导读:本文包含了密码子改造论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:α-factor,密码子改造,内切葡聚糖酶基因,毕赤酵母
密码子改造论文文献综述
侯晟琦[1]（2012）在《pPIC9K α因子密码子改造对内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中表达的影响》一文中研究指出纤维素酶是一类能够降解纤维素,使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称。通过将纤维素物质水解成单糖来发酵产乙醇,可以解决存在于农业、再生能源以及环境污染中的多种问题。同时,纤维素酶的应用已扩展到医药、日用化工、造纸、食品发酵、废水处理、工业洗涤、中草药提取等各个领域。纤维素酶在我国具有广阔的市场,但是,目前高成本、低酶活性已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈,因此提高纤维素酶的活性或表达量,对工、农业生产具有重要的意义。本研究以课题组已构建好的酵母基因工程菌GS115-End和pPIC-Ends为出发菌株,根据pPIC9K的α-factor序列,按照毕赤酵母对密码子的使用偏好,人工设计合成了毕赤酵母表达载体pPIC9K的新型α-factor序列HS。将此HS序列替换质粒pPIC9K-End/Ends中原有的α-factor序列,用此构建好的重组质粒pPIC9K-HS-End和pPIC9K-HS-Ends转化大肠杆菌DH5α。通过PCR和测序鉴定,成功筛选得到了重组DH5α(pPIC9K-HS-End/Ends)菌株。然后提取质粒pPIC9K-HS-End/Ends,经SalI先线性化质粒后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。经MD、MM平板筛选和PCR鉴定,获得了α-factor密码子改造后的内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌株,并分别命名为9KHSEGS和9KHSEG。分别对酵母基因工程菌株9KHSEG和9KHSEGS进行纤维素酶活性测定,结果表明26℃下,在BMGY/BMMY培养基中诱导84h时酶活力可以达到最高值,分别为726.8UmL和865.5U/mL,这与出发菌株酶活性水平基本一致。但随着诱导温度的升高或者降低,酶活性也随之降低。在30℃下诱导培养84h时酶活性达最高值,分别为621.71U/mL和676.4U/mL。这与出发菌株相比较,酶活性下降到到原来的79.57%和74.04%。同时,蛋白质含量与原始菌株比较也分别下降14.10%和20.10%。而两者比活力变化并不明显,分别为原始的92.65%和92.68%。实验证明,实施密码子改造后的酵母基因工程菌株9KHSEGS和9KHSEG最适诱导温度为26℃,最佳诱导时间为84h。本实验也证实,α因子密码子改造后影响了内切葡聚糖酶的分泌表达,α因子非尤势密码子对蛋白质的表达分泌有重要的作用。对产内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌9KHSEGS和9KHSEG诱导表达产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,表达的酶蛋白分子大小为79.82KD,与原始菌株结果致。最后,对此新构建的两株酵母工程菌株连续传10代培养实验验证证实,内切葡聚糖酶毕赤酵母基因工程菌遗传稳定。(本文来源于《四川农业大学》期刊2012-06-01）
王幸兴[2]（2011）在《绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造及其特性研究》一文中研究指出绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是由假单胞菌属绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的一种细胞毒性外毒素,是绿脓杆菌重要的致病因子。PEA的ADP-核糖基转移酶活性能使靶细胞的延伸因子-2(EF-2)发生核糖基化而失活,导致蛋白质的生物合成受阻,从而对细胞产生毒性作用。利用PEA的这一毒性作用,将其与靶向蛋白(抗体或靶细胞膜受体配基)连接或融合制成的免疫毒素被广泛用于癌症的靶向治疗。PEA除具有上述细胞毒性作用外,还具有较强的免疫原性,它不仅可作为疫苗蛋白,也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体。然而由于天然PEA的细胞毒性较强,不能直接作为疫苗佐剂和载体应用于疫苗的生产,必须通过基因工程方法对其进行基因改造使其毒性降低或完全脱毒才能应用。为提高PEA基因在大肠杆菌中的表达水平和获得脱毒的PEA基因,我们首先利用PCR方法从本实验室构建的含有PEA基因的pcDNA3.1/PEA质粒中扩增PEA基因,然后依据该基因的序列,利用大肠杆菌偏爱的密码子对PEA编码基因进行了全序列优化改造并人工合成,然后利用pET20b(+)质粒分别构建其与His标签融合的野生型和密码子优化型的PEA原核表达载体pET20b-PEAwt/His和pET20b-PEAopt/His。将表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导使其进行分泌表达。采用硫酸镁休克的方法从细菌周质中分离表达的重组PEA蛋白,用Ni-NTA琼脂糖进行纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组PEA蛋白,用考马斯亮蓝显色法检测PEA蛋白的浓度,并比较野生型和密码子优化型PEA的表达水平。然后以构建好的pET20b-PEAopt/His质粒为模板,根据PEA蛋白的结构特点,在PEA蛋白的氨基酸序列中选定若干位点,通过核苷酸介导的定点突变方法对选定位点氨基酸的编码基因进行定点突变,从而得到若干PEA突变体的原核表达载体。将各种突变体表达载体转化大肠杆菌进行表达,用与上述同样的方法分离纯化和鉴定重组PEA蛋白。最后利用小鼠成纤维细胞L929检测不同PEA突变体对细胞的毒性作用,从中筛选出毒性低的PEA突变体。实验结果表明,经过密码子优化,PEA编码基因发生402个碱基的取代,GC含量由原来的69.8%降至52.2%,下降了33.7%。蛋白表达结果显示,密码子优化型PEA的表达量(78.7±2.5 mg/L)明显高于未优化的表达量(39.0±2.0 mg/L)(P<0.01),表达水平提高了近1倍。细胞毒性实验表明,密码子优化的PEA基因制备的重组蛋白对培养的动物细胞L929有明显的毒性作用,说明该蛋白具有天然生物活性。经过定点突变得到的12个PEA基因突变体,经SDS-PAGE检测证实不同PEA突变体基因均能在大肠杆菌中进行分泌表达。表达的PEA重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖纯化,作用于L929细胞显示出不同的细胞毒性,通过比较得出12个低细胞毒性的PEA突变体,并最终从中选取3个毒性较低的突变体用于下一步的研究,从而为PEA蛋白在疫苗佐剂与载体上的研究和应用奠定了基础。(本文来源于《河北农业大学》期刊2011-05-27）
刘健,陈瑞爱,刘珊珊,朱杰仪,唐明森[3]（2011）在《猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达》一文中研究指出根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经Zeoc inTM抗性筛选后获得大量多拷贝重组子,SDS-PAGE和W estern-b lot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出相对分子质量约为19 000的PoIFN-α特异蛋白,其有效蛋白表达量较高达54.105 mg/L.经Vero-VSV系统测定,PoIFN-α效价达到5.87×107U/L.试验将PoIFN-α成熟肽全基因密码子进行改造,并实现了其在毕赤酵母菌表达系统中的高效分泌表达.(本文来源于《华南农业大学学报》期刊2011年01期）
刘健,陈瑞爱,朱杰仪,唐明森,罗满林[4]（2009）在《猪干扰素-α基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达》一文中研究指出根据毕赤酵母表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪干扰素α(PoIFN-α)基因重新设计改造和重新合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经Zeocin~(TM)抗性筛选后获得大量多拷贝插入的重组子,SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出19KD左右的POIFN-α特异蛋白,表达更容易,其有效蛋白表达量为54.105mg/L,并且经Vero-VSV系统测定,PoINF-α效价达到5.87×10~7 U/L.试验首次将猪干扰素α成熟肽蛋白的全基因密码子进行改造,重新设计实现了在毕赤酵母菌表达系统中的PoIFN-α基因的高效分泌表达。(本文来源于《中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十叁次学术研讨会论文集（下册）》期刊2009-09-01）
栾世家,潘蔚绮,李婷,杨化强,张北武[5]（2009）在《A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱》一文中研究指出根据A型流感病毒密码子使用偏嗜性,选取稀有密码子对A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒NS1基因内部110个氨基酸区域进行密码子同义突变改造,并全基因合成NS基因,利用反向遗传操作技术拯救出含有密码子去优化NS1基因的重组病毒(deoNS)。体外细胞噬斑形成实验和病毒生长曲线证明该病毒在MDCK细胞内的感染和复制能力比野生型病毒低约1000倍;BALB/c小鼠体内致病力实验证明deoNS病毒不能引起小鼠发病和死亡,该病毒在小鼠肺内的复制滴度比野生型病毒低100～1000倍。本研究探索了通过基因组密码子去优化改造途径降低A型流感病毒毒力的可行性,首次证明流感病毒NS1基因密码子去优化同义突变可以降低病毒毒力,为流感减毒活疫苗的研究提供了新的思路。(本文来源于《生物工程学报》期刊2009年05期）
栾世家[6]（2009）在《A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱的研究》一文中研究指出疫苗接种是预防流感最有效的方法,目前投入使用的流感疫苗可分为灭活苗和减毒活苗两大类:灭活苗通过肌肉注射途径免疫,能够诱发机体产生针对血凝素的中和抗体,但无法刺激鼻腔黏膜产生分泌型抗体,也无法诱导产生细胞免疫应答;减毒活苗(冷适应减毒活苗)通过鼻吸入的方式免疫,其免疫的方式更接近自然感染的过程,可充分诱导体液免疫及细胞免疫应答。减毒活苗无论从免疫途径还是免疫效果上都优于传统灭活苗。自反向遗传操作技术建立以来,研究者们尝试过多种方法开发减毒活苗,降低流感病毒毒力,提高其免疫原性,研究出安全有效的减毒活苗已成为新型流感疫苗的发展方向。在本研究中,我们根据A型流感病毒密码子使用偏嗜性的统计规律,在保留NS片段包装信号和不影响NS1/NS2剪切位点的前提下,选取稀有密码子对A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒NS1基因内部110个氨基酸区域进行密码子同义突变改造,将其替换为病毒使用频率最低的密码子,全基因合成NS基因,利用12质粒反向遗传操作技术拯救出含有密码子去优化NS1基因的重组病毒(deoptimized NS, deoNS)。MDCK细胞噬斑形成实验表明,病毒在细胞上的成斑能力大大减弱;病毒在MDCK细胞上的生长曲线表明,其在细胞内的复制能力比野生型病毒低约1000倍。BALB/c小鼠体内致病力实验证明,deoNS病毒不能引起小鼠发病和死亡,感染第3天病毒在小鼠肺内的复制滴度比野生型病毒低100倍,感染第5天其在小鼠肺内的滴度比野生型病毒低1000倍。本研究初步探索了通过基因组密码子去优化改造途径降低A型流感病毒毒力的可行性,首次证明流感病毒NS1基因密码子去优化同义突变可以降低病毒毒力,为流感减毒活疫苗的研究提供了新的思路。(本文来源于《中国科学技术大学》期刊2009-05-12）
王艳君,杨谦[7]（2008）在《一种快速获得基因密码子偏爱性改造的方法——SOE-PCR》一文中研究指出SOE-PCR采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重迭链,在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的拼接,能够高效、快速地实现基因的定点突变。应用SOE-PCR原理成功地实现了对几丁质酶基因chi58的5个位点的突变,构建了几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体—chi58A。实验证明,SOE-PCR具有简捷、快速、高效的优点。扩增过程中未引入其他突变,获得的chi58A突变体基因片段可以用于后续的分子克隆。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2008年08期）
黄明,蒋寅,周飞燕,付灿,雷文瑾[8]（2008）在《改造稀有密码子对rhFGF8a原核表达的影响》一文中研究指出目的:构建重组人成纤维细胞生长因子8a(rhFGF8a)高效表达载体,提高该蛋白的表达量。方法:采用PCR技术设计引物替换rhFGF8a基因N端的稀有密码子以及稀有终止子,构建原核表达载体pET22b-mrhFGF8a,转化大肠杆菌,用异丙基β硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,Sephacryl S-200纯化表达蛋白,MTT法检测其生物学活性。结果:表达产物经SDS-PAGE、Western blot鉴定,目的蛋白量占全菌蛋白的31%,Sephacryl S-200纯化后蛋白纯度可达97.28%,且具促进NIH3T3细胞增殖活性。结论:通过改造稀有密码子的方法有效地提高了真核基因在原核表达体系中的表达量。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2008年06期）
刘礼兵,刘云,何华庆,李永辉,徐琪寿[9]（2006）在《qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达》一文中研究指出奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3kJ/mol降低到最小-80.5kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。(本文来源于《生物工程学报》期刊2006年02期）
张相民,辛伟,王世峰,李仁清,陆柔剑[10]（2005）在《按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究》一文中研究指出为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Westernblot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%。上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。(本文来源于《病毒学报》期刊2005年03期）
密码子改造论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是由假单胞菌属绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的一种细胞毒性外毒素,是绿脓杆菌重要的致病因子。PEA的ADP-核糖基转移酶活性能使靶细胞的延伸因子-2(EF-2)发生核糖基化而失活,导致蛋白质的生物合成受阻,从而对细胞产生毒性作用。利用PEA的这一毒性作用,将其与靶向蛋白(抗体或靶细胞膜受体配基)连接或融合制成的免疫毒素被广泛用于癌症的靶向治疗。PEA除具有上述细胞毒性作用外,还具有较强的免疫原性,它不仅可作为疫苗蛋白,也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体。然而由于天然PEA的细胞毒性较强,不能直接作为疫苗佐剂和载体应用于疫苗的生产,必须通过基因工程方法对其进行基因改造使其毒性降低或完全脱毒才能应用。为提高PEA基因在大肠杆菌中的表达水平和获得脱毒的PEA基因,我们首先利用PCR方法从本实验室构建的含有PEA基因的pcDNA3.1/PEA质粒中扩增PEA基因,然后依据该基因的序列,利用大肠杆菌偏爱的密码子对PEA编码基因进行了全序列优化改造并人工合成,然后利用pET20b(+)质粒分别构建其与His标签融合的野生型和密码子优化型的PEA原核表达载体pET20b-PEAwt/His和pET20b-PEAopt/His。将表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导使其进行分泌表达。采用硫酸镁休克的方法从细菌周质中分离表达的重组PEA蛋白,用Ni-NTA琼脂糖进行纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组PEA蛋白,用考马斯亮蓝显色法检测PEA蛋白的浓度,并比较野生型和密码子优化型PEA的表达水平。然后以构建好的pET20b-PEAopt/His质粒为模板,根据PEA蛋白的结构特点,在PEA蛋白的氨基酸序列中选定若干位点,通过核苷酸介导的定点突变方法对选定位点氨基酸的编码基因进行定点突变,从而得到若干PEA突变体的原核表达载体。将各种突变体表达载体转化大肠杆菌进行表达,用与上述同样的方法分离纯化和鉴定重组PEA蛋白。最后利用小鼠成纤维细胞L929检测不同PEA突变体对细胞的毒性作用,从中筛选出毒性低的PEA突变体。实验结果表明,经过密码子优化,PEA编码基因发生402个碱基的取代,GC含量由原来的69.8%降至52.2%,下降了33.7%。蛋白表达结果显示,密码子优化型PEA的表达量(78.7±2.5 mg/L)明显高于未优化的表达量(39.0±2.0 mg/L)(P<0.01),表达水平提高了近1倍。细胞毒性实验表明,密码子优化的PEA基因制备的重组蛋白对培养的动物细胞L929有明显的毒性作用,说明该蛋白具有天然生物活性。经过定点突变得到的12个PEA基因突变体,经SDS-PAGE检测证实不同PEA突变体基因均能在大肠杆菌中进行分泌表达。表达的PEA重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖纯化,作用于L929细胞显示出不同的细胞毒性,通过比较得出12个低细胞毒性的PEA突变体,并最终从中选取3个毒性较低的突变体用于下一步的研究,从而为PEA蛋白在疫苗佐剂与载体上的研究和应用奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
密码子改造论文参考文献
[1].侯晟琦.pPIC9Kα因子密码子改造对内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中表达的影响[D].四川农业大学.2012
[2].王幸兴.绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造及其特性研究[D].河北农业大学.2011
[3].刘健,陈瑞爱,刘珊珊,朱杰仪,唐明森.猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[J].华南农业大学学报.2011
[4].刘健,陈瑞爱,朱杰仪,唐明森,罗满林.猪干扰素-α基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十叁次学术研讨会论文集（下册）.2009
[5].栾世家,潘蔚绮,李婷,杨化强,张北武.A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱[J].生物工程学报.2009
[6].栾世家.A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱的研究[D].中国科学技术大学.2009
[7].王艳君,杨谦.一种快速获得基因密码子偏爱性改造的方法——SOE-PCR[J].中国生物工程杂志.2008
[8].黄明,蒋寅,周飞燕,付灿,雷文瑾.改造稀有密码子对rhFGF8a原核表达的影响[J].细胞与分子免疫学杂志.2008
[9].刘礼兵,刘云,何华庆,李永辉,徐琪寿.qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达[J].生物工程学报.2006
[10].张相民,辛伟,王世峰,李仁清,陆柔剑.按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1gag基因提高表达水平的研究[J].病毒学报.2005