导读:本文包含了异种克隆论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:核仁,核糖体,转录组,异种克隆
异种克隆论文文献综述
王丽娜[1]（2018）在《核仁与核糖体发生异常影响早期异种克隆胚胎发育机制研究》一文中研究指出异种核移植(inter species nuclear transfer,iSCNT)作为一个研究核质关系的重要模型,对研究早期胚胎发育机制、探索细胞分化机理和提高克隆胚胎构建效率均具有重要意义。异种核移植胚胎会在胚胎基因组激活时期(embryos genomic activation,EGA)发生发育阻滞现象,导致这一现象的原因可能与胚胎EGA时期核仁、核糖体发生异常有关。本研究分别以牛或羊成纤维细胞为核供体,以羊或牛卵母细胞为受体胞质进行异种核移植,并以牛和羊的同种核移植作为对照,比较分析了同种核移植和异种核移植胚胎之间的差异。在异种核移植胚胎中,存在明显的8-cell发育阻滞现象。随后,对不同发育时期的同种胚胎和异种胚胎进行转录组测序分析发现,同种胚胎发育的早期核仁、核糖体发生相关基因的表达模式在不同发育时期具规律性和特异性,包括大部分核糖体大亚基基因(RPL)和核糖体小亚基基因(RPS)。然而,这些相应的基因在异种胚胎发育过程中却没有被转录激活。另外,与核仁功能密切相关的C23基因(nucleolin),在同种胚胎的8-cell时期表达量开始显着增加;相反,C23基因的表达在异种胚胎中受到了抑制。进一步利用实时定量PCR,对核糖体与核仁相关的候选基因RPL29、RPL10A、RPL19、RPLP0、RPS6、RPS8、RPS2、RPS3、RPS19和C23进行表达水平验证。结果显示,除了RPS2基因,其他与核糖体相关基因的表达量在EGA时期的同种胚胎中明显高于异种胚胎。经C23蛋白免疫荧光分析发现,在体外受精胚胎和同种克隆胚胎体外发育至72h时,核仁呈现清晰的圆环形结构,而在异种胚胎中,核仁则表现出异常的结构。本研究结果表明,胚胎发育早期核仁与核糖体发生对启动早期胚胎基因组激活具有重要的作用,异种克隆胚胎在EGA时期的发育阻滞现象可能与这一过程启动异常有关。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2018-11-01）
张霞,秦彩艳,霍海龙,王淑燕,王配[2]（2018）在《猪-人异种移植相关基因CMAH的克隆、表达及功能生物信息学分析》一文中研究指出【目的】研究版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)CMAH基因特性,探索该基因在猪-人异种器官移植免疫排斥中的作用。【方法】采用实时荧光定量PCR技术检测BMI 27个重要组织的CMAH m RNA表达水平,采用Western blot检测BMI在9个组织中的CMAH蛋白表达特征,并对CMAH编码的氨基酸进行生物信息学预测,分析CMAH蛋白质的功能。【结果】扩增得到BMI CMAH编码区序列长1 734 bp,编码577个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KM098147,对应的氨基酸登录号AIS36193。多组织相对荧光定量表达分析表明CMAH基因在颌下腺、脾及舌下腺中呈相对高表达水平,在其他组织中呈相对中、低表达水平。Western Blot分析表明CMAH蛋白在除脊髓和大脑外的其他组织都有表达。功能生物信息学分析表明CMAH蛋白质包含Rieske和Ula G保守结构域,二级结构以α螺旋为主,N末端亲水,C末端疏水,有6类功能活性位点。【结论】明确了CMAH基因的结构以及在多种组织中差异化表达情况,为深入研究其在异种器官移植方面的功能积累了基础资料。(本文来源于《四川农业大学学报》期刊2018年04期）
李禾[3]（2017）在《长寿克隆猪让异种器官移植“翘首可待”》一文中研究指出因担忧一项中国学者研究涉及到用不正当来源的器官进行移植手术，国际期刊《Liver international》决定撤回一篇在线发表的论文。做出决定之前，期刊曾要求论文作者所在单位在今年2月3日前提供证明器官来源的资料，但没有得到回应。中国农科院(本文来源于《科技日报》期刊2017-02-16）
苏广华[4]（2016）在《藏羚羊与普氏原羚异种克隆胚胎发育的转录组学研究》一文中研究指出藏羚羊(Pantholops hodgsonii)和普氏原羚(Procapra przewalskii),属偶蹄目牛科原羚属,主要分布在我国青藏高原的青海、西藏和新疆,是世界上最濒危物种。体细胞重编技术给保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。体细胞重编程技术主要包括：体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)技术和诱导多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells)。但是,亲缘关系较远的物种异种克隆生产后代比较困难,这可能会归因于一些发育相关的机制的原因。本研究当中供体细胞是已经处于分化末端的藏羚羊和普氏原羚体细胞,在以牛卵母细胞作为受体胞质,构建藏羚羊-牛异种克隆重构胚(ZBNT)和普氏原羚-牛异种克隆重构胚(PBNT),研究发现在异种克隆胚胎中早期的发育的8-16细胞时期会产生发育阻滞,囊胚的发育率在1.5%之下。我们首先从胚胎发育的阻滞期做了转录组学的分析,试图找出异种克隆胚胎发育阻滞的原因。同时采用了体细胞重编程技术手段-诱导干细胞多能性技术,对藏羚羊体细胞在体外进行了多能性诱导,之后再应用到异种克隆胚胎研究当中,旨在从另外一种渠道来提高异种克隆胚胎发育效率。1、我们首先以普氏原羚的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,并且对牛同种和普氏原羚-牛异种克隆胚胎进行了转录组基因芯片分析。分析结果显示：牛-牛同种克隆胚胎基因表达与重编程相关的基因要显着高于异种克隆胚胎(1527：643)。在异种克隆胚胎中,总共有139个与转录调控相关转录调控因子(TFs)没有被激活。在同种克隆胚胎中,母源性降解相关的基因有1515个基因表达下调,而在普氏原羚-牛异种克隆胚胎当中,只有343基因下调。线粒体与核DNA互作相关的基因,特别是TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)复合物基因,在同种克隆当中有很高的表达,而在异种克隆胚胎中表达量很低。综上所述,在PBNT的异种克隆胚胎中,母源基因的不恰当的降解,转录因子的不完全激活、线粒体相关功能的基因的不正常表达可能导致细胞在异种胞质当中的重编程失败,导致异种克隆胚胎发育异常。2、在以上研究的基础上,对藏羚羊的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,并且研究了藏羚羊异种克隆胚胎的发育,并且以普氏原羚-牛、牛-牛重构胚作为对照,研究发现,藏羚羊-牛胚胎囊胚发育率为0.8%,与普氏原羚异种克隆胚胎发育率相近(1.07%),显着的低于牛同种克隆胚胎的发育(22.9%)。我们又重新设计并且重新引入了藏羚羊-牛的异种克隆胚胎(ZBNT),试图在异种克隆胚胎(ZBNT、PBNT)与同种克隆胚胎(BBNT)找出,在异种克隆胚胎发育中的共性。进而更进一步的揭示异种克隆胚胎发育阻滞的原因。对牛同种和普氏原羚-牛异种克隆胚胎、藏羚羊-牛异种克隆胚胎进行了更为全面系统的转录组基因芯片分析。结果显示：在与同种克隆胚胎相比之后,有411个基因是在异种克隆胚胎当中所特有的表达下调基因,这些基因的GO分析集中在了细胞的膜系统功能区域,包括：nuclear lumen, intracellular organelle lumen, membrane-enclosed lumen, organelle lumen等功能区域；还有核糖体发生区域,包括：ribonucleoprotein complex biogenesis, ribosome biogenesis等功能区域。之后我们分析了TOMM (translocase of outer mitochondrial membrane)/TIMM (translocase of inner mitochondrial membrane)复合物基因家族,发现在异种胚胎当中(包括藏羚羊-牛异种克隆胚胎、普氏原羚-牛异种克隆胚胎)表达整体下调,与之前所得出结论完全相符。之后我们也发现在异种克隆共同表达下调的基因当中,转录辅激活因子mediator复合物家族成员中一部分基因是非常明显的,其中mediator家族是转录起始的一个重要的结构蛋白,MED家族在异种克隆胚胎中整体表达趋势下调。此外,有关核糖体发生功能区域的基因家族,包括：ribosomal protein large subunit (RPL家族)和ribosomal protein small subunit (RPS家族),这两个家族的基因是编码核糖体大小亚基的基因家族,在异种克隆胚胎(ZBNT和PBNT)当中,有关核糖体合成相关的大小亚基表达普遍低于同种克隆胚胎(BBNT)。同样,与同种克隆胚胎相比之后,有729个基因在异种克隆胚胎中表达上调,通过GO分析之后,这些基因的主要功能集中在了nucleotide binding, purine nucleotide binding, ribonucleotide binding, purine ribonucleotide binding等相关的通路。在这些通路中HSP (Heat Shock Protein)家族基因在异种克隆胚胎中表达明显高于在同种克隆胚胎中的表达。综上所述,在ZBNT和PBNT的异种克隆胚胎中,不光是线粒体结构相关基因TOMM/TIMM(复合物基因家族表达出现了异常,而且在转录起始的作用原件MED基因家族以及胞质核糖体大小亚基发生相关基因,也会表达异常。这些基因的表达异常,也可能是导致异种克隆胚胎发育异常的,导致重编程过程失败的重要原因。另外在ZBNT和PBNT的异种克隆胚胎中,HSP (Heat Shock Protein)家族基因表达会有明显的上调,其中也包括了HSP70, HSP90的重要亚基,HSP基因家族在细胞当中扮演重要角色,对于细胞当中物质运输以及蛋白降解等机制具有重要作用。那么在异种克隆胚胎发育过程中,可能是在异种克隆胚胎发育当中,存在一定的应激机制,来促使胚胎当中的HSP的表达。综上所述,关于异种克隆胚胎当中的这些表达异常,都有可能会是异种克隆胚胎发育低下的重要原因。3、此外,我们采用了诱导干细胞多能性技术,对藏羚羊体细胞在体外进行了多能性诱导,之后再应用到异种克隆胚胎研究当中,旨在从另外一种渠道来提高异种克隆胚胎发育效率。本研究利用小鼠(Mus musculus)来源的Oct-4(又称POU Class 5 Homeobox 1,简称：POU5F1)、Sox-2 (Sex Determining Region Y-Box 2)、Klf-4 (Kruppel-Like Factor 4)和c-Myc (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog)等4种重编程因子,对藏羚羊体细胞进行诱导重编程,并将诱导后的细胞作为移植入牛去核的卵母细胞中,进行异种克隆操作,观察异种克隆胚的体外发育情况。结果表明,经过4因子诱导之后的藏羚羊细胞并没有形成ES (embryonic stem cell,简称ES细胞)样细胞克隆,但诱导之后的细胞增殖能力和形态都发生了改变。细胞周期分析发现,诱导后的藏羚羊细胞(简称iPS-ZLY细胞)进入G2-M期的比率高于藏羚羊成纤维细胞(21.5% vs 16.7%)。iPS-ZLY细胞在培养的第4天进入生长的平台期,而ZLY细胞则在第6天进入平台期。核型分析发现,iPS-ZLY的正常2n核型比例与ZLY细胞相似(68.3%vs 69.6%)。iPS-ZLY细胞表达OCT-4基因。当把iPS-ZLY细胞移植入去核的牛卵母细胞后,iPS-ZLY异种克隆桑葚胚和囊胚形成率分别为8.5%和2.4%,而ZLY异种克隆胚胎桑葚胚和囊胚形成率则分别为3.8%和0.95%。以上研究表明,经过4种因子诱导之后藏羚羊体细胞,其增殖能力发生显着改变,细胞生长周期加快,表达多能基因Oct-4；诱导细胞的异种克隆胚胎发育率显着高于普通细胞,诱导细胞对于异种克隆胚胎发育有促进作用。本研究首次利用重编程因子诱导藏羚羊体细胞,进而对诱导之后的细胞进行了包括细胞周期、染色体核型以及多能性基因的检测,虽然没有形成干细胞样细胞克隆形态,但是多能性基因Oct-4开始表达,是一个处于分化的体细胞和多能性细胞的种间状态,这样的种间状态有助于异种克隆胚胎的发育。本研究从体外诱导重编程结合异种克隆重编程对藏羚羊分化的体细胞进行试验研究,在研究重编程机理以及物种保护具有指导意义。综上所述,体细胞重编程技术主要包括：体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)和诱导多能干细胞技术(induced pluripotent stem cells)。亲缘关系较远的物种通过异种克隆生产后代比较困难,这可能会归因于一些发育相关机制的原因。体细胞重编技术为保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。本文对藏羚羊和普氏原羚进行了异种核移植试验,研究发现在异种克隆胚胎发育过程中会形成发育阻滞的现象,之后研究针对于异种克隆发育过程阻滞机理以及如何提高异种克隆胚胎发育效率的问题开展了大量研究。研究的主要结果如下藏羚羊-牛和普氏原羚-牛异种克隆胚胎在发育过程中,存在发育阻滞。这可能归因于在异种克隆胚胎中,转录因子的不完全激活、转录辅激活因子mediator复合物家族、线粒体相关TOMM/ TIMM复合物基因家族、核糖体发生功能区域的基因家族,包括：RPL家族和RPS家族的不正常表达可能导致细胞在异种胞质当中的重编程失败,进而导致异种克隆胚胎发育异常。另外,异种克隆胚胎中,HSP家族基因表达会有明显的上调,其中也包括了HSP70,HSP90的重要基因,这可能和异种克隆胚胎当中的一些应激机制有关。经过4因子诱导之后的藏羚羊细胞并没有形成ES样细胞克隆。但诱导之后的细胞增殖能力和形态都发生了改变。并且,诱导之后的iPS-ZLY细胞表达OCT-4基因。当把iPS-ZLY细胞移植入去核的牛卵母细胞后,异种克隆效率有了明显的改善。以上这些研究对保护濒危物种,提供了另一种潜在的途径。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2016-06-01）
苏广华,李雪,刘雪菲,刘坤,白春玲[5]（2016）在《过表达重编程转录因子藏羚羊成纤维细胞异种克隆研究》一文中研究指出藏羚羊(Pantholops hodgsoni)为濒危珍稀物种。本研究利用小鼠(Mus musculus)来源的POU5f1转录因子(octamer-binding transcription factor 4,OCT-4)、性别决定基因相关转录因子2(sex determining region Y-Box 2,SOX-2)、Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF-4)和鸟类骨髓细胞瘤元癌基因同源基因(avian myelocytomatosis viral oncogene homolog,C-MYC)等4种重编程因子,对藏羚羊体细胞进行诱导重编程,并将诱导后的细胞移植入牛(Bos taurus)去核的卵母细胞中,进行异种克隆操作,观察异种克隆胚胎(inter-species somatic cell nuclear transfer,i SCNT)的体外发育情况。结果表明,经过4因子诱导之后的藏羚羊细胞(简称i PS-ZLY)并没有形成胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESc)样细胞克隆,细胞增殖能力和形态都发生了改变。细胞周期分析发现,i PS-ZLY进入G2-M期的比率高于藏羚羊成纤维细胞(简称ZLY)(21.5%vs 16.7%)。i PS-ZLY细胞在培养的第4天进入生长的平台期,而ZLY细胞则在第6天进入平台期。核型分析发现,i PS-ZLY的正常2N核型比例与ZLY细胞相似(68.3%vs 69.6%)。i PS-ZLY细胞表达OCT-4基因。当把i PS-ZLY细胞移植入去核的牛卵母细胞后,i PS-ZLY异种克隆桑葚胚和囊胚形成率分别为8.5%和2.4%,而ZLY异种克隆胚胎桑葚胚和囊胚形成率则分别为3.8%和0.95%。以上研究表明,经过4种因子诱导之后藏羚羊体细胞,其增殖能力发生显着改变,细胞生长周期加快,表达多能基因OCT-4;诱导细胞的i SCNT发育率显着高于普通细胞,诱导细胞对于i SCNT发育有促进作用。本研究首次利用重编程因子诱导藏羚羊体细胞,进而对诱导之后的细胞进行了包括细胞周期、染色体核型以及多能性基因的检测,虽然没有形成干细胞样细胞克隆形态,但是多能性基因OCT-4开始表达,是一个处于分化的体细胞和多能性细胞的中间状态,这样的中间状态有助于i SCNT的发育。本研究结果对重编程机理研究以及物种保护具有指导意义。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2016年07期）
秦彩艳,陈园园,王配,王淑燕,霍金龙[6]（2015）在《版纳微型猪近交系猪-人异种器官移植免疫排斥相关基因CMAH的克隆、表达及功能分析》一文中研究指出引言:"版纳微型猪近交系(Banna Mini-pig Inbred Line,BMI)"是世界上第一个大型哺乳类实验动物近交系,个体间差异性小、均一性好,遗传稳定,基因污染和遗传漂变几率小,为猪-人异种器官移植提供了适宜的器官供体。猪N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,NeuGc)是猪体内N-乙酰神经氨酸(本文来源于《遗传多样性：前沿与挑战——中国的遗传学研究（2013-2015）——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编》期刊2015-08-14）
郑军军[7]（2013）在《梅花鹿—牛异种克隆胚胎构建》一文中研究指出本研究以梅花鹿角柄骨膜细胞为核供体，MⅡ期牛卵母细胞为受体，挤压法去核，构建梅花鹿-牛异种重构胚。从电场强度、电脉冲次数、脉冲持续时间和融合前恢复培养时间这四个方面，探讨了电融合参数对梅花鹿-牛异种重组胚融合效果和卵裂的影响，结果以融合率、死亡卵率和卵裂率计。主要结果和内容如下：一、梅花鹿角柄骨膜细胞生长曲线及染色体组型分析1.第9代梅花鹿角柄骨膜细胞在38.5℃、5%CO2、饱和湿度、10%FBS培养条件下仍然具有哺乳动物细胞典型的“S”型生长曲线，增殖迅速。该培养条件适宜角柄骨膜细胞的生长。2.对第9代的梅花鹿角柄骨膜细胞进行常规染色体检测，统计分析表明染色体组型为2n=66。说明长时间的传代培养不会改变角柄骨膜细胞遗传特性，可以作为体细胞核移植的供核细胞。二、电融合参数对梅花鹿-牛异种重构胚融合效果和卵裂的影响1.2.4KV/cm电场强度重组胚融合率（48.6%）显着高于其他叁组（25.2%、41.0%、31.1%，P＜0.05），但在死亡卵率和卵裂率方面四组差异不显着(P>0.05)。2.1次电脉冲次数组和2次、3次组在重组胚融合率、死亡卵率和卵裂率方面差异不显着(P>0.05)。3.10μs电脉冲持续时间在重组胚融合率和卵裂率（68.4%、47.0%）方面均显着高于20μs、30μs和40μs组（52.9%、26.0%，53.8%、6.3%，37.5%、0，P＜0.05），在死亡卵率方面差异不显着(P>0.05)。4.融合前恢复培养时间2h的卵裂率（64.7%）显着高于1h和3h组（分别为54.3%、26.0%，P＜0.05），但叁组在融合率和死亡卵率方面差异不显着(P>0.05)。实验结果表明，梅花鹿角柄骨膜细胞在38.5℃培养条件下能正常生长、增殖，不会改变其遗传特性，可以用作核移植的供体细胞；电场强度2.4KV/cm、脉冲次数1次、持续时间10μs、融合前恢复培养时间2h是适宜进行梅花鹿-牛异种体细胞核移植电融合的条件。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2013-06-01）
高川[8]（2013）在《Scriptaid对核重编程及牦牛异种克隆胚体外发育的影响》一文中研究指出体细胞核移植技术是动物胚胎工程中一项重要的技术手段。随着核移植技术的不断发展，异种核移植成为近年来的研究热点之一。但无论同种核移植还是异种核移植，目前效率仍很低。研究表明，供体细胞的不完全重编程或重编程错误，导致胚胎发育过程中相关基因的不表达或异常表达，这是造成克隆效率低的主要原因，其中组蛋白乙酰化和DNA甲基化对于重编程的影响尤其重要。此外，大量研究表明，表观修饰类药物能显着促进重编程及提高克隆效率。因此，本实验以第3~5代牦牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，黄牛卵母细胞作为受体细胞，构建牦牛异种克隆胚胎，探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scpritaid对供体细胞的重编程以及重构胚发育的影响，具体如下：1.分别利用不同浓度（0nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、1500nmol/L、3000nmol/L）的Scriptaid处理牦牛胎儿成纤维细胞24h，检测药物处理对细胞生物学特性的影响。结果显示：经Scriptaid处理后，细胞形态学发生了明显的改变，分裂增殖速度随Scriptaid处理浓度的增加而减慢，细胞周期明显被抑制在G0/G1期。2.以上述不同浓度Scriptaid处理后的成纤维细胞作为核供体细胞，以黄牛卵母细胞为受体细胞，构建异种重构胚，检测Scriptaid处理对重构胚体外发育的影响。结果显示：各实验组间卵裂率无明显差异，随着Scriptaid浓度的增加，囊胚率逐渐升高，1000nmol/L Scriptaid处理组的囊胚率显着高于其他组(P<0.05)，但随着Scriptaid浓度的继续增加，囊胚率又呈逐渐降低趋势。以上结果表明适当浓度的Scriptaid处理供体细胞有利于重构胚的发育。3.研究表明，提高组蛋白乙酰化水平和降低DAN甲基化水平有利于促进重编程。本实验采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理牦牛胎儿成纤维细胞，通过免疫荧光技术检测组蛋白H3K9ac乙酰化水平，并以qRT-PCR的方法检测不同浓度处理组间HDAC-1、HDAC-2、DNMT-1、DNMT-3a的表达差异。结果显示：随着Scriptaid浓度的增加，细胞组蛋白H3K9ac乙酰化水平逐渐提高；处理组间各基因表达均无显着差异，但处理组与对照组之间差异显着（HDAC-2除外），其基因表达量都显着降低。以上结果表明:Scriptaid能显着抑制去乙酰化酶基因HDAC-1和DNA甲基化酶基因DNMT-1、DNMT-3a的表达，与组蛋白免疫荧光结果相吻合，初步证实Scriptaid是通过提高成纤维细胞的组蛋白乙酰化水平来促进核的重编程。(本文来源于《西南民族大学》期刊2013-03-31）
郜宇[9]（2012）在《普氏原羚—牛异种动物克隆研究》一文中研究指出普氏原羚(Procapra przewalskii),亦称普氏小羚羊,是世界上最濒危物种之一,为中国特有珍惜濒危物种。属偶蹄目、牛科、羚羊亚科、原羚属动物,历史上曾分布于内蒙古、甘肃、宁夏和青海。它形态大小与藏原羚相似,曾被看作是藏原羚的一个亚种,实为独立种。本研究以普氏原羚的成体细胞作为核供体,以牛的卵母细胞作为受体胞质,进行异种克隆操作,探讨普氏原羚异种克隆的可行性。从青海野生动物园的一只健康成年普氏原羚的耳源部采得约0.5cm2的组织1块,经体外培养后,得到成纤维细胞。从细胞水平对普氏原羚体细胞培养、生长曲线测定、核型制备与分析、细胞周期、转染条件的优化等方面进行了较为系统的研究。从屠宰场收集牛卵巢,采得卵丘卵母细胞复合体,经体外培养后,获得成熟卵母细胞。使用去乙酰化酶抑制剂处理异种重构胚,采用常规体细胞核移植技术和改进后的反向核移植技术,观察了普氏原羚异种克隆胚的发育情况。结果如下：1、普氏原羚成纤维细胞培养在38.5℃, CO2浓度为5.0%的条件下,经过0.5%血清饥饿处理2天,当细胞的汇合度为50%-60%,70%-80%,95%-100%时,G0/G1期细胞的百分比分别为77.03%,77.51%和92.25%。长满后(接触抑制使细胞大部分处于G0/G1期)的体细胞与血清饥饿处理的体细胞在进行核移植时,效果是一致的。细胞成梭型长条状或不规则多角形、边缘清晰。经细胞冷冻、复苏后,细胞活力无明显改变。细胞的染色体数目为60条,但是随着培养代次的增加,染色体的非整倍性会逐渐增加,表明体外培养系统会对细胞染色体倍性产生一定影响。用脂质体介导的红色荧光蛋白(pDS-Red2)和Oct-4-eGFP转染普氏原羚成纤维细胞,最佳的转染条件是15μl Lipfectamine LTX及4μg质粒DNA的转染体系。2、分别以不同浓度的去乙酰化酶抑制剂Valproic acid (VPA)对普氏原羚-牛异种重构胚处理不同时间,观察克隆胚胎的发育。结果表明,0.5mM的VPA处理24h可以显着提高克隆胚胎8-16细胞的发育率(61.9%vs50.7%)。但是,与未处理的对照组相比,异种克隆胚胎的桑椹胚和囊胚发育都没有显着性差异(1.2%vs1.6%, P>0.05;0.8%vs1.6%, P>0.05);用0.5mM的VPA处理转基因细胞来源(Oct-4-eGFP)的异种重构胚,观察异种重构胚的发育。结果表明,经VPA处理24h后,试验组与对照组在卵裂率(78.4%vs71.4%)、8-16细胞发育率(62.1%vs58.5%)、桑椹胚发育率(1.3%vs1.9%)和囊胚发育率(0.7%vs1.3%)等方面均没有显着差异(P>0.05)；用30nM的Trichostatin A (TSA)处理重构胚24h,观察异种重构胚的发育情况。TSA处理组在各个时期显着高于对照组,囊胚率也得到明显提高(3.6%/3.0%vs0.8%/0.9%,P<0.05),获得3枚表达绿色荧光的转Oct-4-eGFP的普氏原羚-牛的异种克隆囊胚；通过反向核移植法进行异种核移植操作,观察异种重构胚的发育情况。结果表明,在卵裂率(61.1%vs63.5%)和8-16细胞发育率(45.6%vs49.0%)上没有显着性差异,实验组得到1枚囊胚；为了探索普氏原羚-牛的异种克隆胚胎发育低的问题,本研究还对异种重构胚、受体卵母细胞、供体细胞、牛-牛同种克隆胚胎等进行了芯片检测。结果显示,与供体细胞、卵母细胞相比,8-16细胞期异种重构胚激活643个基因,而8-16细胞期牛克隆胚胎激活了1527个基因。异种重构胚只激活了部分与重编程相关的基因。与牛体细胞相比,普氏原羚体细胞中有1010个基因没有被有效沉默。提示异种来源的供体细胞在核重编程过程中进行的不彻底。以上结果表明,虽然牛的卵母细胞质可以支持普氏原羚体细胞发生重编程,异种重构胚可以发育到囊胚,但是囊胚发育率均很低。利用VPA处理重构胚未能提高囊胚发育率；而TSA处理重构胚明显提高了囊胚发育率；异种囊胚能够表达重编程因子0ct-4。组学分析初步表明,异种重构胚只能激活部分与重编程相关的胚胎发育基因,供体细胞的基因还在持续表达,母源性mRNA在异种重构胚降解可能受到阻碍。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2012-05-01）
马苗苗[10]（2012）在《羊—牛异种克隆胚胎供核细胞线粒体命运的研究》一文中研究指出泛素是一种由76个氨基酸残基组成的高度保守的热稳定的小分子蛋白质,广泛存在于动物体中参与细胞内约80%蛋白质降解。已有研究证明,同种或亲缘关系较接近物种在正常受精过程中,精子来源的线粒体被卵母细胞的泛素所降解。与正常受精相比,克隆动物体内线粒体的去向因物种不同而呈现较大差异。很多学者认为克隆动物存在重编程及核质互作机制,但是缺乏具体理论支撑,本研究通过体细胞核移植构建羊-牛异种克隆胚胎,在荧光显微镜下观察核移植前已进行荧光染料标记的山羊供核细胞线粒体在重构胚中与牛受体卵母细胞中过表达的泛素蛋白的相互作用情况,目的在于检测异种克隆胚胎内是否存在异质线粒体的泛素化降解。本研究已经取得了如下结果：(1)构建pVenus-Ub重组表达质粒并完成泛素基因在细胞和分子水平的表达检测。依照Genbank公布的泛素序列(GenBank号为M17524.1),合成泛素基因。将泛素目的基因从商品载体pUC57-Ub经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切之后回收目的片段,在T4连接酶作用下连接,构建重组质粒pVenus-Ub。将重组质粒pVenus-Ub通过Lipofectamine2000导入Hela细胞,荧光镜下观察到转染后细胞质呈现黄绿色荧光。之后,以转染后细胞的基因组cDNA为模板,设计引物进行PCR扩增获得大小为264bp的目的条带,证明重组载体pVenus-Ub已转染到Hela细胞内并表达。(2)通过体外转录及cRNA显微注射,实现泛素基因在牛卵母细胞及孤雌胚胎中的正常表达。重组载pVenus-Ub经内切酶EcoR Ⅰ酶切线性化后,将酶切产物体外转录成5'-capped和3'-Poly (A) Tailing cRNA并注射到脱去颗粒细胞的卵母细胞胞浆中,荧光显微镜观察到绿色荧光在整个胞质呈广泛性分布,且在第一极体和卵母细胞核、细胞膜下明显亮于细胞质,结果表明pVenus-Ub mRNA能在牛卵母细胞成熟过程中及孤雌胚胎中高效表达且融合蛋白在核周及皮质区表达效率较胞质高。(3)通过体细胞核移植,观察到供核细胞线粒体在羊-牛重构胚发育早期各阶段不被降解,并与泛素分布实现共定位。选取泛素高效表达的成熟牛卵母细胞,盲吸法去除细胞核,JC-1染料标记山羊成纤维细胞之后注入牛卵母细胞中,荧光镜下观察,山羊供核细胞的线粒体荧光强度随胚胎早期分裂出现增强现象,且与泛素融合蛋白共同分布于胞质中,并在核区及细胞膜下强度较高,证明了山羊供核细胞线粒体不被泛素化降解并实现与泛素蛋白共定位。(4)通过牛孤雌胚胎发育各阶段线粒体荧光染色,进一步证明了泛素表达定位与线粒体分布的相关性。泛素蛋白在牛早期孤雌胚胎的各阶段均表达,绿色荧光在整个胞质呈广泛性分布,细胞膜下和细胞核区绿色荧光略强于细胞质。JC-1染色后胚胎各时期的线粒体分布也同泛素蛋白分布一致,在胞质中主要呈弥散性分布,在核周及皮质区分布略集中,说明pVenus-Ub mRNA能在孤雌胚胎中高效表达且融合蛋白在核区及皮质区表达效率较高,泛素蛋白与线粒体共定位。本研究建立了泛素基因的真核、卵母细胞及胚胎表达体系,通过体细胞核移植方法构建了羊-牛异种克隆胚胎,证明了异种克隆胚胎异质线粒体不被受体胞质泛素化降解,并且与泛素表达相关联,为进一步探究核移植线粒体遗传现象、进一步揭示核移植的机理提供了一定参考。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-05-01）
异种克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】研究版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)CMAH基因特性,探索该基因在猪-人异种器官移植免疫排斥中的作用。【方法】采用实时荧光定量PCR技术检测BMI 27个重要组织的CMAH m RNA表达水平,采用Western blot检测BMI在9个组织中的CMAH蛋白表达特征,并对CMAH编码的氨基酸进行生物信息学预测,分析CMAH蛋白质的功能。【结果】扩增得到BMI CMAH编码区序列长1 734 bp,编码577个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KM098147,对应的氨基酸登录号AIS36193。多组织相对荧光定量表达分析表明CMAH基因在颌下腺、脾及舌下腺中呈相对高表达水平,在其他组织中呈相对中、低表达水平。Western Blot分析表明CMAH蛋白在除脊髓和大脑外的其他组织都有表达。功能生物信息学分析表明CMAH蛋白质包含Rieske和Ula G保守结构域,二级结构以α螺旋为主,N末端亲水,C末端疏水,有6类功能活性位点。【结论】明确了CMAH基因的结构以及在多种组织中差异化表达情况,为深入研究其在异种器官移植方面的功能积累了基础资料。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
异种克隆论文参考文献
[1].王丽娜.核仁与核糖体发生异常影响早期异种克隆胚胎发育机制研究[D].内蒙古大学.2018
[2].张霞,秦彩艳,霍海龙,王淑燕,王配.猪-人异种移植相关基因CMAH的克隆、表达及功能生物信息学分析[J].四川农业大学学报.2018
[3].李禾.长寿克隆猪让异种器官移植“翘首可待”[N].科技日报.2017
[4].苏广华.藏羚羊与普氏原羚异种克隆胚胎发育的转录组学研究[D].内蒙古大学.2016
[5].苏广华,李雪,刘雪菲,刘坤,白春玲.过表达重编程转录因子藏羚羊成纤维细胞异种克隆研究[J].农业生物技术学报.2016
[6].秦彩艳,陈园园,王配,王淑燕,霍金龙.版纳微型猪近交系猪-人异种器官移植免疫排斥相关基因CMAH的克隆、表达及功能分析[C].遗传多样性：前沿与挑战——中国的遗传学研究（2013-2015）——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编.2015
[7].郑军军.梅花鹿—牛异种克隆胚胎构建[D].中国农业科学院.2013
[8].高川.Scriptaid对核重编程及牦牛异种克隆胚体外发育的影响[D].西南民族大学.2013
[9].郜宇.普氏原羚—牛异种动物克隆研究[D].内蒙古大学.2012
[10].马苗苗.羊—牛异种克隆胚胎供核细胞线粒体命运的研究[D].西北农林科技大学.2012