑番鸭肌肉转录组分析及FKBP5功能研究[D]. 胡志刚. 西北农林科技大学, 2021
- [5]奶山羊αS1-酪蛋白基因功能及其调控乳蛋白合成的机理研究[D]. 宋宁. 西北农林科技大学, 2021
- [6]卵形鲳鲹IGFBP3（TroIGFBP3）参与机体抗菌免疫应答研究[D]. 陈阳. 海南大学, 2020(02)
- [7]从江香猪GHR、IGF-1基因对成肌细胞增殖的影响研究[D]. 朱晓锋. 贵州大学, 2020(04)
- [8]草鱼生长抑素受体的鉴定及其拮抗剂促生长作用的初探[D]. 甘宁. 电子科技大学, 2020(07)
- [9]小型猪GH、IGF-1基因多态性的筛选及功能解析[D]. 程云云. 吉林大学, 2018(12)
- [10]卵形鲳鲹生长相关基因的克隆及其对不同食物类型的表达响应[D]. 梁银银. 上海海洋大学, 2018(01)