杨丽萍伊茂礼阎志勇（山东省青岛大学医学院山东青岛266000）
【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）6-0007-03
【摘要】目的了解我院临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子携带情况，以及整合子与鲍曼不动杆菌的耐药相关性分析。方法用VITEK2Compact全自动微生物分析系统及纸片扩散法检测临床分离的鲍曼不动杆菌对常用22种抗生素的敏感性。PCR扩增整合酶基因检测鲍曼不动杆菌携带整合子情况，同时对整合子可变区进行扩增及测序以其了解整合子耐药基因盒携带耐药基因的情况。结果鲍曼不动杆菌呈多重耐药性。鲍曼不动杆菌对CPZ/SB耐药率为1.2%，对替加环素（15.4%）、左旋氧氟沙星（34.4%）、亚胺培南（54.3%）、比阿培南（49.4%）、阿米卡星（59%），对其他抗生素均在71%以上。104株中有73株菌株含Ⅰ类整合子（阳性率为70.2%），未有Ⅱ、Ⅲ类整合子扩增阳性菌株，且Ⅰ类整合子阳性株的耐药性均高于阴性株。Ⅰ类整合子基因盒序列分析表明我院鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子携带aacA4、catB8和aadA13种耐药基因。结论我院分离的鲍曼不动杆菌主要携带Ⅰ类整合子，且与多重耐药性密切相关。
【关键词】鲍曼不动杆菌整合子整合酶多重耐药性
鲍曼不动杆菌导致的多种感染流行或爆发的医院感染在过去10年里已在世界各地包括国内广泛报道，尤其引起医药及微生物学界等的关注［1］。鲍曼不动杆菌已经是常见的医院内感染非发酵革兰阴性杆菌。对几乎各类化学结构各异的临床常用抗生素呈现高度的天然固有耐药性和获得性耐药性使其感染的药物治疗选择极其有限［2，3］鲍曼不动杆菌引起的院内感染及耐药发展趋势值得我们高度关注，为了解我院鲍曼不动杆菌中整合子的分布情况及耐药性，对我院2009年4月至2010年1月临床收集的104株鲍曼不动杆菌进行耐药分析及整合子检测与序列分析，进一步探讨整合子与鲍曼不动杆菌耐药关系。
1材料和方法
1.1菌株来源收集烟台毓璜顶医院2009年4月～2010年1月住院患者送检标本中分离的鲍曼不动杆菌共104株，菌株均经法国梅里埃公司vitek2Compact全自动微生物分析鉴定系统鉴定。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922，产酸克雷伯菌700630。
1.2试剂抗生素药敏纸片、M-H琼脂、肉汤培养基、琼脂糖均购自英国OXOID公司；2×TaqPCRMasterMixDNAsizemarkerⅡ、2500bpDNAsizemarker均购于北京天坛生物科技公司；内切酶Rsa和HindI均购于大连TAKARA公司；引物合成及PCR产物测序由上海英俊公司完成。
1.3药敏试验菌株均经法国梅里埃公司vitek2Compact全自动微生物分析系统革兰阴性菌鉴定卡（GN）鉴定，药敏为GN13药敏卡MIC法检测22种药物(氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢替坦、头孢噻利、亚胺培南、比阿培南、替卡西林/克拉维酸、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、替加环素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明)的敏感性；质控菌为产酸克雷伯菌700630，大肠埃希菌ATCC25922。
1.4细菌处理挑取纯培养菌落于含有750ul超纯水的离心管内并充分混匀，95℃水浴20min后，再-20℃冰浴10min。最后20000r/min离心4min，收集上清液，-20℃冰箱备用。
1.5整合子及及整合子可变区相关耐药基因盒的扩增PCR反应体系为20μl，2×TaqPCRMasterMix10μl，1μlDNA模板，10pmol/L引物各1μl，灭菌双蒸水7μl。反应条件：94℃预变性5min；循环参数为：94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min结束。用含溴乙啶的2％琼脂糖凝胶电泳分析。对整合酶阳性菌株再进行整合子可变区的扩增，扩增整合子可变区循环参数94℃变性4min95℃30s47℃40s72℃2min30个循环。最后72℃延伸10min。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像系统观察电泳结果，并照相。
1.6酶切分析取10×Hbuffer2ul，10U／ul的内切酶HinfⅠ和Rsa各1ul,整合子可变区PCR扩增产物8ul,dsH2O8u37℃水浴4h,酶切产物用含EB的2％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.7基因测序整合子可变区扩增产物酶切后电泳条带一致,可认为其具有相同的DNA序列，每一类型选取1～2株送上海英俊公司纯化并进行双向测序。测序结果在Genbank中blast序列比对。
2结果
2.1药敏结果对临床分离的104株鲍曼不动杆菌耐分析表明耐药现象严重，其对头孢哌酮／舒巴坦的耐药性为1.2%，对亚胺培南、头孢吡肟、阿米卡星、左氧氟沙星、哌拉西林、替加环素等几种抗生素的耐药性在15.4％～69.9％之间。对其他抗生素耐药率均在70％以上。整合子阳性菌株和阴性菌株的耐药情况分析发现，整合子阳性菌株耐药率明显高于整合子阴性菌株。
2.2PCR结果104株鲍曼不动杆菌通过PCR扩增来检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子，其中Ⅰ类整合子73株扩阳性，检出率为70.2%。（图1），Ⅱ、Ⅲ类整合子未有检出。对部分Ⅰ类整合酶基因阳性的菌株使用intCS-F和intCS-R引物扩增整合子可变区，共有71株阳性（97.2%）。大小片段相近均在2500bp左右（图2）。
M：DNAmarker的梯度大小从下至上250,500,750,1000（亮），1500,2000,2500,3000（亮），3500,4000,5000,6000（亮）8000,10000，（条带太大，maker跑的不是很开）1-10：部分可变区扩增阳性菌株，其中1、2、3、5、6、8、9、10均为2500bp左右；4、7经测序后两条带为非特异扩增杂带。
2.3酶切结果鲍曼不动杆菌同大小的可变区PCR产物用Rsa和HindI双酶切后，显示均为同一条带整合子（图3）。
2.4测序结果鲍曼不动杆菌约2500bp左右为完全相似的酶切图谱，可以确定为同一条带。随机纯化一个PCR产物测序，实际片段为2313bp,经GenBank中blast序列比对发现可变区含有3个耐药基因为aacA4-catB8-aadA1。其DNA序列与GenBank登录号HQ880273序列具有同源性。
3讨论
本研究药敏结果显示我医院临床分离的104株鲍曼不动杆菌对所测试的头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低为1.2%，其次是碳青霉素类的替加环素的耐药率为（15.4%），对左旋氧氟沙星耐药率为34.4%，耐药率达90%以上的有头孢唑啉和头孢替坦，其余药物的耐药率在49.4%-81.8%之间。显示出该菌对头孢菌素类、广谱青霉素、氨基糖苷类、和氟喹诺酮类呈现高度耐药及严重的多重耐药现状，说明对鲍曼不动杆菌所致感染治疗的抗菌药物选择已十分有限。我院临床分离鲍曼不动杆菌的耐药情况与国内其他地区报道基本一致。
在本次实验中，鲍曼不动杆菌对β-内酰胺酶抑制剂复合制剂头孢哌酮/舒巴坦的耐药率（1.2%）明显低于其他抗菌药物，显示出头孢哌酮/舒巴坦对鲍曼不动杆菌相对良好的抗菌活性，说明头孢哌酮/舒巴坦可作为我院鲍曼不动杆菌感染治疗的首选药物。本实验中鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率仅为15.4%，敏感率为53.8%，但菌株的MIC值处于中介范围为30.8%，提示可能需要通过在安全范围内加大剂量来提高疗效。
整合子是一个可移动性基因元件，能整合不同的耐药基因盒，是导致细菌多重耐药的重要原因。整合子的结构由3个部分组成：5′保守末端(5′conservedsegment,5′CS)、3′保守末端(3′conservedsegment,3′CS)和两者之间的可变区(variableregion)。5′CS是整合子的基本结构，包括编码整合酶(integrase,IntI)的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)。IntI属于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切。整合酶基因带有自己的启动子Pint。attI位于整合酶基因的上游，是外源基因盒整合到整合子上的位点。启动子Pant指导下游可变区中自身不带有启动子的基因盒中基因的表达，中间的可变区含有一个或多个基因盒，基因盒由一个结构基因(多为耐药基因)和一个位于其下游的特异性重组位点(59baseelement,59be或称为attC位点)构成。整合酶识别位点有2个:一个是整合子中整合酶基因相邻的attI部位;另一个是位于基因盒的attC位点。游离的基因盒以闭合环状结构存在于细胞中,通过整合酶IntI催化,以线性结构结合于特异位点,进行位点特异重组,精确插入到整合子中,有实验证实,整合酶属于酪氨酸整合酶家族，根据其基因序列的不同，整合子可以分为6类，对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子研究比较多，并且与耐药性有明确的关系。Ⅰ类整合子是临床分布最广的一类整合子，在临床检测中具有重要意义。
本实验对104株鲍曼不动杆菌进行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因的检测，未有Ⅱ、Ⅲ类整合子扩增阳性菌株，并对Ⅰ整合子阳性的可变区进行耐药基因盒检测。结果阳性检出率为70.2%，高于国外的检测率。可能与整合子的播散速度加快以及地区差异有关。对Ⅰ类整合子阴性菌株与阳性菌株的耐药情况进行分析，可以发现除头孢哌酮/舒巴坦这种对鲍曼不动杆菌敏感的药物外，对其余所测试的药物Ⅰ类整合子阳性菌株的耐药率均显著高于整合子阴性菌株，显示出Ⅰ类整合子在鲍曼不动杆菌多重耐药中起到重要作用。对Ⅰ类整合子可变区序列分析显示其所携带的3个耐药基因为aacA4,aadA1和catB8，其中aacA4编码6′-N-氨基糖苷乙酰转移酶，引起对阿米卡星、奈替米星和妥布霉素耐药；aadA1编码氨基糖苷核苷转移酶，引起对链霉素和大观霉素耐药；catB8编码氯霉素乙酰转移酶，引起对氯霉素耐药。说明aacA4-catB8-aadA1是这两年本批鲍曼不动杆菌中最流行的一种整合子。提示我院临床医生应合理使用抗生素，降低大量抗生素使用的长期性，以减少细菌多重耐药的发生。积极对整合子及整合子耐药基因的监测，以用来预测并控制细菌的耐药性。
参考文献
[1]李显志，凌保东.2006年细菌对抗菌药物耐药机制研究进展回顾[J].中国抗生素杂志，2007,32（4）∶193,202.
[2]汪复.多重耐药铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌严重感染的防治策略[J].中国感染与化疗杂志，2007,7(3):230-232.
[3]史俊燕，张小江，徐英春等.2007年中国CHINET鲍曼不动杆菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志[J].2009年5月30日第九卷第三期.