一、朊病毒的检测方法（论文文献综述）
丁铭宣[1]（2021）在《纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究》文中研究说明研究背景和目的:朊病毒病作为能在人与哺乳动物间传播的感染性神经退行性疾病,其潜伏期很长,且患上朊病毒病的患者无一例外地在发病数月至数年内去世。朊病毒有致命的神经毒性,其机理仍未完全明确地为人们所知,并且因为其疾病过程的快速进展,使得干预及治疗变得特别困难。尽管世界各地的学者都在竭尽所能地进行着相关的基础实验与临床试验,试图找到应对朊病毒的策略,但目前为止依然收效甚微。由于缺乏成熟的针对朊病毒病的有效疗法,甚至没有成功的临床试验,目前对于朊病毒病患者所能给予的干预手段基本以支持性和姑息性治疗为主。故找到对于人类朊病毒有效的药物或防治方法是近年来对于朊病毒方向的研究热点,也是人类探索朊病毒病的最终目的。多项研究报道,CEs在毒株接种前后对于朊病毒感染的动物都具有明显的保护作用,也可在一定程度上治疗受朊病毒感染的细胞,表现出了令人惊喜的防治潜力,但其对朊病毒的作用机制尚不明确。故本研究设计实验,选用在前人的研究中,对于患朊病毒病的动物防治效果较为优秀的一种CE——TC-5RW作为试验药物,在体内及体外,分别研究了TC-5RW对于动物及人类朊病毒的作用,试图进一步探究CEs防治朊病毒病的机制,推动包括TC-5RW在内的CEs作为临床试验新药造福朊病毒病患者的研究进程。研究方法:本研究利用表达仓鼠朊蛋白的转基因小鼠进行动物实验。在感染仓鼠263K朊病毒的当天,向小鼠腹腔内一次性注射TC-5RW进行给药处理,随即对动物生存期及病理征象进行观察、对脑Pr P进行二维蛋白质电泳、以及通过检测其皮肤组织内是否存在朊病毒播种活性,来探究TC-5RW体内注射对动物朊病毒病的作用。其中,对于皮肤组织内可能存在的微量朊病毒的播种活性,是利用s PMCA与RT-Qu IC两种新兴的、灵敏度极高的手段来进行检测的。同时本研究也应用了这两种检测手段,在检测体系中直接加入TC-5RW,通过体外实验探究该药物对感染动物或人类组织中的朊病毒播种活性的影响。此外,本研究为了进一步探究TC-5RW是否对朊病毒PrPSc存在直接作用,将TC-5RW与朊病毒感染的人或动物的脑匀浆共同温育一定时间,随后以蛋白酶K（proteinase K,PK）处理,通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）来观察处理后存在蛋白酶抗性的PrPSc,又称蛋白酶抗性朊蛋白（proteinase K resistant prion protein,Pr Pres）水平变化。本研究通过以上实验方法,探寻TC-5RW在体内及体外对朊病毒播种活性的影响,及该药物直接作用对朊病毒蛋白酶抗性的影响,来分析其防治朊病毒病的可能机制。研究结果:本研究发现,TC-5RW的体内作用可使263K感染的转基因小鼠病症减轻,具体表现为:与对照组相比,治疗组小鼠生存期显着延长,且脑组织神经病理征象不明显。二维蛋白质电泳结果表明,治疗组小鼠与对照组小鼠脑PrP的分子量与电荷均无明显区别,说明该化合物不通过影响朊蛋白翻译后修饰的途径抑制朊病毒形成与累积。在体外实验中,首先以动物源朊病毒作为种子,发现向s PMCA检测体系中加入不同浓度的TC-5RW,可以抑制朊病毒的扩增;向RT-Qu IC体系加入TC-5RW,可延长RT-QuIC荧光值曲线的起峰时间,并使ThT荧光峰值降低,说明该药物的加入降低了重组蛋白被朊病毒种子转化为淀粉样构象的效率,即降低了朊病毒的播种活性。在以上实验中仅2μg/m L的TC-5RW存在就能明显抑制朊病毒的播种活性,且这种作用在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还将TC-5RW与患病动物的脑匀浆直接共温育后以PK处理,发现Pr Pres水平明显降低,这种作用亦在一定程度上与TC-5RW浓度成正比。本研究还发现TC-5RW在体外对包括s CJD MM1、s CJD MV2、s CJD VV2、g CJD E200K、gCJD V180I、FFI在内的多种人类朊病毒亚型都具有相似的作用,可直接降低抗蛋白酶消化的Pr Pres水平,且终浓度为250μg/m L的TC-5RW存在于检测体系内可降低朊病毒播种活性,尤其对gCJD V180I及FFI的作用最为显着,药物浓度50μg/m L时甚至能完全抑制这两种亚型的RT-Qu IC反应。结论:本研究结果表明,TC-5RW不仅能够使朊病毒感染动物的潜伏期延长,病理征象减轻,还可降低其皮肤组织内PrPSc的播种活性。在体外实验中,向PMCA与RT-Qu IC体系中直接加入TC-5RW可以抑制人或动物PrPSc的播种活性。TC-5RW与PrPSc温育后,可促进其转化为容易被PK降解的结构,这可能暗示了其抑制朊病毒的作用机制。
伍晶星[2]（2021）在《藏羚羊和岩羊朊蛋白基因分析及五种动物重组朊蛋白在RT-QuIC中的应用》文中研究说明羊瘙痒病是一种自然发生的传染性海绵状脑病,它可以在绵羊和山羊羊群之中传播,其疾病的易感性、潜伏期和跨物种传播的能力主要受宿主朊蛋白基因（prionprotein gene,Prnp）的影响。目前还没有藏羚羊和岩羊发生羊瘙痒病的报道,研究藏羚羊和岩羊的Prnp序列有助于评估藏羚羊和岩羊对羊瘙痒病的易感性。参照GenBank上已经发表的绵羊Prnp序列设计引物,然后对藏羚羊和岩羊的Prnp序列进行扩增、测序和分析。测序结果显示藏羚羊和岩羊Prnp序列由771个核苷酸构成,编码256个氨基酸。序列分析结果显示21只藏羚羊和4只岩羊PrP（prion protein,PrP）氨基酸序列完全一致,并且与野生型绵羊PrP氨基酸序列具有100%的同源性。此外,藏羚羊和岩羊PrP氨基酸序列与山羊（99.2%）、汤氏瞪羚（99.2%）、马鹿（98%）、牛（97.7%）也具有较高的同源性。在对PrP氨基酸序列136、154、171位多态性分析后发现本次研究的21只藏羚羊和4只岩羊可能和野生型绵羊一样对羊瘙痒病易感。本研究为羊瘙痒病在藏羚羊羊群中可能出现的风险提供了理论依据,提示要加强藏羚羊和岩羊羊群中羊瘙痒病的监测。实时震动诱导转化（real-time quaking-induced conversion,RT-QuIC）是一种体外模拟PrPc错误折叠的扩增技术,它可以实时监测生成的淀粉样纤维含量,其诊断性能需要种子和底物的适当组合,目前国际上普遍使用原核表达的仓鼠朊蛋白作为底物。本研究采用pRSETA质粒构建岩羊、沙狐、高原鼠兔、喜马拉雅旱獭的全长朊蛋白表达质粒,将其转化到BL21（DE3）pLysS感受态细胞中诱导表达,并使用Akata仪器纯化。将这些纯化出来的重组朊蛋白作为RT-QuIC的底物,与国际上常用的仓鼠重组朊蛋白比较,分析发现这些重组朊蛋白在常见朊病毒毒株263K、139A、ME7和S15诱导下纤维形成的差异。在我们RT-QuIC的实验条件下,鼠兔重组朊蛋白对263K、139A、ME7和S15毒株的检测极限为10-7稀释度,这一点和仓鼠重组朊蛋白是一致的。岩羊重组朊蛋白对263K的检测极限为10-7稀释度,对139A、ME7和S15的检测极限为10-5稀释度。在这三种朊蛋白中,鼠兔重组朊蛋白的出现阳性反应的时间早于岩羊和仓鼠重组朊蛋白,提示鼠兔重组朊蛋白具有成为下一个RT-QuIC优良检测底物的能力。尽管沙狐和旱獭重组朊蛋白出现了阳性反应,但是由于其明显的自折叠现象,导致阴性和空白对照出现了假阳性反应,提示沙狐和旱獭重组朊蛋白不适合作为RT-QuIC的底物。这项研究为RT-QuIC反应探索了更多的检测底物,为后续不同朊病毒毒株的检测提供了更多的底物选择。
张微观刘[3]（2021）在《RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究》文中指出朊蛋白病是一种可以感染人类和动物的具有传染性的致死性中枢神经系统退行性疾病。该病诊断困难,确诊主要依靠脑组织PrPSc检测。临床上脑活检的创伤性大,且风险高,不易被患者接受,所以对该病的脑组织取样大多只能在患者死后实施。相比较于其它国家,由于文化差异,我国尸检难于实施。VPSPr是一种新型人朊蛋白病,发病机制尚不明确,人们对它的认识并不多。而动物的朊蛋白病CWD传染性高,可以对农业和环境造成巨大的危害。因此对各种朊蛋白病的进一步认识和寻找一种可以替代脑组织PrPSc检测的可靠样本和检测手段非常重要。已有学者通过动物实验证实了皮肤中含有感染性的PrPSc,并且能够用RT-QuIC技术对皮肤中的PrPSc播种活性进行检测。目的:进一步认识VPSPr和CWD朊蛋白的特性,验证皮肤PrPSc作为朊蛋白病早期诊断生物标志物的可靠性,以及RT-QuIC技术对不同朊蛋白病PrPSc检测鉴定的有效性。方法:（1）建立RT-QuIC技术的检测方法,确定最佳反应条件;（2）通过蛋白质免疫凝胶电泳（WB）、二维蛋白质免疫凝胶电泳（2D）等技术对VPSPr和CWD白尾鹿的脑组织致病朊蛋白进行检测,分析它们的朊蛋白电泳图谱和特性;（3）采用RT-QuIC技术分别检测VPSPr和CWD鹿的脑组织中PrPSc的播种活性,并与sCJD患者脑组织PrPSc的播种活性进行对比;（4）采用双盲法,使用RT-QuIC技术对161例sCJD（几乎包含所有亚型）患者和非CJD患者皮肤朊蛋白进行检测,分析该方法检测皮肤样本的特异性和敏感性。结果:（1）VPSPr特殊的阶梯状电泳图谱的产生依赖于PK消化的浓度和碱性p H,它的PrPres条带只能由特定抗体检测出来;而VPSPr-7条带对PrP抗体1E4的亲和力更好;（2）与sCJD的PrP相比,VPSPrPrP中分子量更小的聚糖可能有较小的N端或C端短截体,并且形成了一个比全长（FL）-PrP迁移稍快的PrP条带;（3）通过RT-QuIC检测,sCJDMV2组每毫克组织的log SD50为>8.6,GSSP102L组为>7.7,VPSPr129VV组为>7.1,VPSPr129MM组为7.0,VPSPr129MV组为6.1,fCJDV180I组为>5.7,说明与sCJD和GSS相比,VPSPr脑组织中PrPSc的播散活性较低;（4）不同CWD白尾鹿的脑匀浆电泳谱不完全一致,至少有2种形态;（5）与sCJD相比,CWD白尾鹿脑组织中的PrPSc的播散活性较低,不过在10-6稀释度还是可以检测到该样本的播散活性。（6）RT-QuIC检测161例sCJD（几乎包含所有亚型）患者和非CJD患者皮肤朊蛋白的灵敏度为88.8%,特异性为100%。结论:（1）VPSPr的糖基化改变可能与其发病相关;该病PrPres的免疫印迹检测具有抗体、PK浓度和碱性pH依赖性;（2）不同底物对于VPSPr三种基因型PrPSc的RT-QuIC检测影响不大,RT-QuIC技术可以作为该病PrPSc检测的一种可靠诊断方法;（3）不同CWD白尾鹿脑组织中的PrPSc可能具有不同的菌株,它们免疫印迹图谱不具有特异性;RT-QuIC技术可以作为CWD筛查和低PrPSc样本检测的可靠手段;（4）皮肤PrPSc可以作为朊蛋白病诊断的可靠生物标志物;（5）RT-QuIC技术有望应用于各类朊蛋白疾病的诊断研究中。
夏影[4]（2021）在《朊病毒感染中巨噬细胞集落刺激因子及其受体变化特征研究》文中指出朊病毒病（Prion diseases）是由朊病毒引起的一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的神经退行性疾病,典型病理特征主要包括神经元丢失、小胶质细胞和星形胶质细胞增生。在朊病毒感染过程中,小胶质细胞的激活通常会导致多种细胞因子的分泌增加。研究表明,巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）与一些神经退行性疾病相关,并且M-CSF在朊病毒病感染的动物模型中后期表达升高,但M-CSF变化与Pr P的相关性仍不清楚。为了评估朊病毒感染后M-CSF的表达情况,我们利用Western blot方法分析朊病毒感染的啮齿类动物脑组织中M-CSF的水平变化,与对照组相比,朊病毒感染的啮齿类动物脑组织中M-CSF表达水平升高。将朊病毒感染的SMB细胞系进行M-CSF特异性Western blot检测,发现在SMB-S15细胞中M-CSF表达水平升高。我们利用Western blot方法分析M-CSF在朊病毒感染细胞的各亚细胞组分的分布情况,结果显示M-CSF主要分布在细胞质和细胞膜组分中,与SMB-PS细胞相比,M-CSF在SMB-S15细胞的细胞质和细胞膜组分中略有升高。我们利用免疫细胞荧光和RT-PCR方法检测SMB细胞,探究M-CSF的受体CSF1R的变化情况,结果显示在细胞中CSF1R转录及翻译水平均升高。利用ELISA检测朊病毒感染小鼠脑组织中CSF1R的变化情况,结果表明朊病毒感染后脑组织CSF1R表达水平升高。利用免疫共沉淀分析朊病毒感染终末期的仓鼠脑匀浆,发现在朊病毒感染的终末期仓鼠脑组织中M-CSF与Pr P存在相互作用。并且在SMB细胞中检测到M-CSF与Pr P存在相互作用。将朊病毒感染的小鼠脑组织连续切片进行免疫组织化学分析,在多个脑区均观察到M-CSF与Pr PSc的共定位。通过免疫荧光发现,在仓鼠脑组织中M-CSF与Pr P共定位。形态学分析显示,M-CSF信号主要与神经元、小胶质细胞共定位,与星形胶质细胞不存在共定位。通过形态学分析,CSF1R主要分布在神经元中,而非小胶质细胞与星形胶质细胞。进一步,利用免疫组织荧光和免疫组织化学检测表明正常对照小鼠中IL-34主要分布在神经元,朊病毒感染后主要分布在星形胶质细胞和小胶质细胞中。本研究利用朊病毒感染的啮齿类动物模型和朊病毒感染细胞模型,通过多种实验方法,探究朊病毒感染后M-CSF及其受体CSF1R含量变化、分布定位情况及其与朊病毒的相关性,并阐释IL-34在朊病毒感染后脑组织分布情况。证明了M-CSF与Pr P存在相互作用,并且可能与Pr PSc结合能力更强;推测M-CSF可能由小胶质细胞分泌作用于表达其受体CSF1R的神经元,Pr PSc可能会影响M-CSF与CSF1R结合进而影响其下游功能;朊病毒感染后IL-34与CSF1R结合能力下降并作用于星形胶质细胞和小胶质细胞上的其它受体。这些结果有助于解释M-CSF/CSF1R在朊病毒病中的具体分子机制,并为了解朊病毒病的作用机制提供理论基础。
朱峰,谭家亮,吴江,杨茹,毕昊,夏剑波[5]（2021）在《重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定》文中研究表明目的利用基因克隆技术制备重组G5P蛋白,并鉴定其结合朊病毒(PrPSc)的能力。方法化学合成G5P全长基因核苷酸片段,将其插入原核表达载体pET-28a-c（+）质粒中,获得pET-28a-c（+）-G5P重组质粒。将其转化到E.coli BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达,经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化重组G5P蛋白。制备重组G5P蛋白偶联磁珠,将其与含有或不含有PrPSc的人脑匀浆液混合,进行PrPSc的捕获实验。利用Western blot检测技术鉴定重组G5P蛋白与PrPSc结合的特异性与结合力。结果成功获得纯化的重组G5P蛋白,捕获实验显示重组G5P蛋白偶联磁珠仅从散发性克雅氏病（sCJD）患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白,而从非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后仍能检出Western blot条带,证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为PrPSc而非正常朊蛋白。将sCJD患者的脑匀浆液稀释10000倍后重组G5P蛋白仍可捕获到PrPSc。结论该研究利用基因克隆技术成功获得了纯化的重组G5P蛋白。该蛋白具有特异性结合PrPSc的能力,并具有较高亲和力。这为下一步研发新型朊病毒检测技术和滤除技术打下基础。
夏影,郑小亮,张爽,吴海燕,马权,陆鹏,陈嘉,胡超,陈操,陈志宝[6]（2020）在《朊病毒感染与VCP关系初探》文中提出为了探究感染朊病毒后含缬酪肽蛋白（valosin-containing protein,VCP）的变化情况及其对内质网相关蛋白降解（endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD）信号通路的影响,试验采用细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR等方法分析朊病毒感染的细胞系中VCP及其基因表达情况;Western-blot方法检测朊病毒感染的细胞、小鼠脑组织中VCP含量变化,白藜芦醇动态清除朊蛋白（prion protein,PrP）的SMB-S15细胞、PrP重组质粒pcDNA3.1（+）-Cyto-PrP瞬时转染的293T细胞、蛋白酶体抑制剂MG-132处理的SMB-S15细胞中VCP的表达情况,以及朊病毒感染的细胞系中ERAD信号通路关键因子的表达水平。结果表明:与对照组相比,在朊病毒感染的细胞中VCP及基因表达水平差异不显着（P>0.05）;在终末期小鼠脑组织中VCP表达水平差异不显着（P>0.05）;经动态清除PrP、细胞内聚集PrP以及MG-132处理后,VCP表达水平均差异不显着（P>0.05）;在朊病毒感染细胞中ERAD信号通路关键因子calnexin表达水平极显着升高（P<0.01）,OS-9表达水平显着高于对照SMB-PS细胞（P<0.05）。说明感染朊病毒后VCP变化不显着,calnexin和OS-9发生明显变化,提示ERAD信号通路可能会参与朊病毒的复制过程。
杨雪花[7]（2020）在《朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析》文中认为朊病毒病的确诊取决于对患病个体脑组织中PrPSc含量及其特殊病理变化的检测,因此特异性抗体对朊病毒病的诊断至关重要。本研究采用人源重组PrP蛋白23-231免疫Prnp基因敲除小鼠,ELISA测定血清效价为1:20480,收集小鼠血清制备PrP多克隆抗体（pAb P54）。通过蛋白PrP特异性Western blot、免疫组织化学和细胞免疫荧光实验评价制备抗体的特异性。Western blot结果显示pAb P54抗体可与重组PrP蛋白、正常啮齿动物和人脑组织中PrPC以及羊瘙痒因子感染的小鼠、仓鼠和不同类型的人朊病毒病脑组织中的PrPSc反应,且制备的抗体对脑组织中PrPC和PrPSc识别的条带特征与商品化PrP单克隆抗体（6D11及3F4）的几乎相同,三种糖基化形式清晰可见。免疫组织化学分析结果显示制备的抗体能够特异地识别羊瘙痒因子139A感染的小鼠和263K感染的仓鼠脑组织切片中的异常沉积的朊蛋白。免疫荧光实验结果显示pAb P54抗体可识别细胞核周围的PrP蛋白（绿色荧光）。上述结果证明制备的pAb P54多克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,可用于人和啮齿动物朊蛋白的识别,并且适用于多种检测方法,在朊蛋白生物学研究以及人和啮齿动物脑组织朊病毒的检测具有较好的应用前景。朊蛋白由机体PRNP基因所编码,该蛋白在不同哺乳动物间相对保守,其氨基酸序列与朊病毒病的易感性有关。沙狐为犬科狐属的动物,主要栖息于干草原、荒漠和半荒漠地带,广泛分布于中亚和我国西部的多个地区,通常以啮齿类动物和鸟类为其主要的食物来源,同时也被多种食肉类动物捕食。高原鼠兔则为鼠兔科鼠兔属的动物,是青藏高原特有物种和关键物种,也是草原上大多数中小型肉食动物和几乎所有猛禽的主要捕食对象。在本研究中,我们首次克隆并测序了青藏高原沙狐及高原鼠兔的全长Prnp基因,利用软件对序列分析得出相应的氨基酸序列并对其进行比较。其中沙狐的Prnp基因编码区共774bp,对应编码257个氨基酸的朊蛋白;高原鼠兔Prnp编码区共包含759bp,对应编码252个氨基酸的朊蛋白。根据这两物种的Prnp序列,深度比对分析这两种动物与其他动物物种的亲缘关系,其中沙狐与其它三种同属狐类的序列相似度为100%;高原鼠兔与同属动物北美鼠兔的氨基酸序列仅有一个氨基酸位点不同;与其它多个物种（主要包括人、犬、牛、鹿、羊、骆驼、猫、小鼠和仓鼠等）的序列相似性也进行比对分析。本研究首次获得了沙狐及高原鼠兔Prnp序列并上传Pubmed数据库,同时作为青藏高原食物链循环的中间环节,对它们的Prnp基因序列及蛋白的测定、分析将有助于判定在特定地区不同物种间朊病毒传播的潜力。
高利萍[8]（2020）在《E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究》文中研究表明朊病毒病,又称可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies,TSE）,它是一种罕见的、能够引起人类及多种动物脑组织海绵状病理改变的退行性疾病,潜伏期长,致死率为100%,可在同种动物之间进行传播。朊病毒病典型的神经病理学改变为脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和胶质细胞增生。其致病机制目前认为是由于机体正常的富含α螺旋的朊蛋白PrPC发生错误折叠形成了富含β折叠的PrPSc。自1730年首次报道羊瘙痒病以来,人及20多种动物均可患朊病毒病,其中人朊病毒病包括克-雅病、致死性家族型失眠症、库鲁病、吉斯特曼-施特劳斯综合征,动物朊病毒病最常见的为羊瘙痒病、牛的海绵状脑病。克-雅病依据其发病机理可分为散发型、家族型、医源型与变异型。本研究分两部分,第一部分为我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析,主要针对我国30例E200K突变遗传型朊病毒病患者的遗传、家族、临床及实验室特征进行了分析。第二部分为Pinkl-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中的研究,我们以感染朊病毒的细胞模型和动物模型脑组织样本为研究对象,在体外、体内两个层面证明,朊病毒感染可活化线粒体自噬系统。第一部分:我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析E200K突变的遗传型克-雅病（gCJD）是世界范围内常见的突变类型之一。在本研究中,系统分析了我国30例E200K患者的流行病学、临床、实验室和遗传特征。这些患者来自12个不同的省份,大部分在我国北方。发病年龄范围为42-71岁,平均发病年龄为57岁。为了探究CYP4X1基因rs9793471多态性是否与遗传型克-雅病E200K的发病年龄有关,我们通过目的基因获得及序列测定发现,仅有1例患者CYP4X1基因rs9793471基因型为GA,其余为AA。本研究收集的病例患者男女比为11:19,病程为从2个月到26个月不等,平均为9个月。脑脊液（CSF）14-3-3阳性率为74%（20/27）,且在40-49岁及60-69岁人群中比率较高。头颅核磁共振（MRI）异常的比率为86.7%（26/30）,其中脑脊液14-3-3蛋白阳性病例中MRI异常率高达94%（17/18）。脑电图周期性三相波的比率为50%（13/26）。129位均为MM,219位为EE。我们对来自其中三个有家族史的21名家属进行了PRNP基因测序,结果显示16名为E200K携带者。以上研究表明,E200K在中国的遗传型克-雅病病例中具有相对较高的频率,并且其与散发型克-雅病有着相近的临床表现。本研究是目前国内最大规模的E200K遗传型克-雅病研究,将有助于人们对朊病毒病的全面、深入理解。第二部分:Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中的研究线粒体自噬是清除细胞内受损线粒体的重要过程,线粒体的功能障碍与越来越多的神经退行性疾病直接相关。然而,朊病毒病中线粒体自噬仍然需要深入探索。在本研究中,我们通过透射电镜发现,在朊病毒感染的细胞系SMB-S15中有更多的自噬体、肿胀且嵴断裂的线粒体以及自噬体包裹的受损线粒体结构,同时发现了激活的自噬流的分子证据即p62表达量降低、LC3β Ⅱ表达量升高。Western blots结果显示,线粒体膜蛋白TIMM44、TOMM20和TIMM23水平降低,且LC3β与线粒体存在共定位,这说明朊病毒感染的SMB-S15细胞中线粒体自噬被激活。另外,Pinkl和Parkin表达水平升高,尤其是在线粒体组分;在SMB-S15细胞中,多聚泛素化蛋白的表达量降低,而磷酸化的多聚泛素化蛋白表达量升高,这表明Pink1被激活;SMB-S15细胞中MFN2表达水平下降,而其泛素化形式表达上调,这表明Parkin被激活。以上结果说明,Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬在朊病毒感染过程中发挥了重要作用。通过SiRNA干扰实验分别敲降SMB-S15细胞中Pink1和Parkin的表达,可降低自噬活性,但似乎不影响TOMM20和TIMM23的表达。此外,我们还通过Western blot和免疫组化实验检测发现,感染羊瘙痒因子小鼠适应株139A和ME7的小鼠脑组织中Pink1和Parkin水平在疾病终末期显着升高。免疫荧光分析显示感染羊瘙痒因子的小鼠脑组织中,Pink1信号与GFAP、Iba1和NeuN阳性细胞存在共定位。IHC检测了感染了 139A和ME7的脑组织的连续切片,发现更多的Pink1和Parkin阳性细胞位于PrPSc沉积较多的区域。这些结果表明,在朊病毒感染的细胞和朊病毒感染的实验小鼠模型中,通过增强的Pink1-Parkin通路激活了线粒体自噬,这也可能是导致神经元细胞坏死的原因之一。
陈嘉[9]（2020）在《朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探》文中研究表明朊病毒感染后可观察到中枢神经系统炎症细胞的活化和多种细胞因子的含量升高,但一些低丰度和不常见的细胞因子却鲜有报道。为了评估朊病毒感染过程中罕见细胞因子的潜在变化,我们利用Luminex方法分析筛选了感染不同羊瘙痒因子的小鼠脑组织17种细胞因子的含量。结果发现干扰素诱导的蛋白10（IP10）、角质形成细胞趋化因子（KC）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在朊病毒感染小鼠脑组织中含量上调,随后利用三种细胞因子的商品化ELISA试剂盒和特异性免疫组织化学方法进行了验证。通过特异性荧光定量PCR方法检测IP10、M-CSF和KC,发现三种细胞因子在朊病毒感染小鼠终末期脑组织中的转录水平异常升高,应用数字PCR技术确认了IP10在多种羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中转录水平上调。对朊病毒感染后不同时间点采集的脑组织进行动态分析发现,三种细胞因子的含量随病程呈时间依赖性增加,在感染终末期动物脑组织中IP10含量的增加尤为明显。此外,研究发现45例散发型克-雅病患者脑脊液中IP10的含量虽然组内差异较大,但整体明显高于非朊病毒病患者。为揭示IP10与朊病毒病之间的关系及其在中枢神经系统的分布规律,我们利用IP10特异性免疫组织荧光方法对羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠终末期的脑组织切片进行比较分析,发现在朊病毒感染的皮层、海马和丘脑中,IP10与神经元和小胶质细胞的标志物存在共定位,而与星形胶质细胞的标志物不存在共定位;利用CXCR3特异性免疫蛋白印迹、细胞免疫荧光、RT-PCR方法,证实IP10的主要受体CXCR3在朊病毒感染小鼠终末期脑组织中蛋白及转录水平异常升高;特异性免疫组织化学研究发现CXCR3主要分布于朊病毒感染的海马、皮层、丘脑及小脑等四个脑区的细胞浆中,尤其在丘脑分布更为明显,且CXCR3的颗粒样沉积会出现在脑组织空泡的周围;特别是对朊病毒感染小鼠脑组织连续切片进行IP10、CXCR3与PrPSc特异性免疫组织化学分析,结果发现在朊病毒感染海马、皮层、丘脑及小脑四个脑区的相同位置均可观察到PrPSc、IP10、CXCR3三者共同的阳性信号,提示CXCR3-IP10与PrPSc斑块形成具有明显关联性。在本研究中首次发现了M-CSF作为重要细胞因子在朊病毒感染中枢神经系统的显着变化,丰富了IP10和KC在朊病毒感染中枢神经系统中含量变化特征,同时初步探究了CXCR3-IP10与朊病毒感染的相关性,进一步明确CXCR3-IP10与朊病毒病理形成的因果关系,为丰富朊病毒病致病机制提供可信证据。
张祥毅[10]（2020）在《朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系》文中提出正常构象朊蛋白（PrPC）错误折叠后成为朊病毒(PrPSc),这个构象转变过程被认为是朊病毒疾病最基本的致病因素,但其潜在的分子机制至今仍不清楚。PrPC是一种利用C端磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol anchor,GPI anchor）锚定于神经细胞膜“脂筏”区（Lipid raft）,并广泛表达的糖蛋白。已知PrPC与细胞膜脂质体有相互作用,该作用能改变PrPC结构的稳定性。近期研究表明,朊蛋白近N端阳性电荷区（23-28氨基酸位点,CC1）可以促进朊病毒疾病的发展;而以不同株系的野生型朊病毒感染八肽重复区（51-90氨基酸位点,OR）敲除的转基因鼠,会造成宿主两极化的朊病毒疾病发病进程,例如RML-prion会促进敲除鼠的疾病进程,而BSE-prion则延缓疾病进程;因此本文将从上述的两个蛋白质区域着手,探讨朊蛋白N端与脂质体的相互作用对构象转变的影响,以及对朊病毒疾病发生发展的影响。为了探索CC1区在朊蛋白构象转变过程中所起的作用,我们首先制备两种CC1区的重组朊蛋白（recombinant PrPC,rec PrPC）,其中之一是移除该区域氨基酸序列上全部正电荷的Met4-1突变体,另一种则是删除该区域全部氨基酸序列的ΔN6突变体。通过不同的体外生物实验测定,我们发现相较于WT的构象转变能力,Met4-1及ΔN6这两种突变体的转变能力下降,但均能形成蛋白酶K（PK）抗性构象（r PrP-res）,且所有rec PrPSc对野生型小鼠C57BL/6j均具有致病性,造成100%小鼠死亡率;但相较于WT-rec PrPSc诱导的致病小鼠,ΔN6-rec PrPSc显着地延长了小鼠生存期,而Met4-1-rec PrPSc却显着地缩短了生存期,这种不一致的现象很可能是因为三种rec PrPSc各自有不同的构象,从而导致不同的传播与神经毒性模式。其次,我们藉由分析在rec PrPC构象转变过程中CC1区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,证明了CC1区主要通过增强静电作用力与POPG相互作用,促进PrP构象转变;因此CC1区在疾病中可能扮演促进PrP构象转变,加重神经病理损伤的角色。为了进一步了解OR区在朊蛋白构象转变过程中所起作用,我们制备了OR区氨基酸序列全删除的重组朊蛋白ΔOR突变体。通过一轮sPMCA体外扩增,WT-和ΔOR-rec PrPC均能被诱导为具PK抗性的r PrP-res,相较于WT的构象转变能力,ΔOR的转变能力显着上升。其次,我们利用CRISPR-Cas9技术构建的Prnp-ΔOR+/-小鼠自交后代进行朊病毒疾病造模后,发现随着小鼠PrPC-ΔOR表达量逐渐递增（WT<Heter<ΔOR）,其朊病毒疾病模型小鼠的生存期越长,脑组织中PrPSc沉积越少以及神经损伤越轻。接着我们分析在rec PrPC构象转变过程中OR区与阴离子脂质体（POPG）的相互作用,发现OR区主要通过减弱疏水作用力与POPG相互作用,阻碍PrP构象转变;藉此产生构象转变效率下降但却有更强神经毒性的PrPSc。本研究的实验结果阐明了CC1区和OR区在PrPC转变为PrPSc中扮演了不同的角色,也为朊病毒致病进程的分子机制提供了崭新的思路。
二、朊病毒的检测方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、朊病毒的检测方法（论文提纲范文）
（1）纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 朊蛋白、朊病毒与朊病毒病 |
| 1.2 朊病毒的检测 |
| 1.2.1 传统检测手段及临床诊断标准 |
| 1.2.2 新兴的检测技术 |
| 1.3 朊病毒病的治疗方法与进展 |
| 1.3.1 临床治疗手段及探索 |
| 1.3.2 针对朊病毒防治的科研进展 |
| 1.3.3 纤维素醚及其在朊病毒治疗中的应用前景 |
| 第2章 材料、仪器与试剂的配制 |
| 2.1 材料、试剂与抗体 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 脑匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.2 皮肤匀浆裂解缓冲液 |
| 2.3.3 TC-5RW生理盐水溶液 |
| 2.3.4 TC-5RW水溶液 |
| 2.3.5 肌氨酸溶液 |
| 2.3.6 PK溶液 |
| 2.3.7 PMSF溶液 |
| 2.3.8 LB液体培养基 |
| 2.3.9 0.1×BBMM |
| 2.3.10 8M盐酸胍 |
| 2.3.11 0.2M磷酸氢二钠溶液 |
| 2.3.12 0.2M磷酸二氢钠溶液 |
| 2.3.13 变性缓冲液 |
| 2.3.14 复性缓冲液 |
| 2.3.15 洗脱缓冲液 |
| 2.3.16 透析液 |
| 2.3.17 0.1 M磷酸钠缓冲液 |
| 2.3.18 PMCA转换缓冲液 |
| 2.3.19 Western blot电泳缓冲液 |
| 2.3.20 Western blot转膜缓冲液 |
| 2.3.21 Western blot洗膜缓冲液TBST |
| 2.3.22 Western blot封闭牛奶缓冲液 |
| 2.3.23 Western blot上样缓冲液 |
| 2.3.24 2D脱水缓冲液 |
| 2.3.25 2D再水化缓冲液 |
| 2.3.26 2D平衡缓冲液A |
| 2.3.27 2D平衡缓冲液B |
| 2.3.28 10mM ThT溶液 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 研究路线 |
| 3.2 实验伦理与安全 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.4 大脑与皮肤样本的制备 |
| 3.5 组织病理实验方法 |
| 3.5.1 组织的石蜡包埋与切片 |
| 3.5.2 Pet blot染色流程 |
| 3.5.3 H&E染色流程 |
| 3.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.6.1 表达仓鼠重组蛋白细菌的培养与表达 |
| 3.6.2 包涵体的制备 |
| 3.6.3 蛋白纯化 |
| 3.6.4 蛋白分装 |
| 3.7 RT-QUIC流程 |
| 3.7.1 样本稀释 |
| 3.7.2 制备反应体系 |
| 3.7.3 上样 |
| 3.7.4 开始及结束程序 |
| 3.8 SPMCA流程 |
| 3.9 TC-5RW与脑匀浆共温育实验 |
| 3.10 二维蛋白质印迹 |
| 3.11 蛋白质印迹 |
| 3.12 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 纤维素醚TC-5RW体内注射对朊病毒感染转基因小鼠的作用 |
| 4.1.1 TC-5RW治疗使朊病毒感染小鼠症状减轻 |
| 4.1.1.1 TC-5RW治疗组小鼠生存期明显延长 |
| 4.1.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrPSc沉积和海绵状变性减轻 |
| 4.1.2 TC-5RW治疗组小鼠脑内PrP的 2D结构无明显变化 |
| 4.1.3 TC-5RW治疗组小鼠皮肤组织中无法检测到朊病毒播种活性 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 纤维素醚TC-5RW在体外对动物朊病毒的作用研究 |
| 4.2.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制患病仓鼠脑PrPSc的播种活性 |
| 4.2.2 TC-5RW加入RT-QuIC体系影响了动物脑与皮肤PrPSc的播种活性 |
| 4.2.3 TC-5RW在体外与动物朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3 纤维素醚TC-5RW在体外对不同亚型人类朊病毒的作用研究 |
| 4.3.1 TC-5RW加入PMCA体系抑制人类PrPSc的播种活性 |
| 4.3.2 TC-5RW在体外与人类朊病毒共同孵育可促进其被蛋白酶降解 |
| 4.3.3 TC-5RW加入RT-QuIC体系抑制各种人类朊病毒病PrPSc的扩增 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）藏羚羊和岩羊朊蛋白基因分析及五种动物重组朊蛋白在RT-QuIC中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 朊病毒病 |
| 1.2 朊蛋白与朊病毒 |
| 1.3 Prnp对朊病毒病易感性的影响 |
| 1.4 朊病毒传播的物种屏障 |
| 1.5 藏羚羊、岩羊、沙狐、高原鼠兔、喜马拉雅旱獭简介 |
| 1.6 蛋白扩增技术 |
| 1.7 目的和意义 |
| 2 实验仪器和材料 |
| 2.1 主要仪器及设备 |
| 2.2 主要试剂及耗材 |
| 2.3 常用试剂的配制 |
| 2.4 样本 |
| 2.5 其它实验材料 |
| 2.6 用到的实验数据 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 藏羚羊、岩羊、鼠兔、旱獭的基因组DNA提取 |
| 3.2 藏羚羊和岩羊Prnp序列的扩增 |
| 3.3 藏羚羊和岩羊Prnp序列比对和分析 |
| 3.4 蛋白的表达和纯化 |
| 3.4.1 岩羊、鼠兔、旱獭全长朊蛋白片段的扩增 |
| 3.4.2 岩羊、鼠兔全长朊蛋白扩增片段的纯化 |
| 3.4.3 岩羊、鼠兔全长朊蛋白片段和pRSETA空载体的酶切 |
| 3.4.4 酶切产物的纯化 |
| 3.4.5 岩羊、鼠兔全长朊蛋白片段与pRSETA空载体的连接 |
| 3.4.6 旱獭全长朊蛋白片段与pRSETA空载体的重组反应 |
| 3.4.7 将构建好的质粒转化到DH5 α感受态细胞中 |
| 3.4.8 菌落PCR鉴定阳性克隆并测序 |
| 3.4.9 提取质粒 |
| 3.4.10 转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中 |
| 3.4.11 小批量诱导表达 |
| 3.4.12 诱导表达蛋白的考马斯亮蓝染色验证 |
| 3.4.13 大量诱导表达 |
| 3.4.14 包涵体提取 |
| 3.4.15 朊蛋白纯化 |
| 3.4.16 镊柱的回收 |
| 3.4.17 使用考马斯亮蓝染色和Western Blot验证收集到的蛋白 |
| 3.5 RT-QuIC反应 |
| 3.5.1 种子稀释 |
| 3.5.2 底物体系配制 |
| 3.5.3 上样 |
| 3.5.4 RT-QuIC运行参数设置 |
| 3.5.5 RT-QuIC数据分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 藏羚羊和岩羊Prnp序列测定和分析结果 |
| 4.1.1 PCR和测序结果 |
| 4.1.2 藏羚羊和岩羊Prnp序列及同源性比对结果 |
| 4.1.3 PrP氨基酸序列比对结果 |
| 4.1.4 PrP氨基酸序列同源性比较 |
| 4.1.5 PrP氨基酸序列系统发育树 |
| 4.2 朊蛋白的原核表达与纯化结果 |
| 4.2.1 岩羊、鼠兔、旱獭全长朊蛋白片段扩增结果 |
| 4.2.2 岩羊、鼠兔全长朊蛋白片段和pRSETA质粒酶切结果 |
| 4.2.3 连接结果 |
| 4.2.4 岩羊、沙狐、鼠兔、旱獭全长朊蛋白小批量诱导结果 |
| 4.2.5 四种重组朊蛋白考马斯亮蓝染色结果 |
| 4.2.6 四种重组朊蛋白Western Blot验证结果 |
| 4.3 RT-QuIC结果 |
| 4.3.1 羊瘙痒因子仓鼠适应株263K |
| 4.3.2 羊瘙痒因子小鼠适应株139A |
| 4.3.3 羊瘙痒因子小鼠适应株ME7 |
| 4.3.4 羊瘙痒因子小鼠适应株S15 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 不同种属间prion蛋白特征 |
| 参考文献 |
（3）RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 错误折叠朊蛋白PrP~(Sc)的形成 |
| 1.2 致病性朊蛋白与朊蛋白病发病机制的相关研究 |
| 1.3 变异蛋白酶敏感性朊蛋白病和慢性消耗性疾病的概述 |
| 1.4 朊蛋白病的常规检测方法 |
| 1.5 实时震荡诱导转化技术对皮肤朊蛋白的检测 |
| 第2章 实时震荡诱导转化(RT-QuIC)技术的优化 |
| 2.1 PrP~C反应底物的选择 |
| 2.2 反应体系的配置 |
| 2.3 对照组的设立 |
| 2.4 确定PrP~(Sc)种子的稀释度 |
| 2.5 机器运行条件 |
| 2.6 结果判读 |
| 2.7 统计学分析 |
| 第3章 新型朊蛋白病VPSPr的脑组织PrP~(Sc)的检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pH值和PK浓度对VPSPr阶梯状PrP~(res)电泳图谱产生的影响 |
| 3.3.2 用不同抗体的蛋白质印迹(WB)探究PK处理对VPSPrPrP~(res)片段形成产生的影响 |
| 3.3.3 VPSPr的二维蛋白质免疫印迹电泳检测及图谱分析 |
| 3.3.4 VPSPr和sCJD糖型的蛋白质免疫印迹对比 |
| 3.3.5 错误折叠蛋白循环扩增(PMCA)技术检测VPSPr脑组织中的PrP~(Sc) |
| 3.3.6 用RT-QuIC技术比较VPSPr与其他朊蛋白疾病的脑PrP~(Sc)的播散活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 慢性消耗性病(CWD)白尾鹿脑组织的PrP~(Sc)检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CWD鹿脑组织PrP~(Sc)的检测 |
| 4.3.2 CWD与正常鹿脑组织的蔗糖梯度沉淀分析 |
| 4.3.3 二维蛋白质免疫凝胶印迹法(2D)对CWD鹿脑组织进行分析 |
| 4.3.4 使用RT-QuIC技术测定不同CWD脑组织的PrP~(Sc) |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 实时震荡诱导转化技术对大样本病人皮肤朊蛋白的检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 患者尸检或活检皮肤的收集 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 主要创新与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）朊病毒感染中巨噬细胞集落刺激因子及其受体变化特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 朊病毒病概述 |
| 1.1.1 朊病毒病 |
| 1.1.2 朊病毒病诊断 |
| 1.2 朊病毒 |
| 1.2.1 朊病毒学说 |
| 1.2.2 细胞型朊蛋白——PrP~C |
| 1.2.3 PrP~(Sc)的形成 |
| 1.2.4 PrP~(Sc)的检测 |
| 1.2.5 朊病毒与免疫反应 |
| 1.3 M-CSF及其受体 |
| 1.3.1 M-CSF基因与亚型 |
| 1.3.2 M-CSF与疾病关系概述 |
| 1.3.3 M-CSF受体概述 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.1.1 朊病毒毒株、细胞和动物模型 |
| 2.1.2 仪器及设备 |
| 2.1.3 细胞培养相关试剂耗材 |
| 2.1.4 免疫印迹相关试剂耗材 |
| 2.1.5 免疫荧光及免疫组织化学相关试剂耗材 |
| 2.1.6 常用试剂旳配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 裂解细胞及蛋白免疫印迹法(Western blot) |
| 2.2.3 提取RNA及反转录 |
| 2.2.4 细胞质、细胞膜、细胞核蛋白分离 |
| 2.2.5 实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.6 BCA浓度测定与ELISA |
| 2.2.7 免疫组织化学(IHC) |
| 2.2.8 免疫荧光(IF) |
| 2.2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 朊病毒感染啮齿类动物脑组织中高表达的M-CSF与PrP~(Sc)存在相互作用 |
| 3.2 朊病毒感染小鼠脑组织中高表达的M-CSF与神经元和小胶质细胞共定位,与星形胶质细胞不存在共定位 |
| 3.3 朊病毒感染细胞中高表达的M-CSF主要分布于细胞膜和细胞质中 |
| 3.4 朊病毒感染细胞中M-CSF与PrP存在相互作用 |
| 3.5 朊病毒感染的小鼠脑组织高表达的CSF1R主要分布在神经元,与星形胶质细胞和小胶质细胞不存在共定位 |
| 3.6 正常小鼠脑组织中IL-34主要在神经元表达,朊病毒感染后主要在星形胶质细胞和小胶质细胞表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 脑组织 |
| 1.1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.2 重组子pET-28a-c(+)-G5P的构建 |
| 1.3 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化 |
| 1.4 重组G5P蛋白偶联磁珠的构建 |
| 1.5 脑匀浆液的制备 |
| 1.6 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获实验 |
| 1.7 朊蛋白的Western blot检测 |
| 1.8 蛋白酶K水解 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET-28a-c(+)-G5P重组质粒的构建及验证 |
| 2.2 重组G5P蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.3 重组G5P蛋白偶联磁珠对脑匀浆液的捕获与检测 |
| 2.4 重组G5P蛋白偶联磁珠捕获的朊蛋白的特征分析 |
| 2.5 重组G5P蛋白与PrPSc亲和能力分析 |
| 3 讨论 |
（6）朊病毒感染与VCP关系初探（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 动物脑组织及细胞系 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 朊病毒感染细胞中VCP分布及表达量检测 |
| 2.2 朊病毒感染细胞中VCP基因表达水平检测 |
| 2.3 感染朊病毒后VCP与ERAD信号通路关键因子检测 |
| 2.3.1 朊病毒感染细胞及脑组织中VCP含量检测 |
| 2.3.2 朊病毒与VCP相互作用分析 |
| 2.3.3 蛋白酶体异常对泛素和VCP含量的影响 |
| 2.3.4 朊病毒感染细胞中ERAD信号通路关键因子含量检测 |
| 2.4 数据的统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 朊病毒感染细胞中VCP分布及表达量检测 |
| 3.2 朊病毒感染细胞中VCP基因表达水平检测 |
| 3.3 感染朊病毒后VCP与ERAD信号通路关键因子检测 |
| 3.3.1 朊病毒感染细胞及脑组织中VCP含量检测 |
| 3.3.2 朊病毒与VCP相互作用分析 |
| 3.3.3 蛋白酶体异常对泛素和VCP含量的影响 |
| 3.3.4 朊病毒感染细胞中ERAD信号通路关键因子含量检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（7）朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1. 朊病毒病 |
| 2. 朊蛋白 |
| 3. PRNP基因 |
| 4. 朊病毒病的传播及种属屏障 |
| 5. PrP抗体 |
| 6. 研究目的及意义 |
| 第一部分 HuPrP23-231多克隆抗体制备 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 朊病毒毒株及细胞系 |
| 2. 抗体和酶 |
| 3. 缓冲液及溶液配制 |
| 4. 其他相关材料与试剂 |
| 5. 实验仪器及设备 |
| 实验方法 |
| 1. Hu23-231蛋白表达纯化 |
| 2. 免疫小鼠及效价测定 |
| 3. 细胞培养及裂解液制备 |
| 4. 多抗验证 |
| 4.1 免疫印迹(Western blot) |
| 4.2 免疫组织化学 |
| 4.3 免疫组织荧光 |
| 4.4 免疫细胞荧光 |
| 实验结果 |
| 1. 蛋白表达纯化及动物免疫 |
| 2. ELISA血清效价测定 |
| 3. 多抗验证结果 |
| 3.1 免疫印迹 |
| 3.2 免疫组织化学 |
| 3.3 免疫组织荧光 |
| 3.4 免疫细胞荧光 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 沙狐及高原鼠兔Prnp序列测定分析 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1. 材料与试剂盒 |
| 1.1 Prnp序列测定相关材料与试剂 |
| 1.2 质粒构建相关材料与试剂 |
| 2. 引物 |
| 3. 设计及分析软件 |
| 实验方法 |
| 1. 动物基因组提取 |
| 2. PCR扩增 |
| 3. 目的片段连接至T-vector并测序 |
| 4. 测序结果分析及提交 |
| 实验结果 |
| 1. 沙狐Prnp序列测定 |
| 1.1 PCR结果 |
| 1.2 Prnp基因测序结果 |
| 1.3 氨基酸序列比对结果 |
| 1.4 多物种序列相似性分析 |
| 1.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 2. 高原鼠兔Prnp序列测定 |
| 2.1 PCR结果 |
| 2.2 Prnp基因测序结果 |
| 2.3 氨基酸序列比对结果 |
| 2.4 多物种同源关系分析 |
| 2.5 序列上传至PubMed数据库 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 不同物种PRNP特征及疾病易感性分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 1 朊病毒病概述 |
| 1.1 朊病毒病 |
| 1.1.1 遗传型朊病毒病 |
| 1.1.2 遗传型克-雅病E200K |
| 1.2 朊病毒病的诊断和检测方法 |
| 1.3 朊蛋白的生物学特性 |
| 1.3.1 细胞型朊蛋白PrP~C |
| 1.3.2 异常朊蛋白PrP~(Sc) |
| 1.3.3 PrP~(Sc)的形成、复制与聚集 |
| 2 线粒体自噬及其相关的调节机制 |
| 2.1 线粒体自噬的概念 |
| 2.2 线粒体自噬相关的的分子机制 |
| 2.2.1 酵母中的线粒体自噬 |
| 2.2.2 Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬 |
| 2.2.3 相关自噬受体介导的线粒体自噬 |
| 3 线粒体自噬与朊病毒及朊病毒病 |
| 第一部分 我国E200K突变遗传型朊病毒病患者的特征分析 |
| 1 引言 |
| 2 主要的仪器与材料 |
| 2.1 主要的设备与仪器 |
| 2.2 主要的试剂与牦材 |
| 2.3 主要溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 全国克-雅病监测体系 |
| 3.2 病例的诊断与确定 |
| 3.3 样品的采集 |
| 3.4 脑脊液中14-3-3蛋白的检测 |
| 3.5 血液中PRNP基因129位及219位氨基酸多态性的测定 |
| 3.6 脑组织中PrP~(Sc)的Western blot检测 |
| 3.7 血液CYP4X1基因多态性的检测 |
| 4 随访 |
| 5 统计学分析 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 流行病学特征 |
| 6.2 临床特征 |
| 6.3 临床实验室检测特点 |
| 6.4 生存时间 |
| 6.5 PRNP及CYP4X1基因序列的测定与家族史 |
| 7 讨论 |
| 8 小结 |
| 第二部分 在朊病毒感染过程中Pink1-Parkin通路介导的线粒体自噬的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验仪器和材料 |
| 2.1 朊病毒毒株模型 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 主要的试剂及耗材 |
| 2.3.1 细胞培养相关的主要试剂及耗材 |
| 2.3.2 细胞超薄切片的制备所需的试剂及耗材 |
| 2.3.3 免疫印迹相关试剂及耗材 |
| 2.3.4 实时定量聚合酶链式反应所用到的试剂及耗材 |
| 2.3.5 免疫组织化学、免疫焚光相关试剂及耗材 |
| 2.3.6 其它相关试剂及耗材 |
| 2.3.7 常用缓冲液及溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞超薄切片的制备及电子显微镜的观察 |
| 3.3 免疫沉淀(IP) |
| 3.4 脑组织匀浆的制备 |
| 3.5 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.6 SMB-S15及SMB-PS细胞总RNA的提取 |
| 3.7 单链cDNA的合成 |
| 3.8 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 3.9 免疫组织化学(IHC)实验 |
| 3.10 组织免疫荧光实验(IFA) |
| 3.11 细胞线粒体及胞质蛋白的提取 |
| 3.12 细胞瞬时转染 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 朊病毒感染细胞系SMB-S15的线粒体形态异常 |
| 4.2 朊病毒感染的细胞系SMB-S15中存在明显的自噬现象 |
| 4.3 朊病毒感染的SMB-S15细胞中Pink1、Parkin水平升高 |
| 4.4 多聚泛素化蛋白在朊病毒感染SMB-S15细胞中减少,而磷酸泛素化蛋白增加 |
| 4.5 朊病毒感染的SMB-S15细胞中MFN2蛋白减少而其泛素化形式增加 |
| 4.6 敲降SMB-S15细胞中Pink1和Parkin的表达,能部分抑制线粒体自噬 |
| 4.7 在139A和ME7感染的小鼠脑组织中Pink1和Parkin表达增加 |
| 4.8 Pink1在感染139A及ME7的小鼠脑组织中与GFAP、Iba1和Neun存在共定位 |
| 4.9 Pink1和Parkin在感染139A及ME7的小鼠脑组织中主要分布于PrP~(Sc)沉积区 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体自噬与神经退行性疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 朊病毒及朊病毒病 |
| 1.1.1 朊病毒概述 |
| 1.1.2 朊病毒病概述 |
| 1.1.3 朊病毒相关细胞因子 |
| 1.2 趋化因子CXCL10及其受体CXCR3 |
| 1.2.1 趋化因子 |
| 1.2.2 CXCL10/CXCR3概述 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 朊病毒模型 |
| 2.1.2 主要设备及仪器 |
| 2.1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SMB细胞系培养 |
| 2.2.2 细胞裂解液的制备 |
| 2.2.3 脑组织匀浆的制备 |
| 2.2.4 脑组织蜡块的制备 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 设计引物 |
| 2.2.7 实时定量PCR |
| 2.2.8 数字PCR |
| 2.2.9 免疫印迹 |
| 2.2.10 免疫组织化学 |
| 2.2.11 免疫荧光 |
| 2.2.12 酶联免疫吸附 |
| 2.2.13 Luminex多重细胞因子检测 |
| 2.2.14 蛋白浓度测定 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 朊病毒感染啮齿动物脑组织中IP10、KC、M-CSF变化特征 |
| 3.1.1 朊病毒感染啮齿动物脑组织中天然免疫因子变化特征 |
| 3.1.2 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF含量升高 |
| 3.1.3 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF转录上调 |
| 3.1.4 朊病毒感染啮齿动物终末期脑组织中IP10、KC、M-CSF的分布特征 |
| 3.1.5 朊病毒感染过程中脑组织IP10、KC、M-CSF的动态表达水平 |
| 3.1.6 朊病毒患者脑脊液中IP10含量升高 |
| 3.2 朊病毒感染中IP10-CXCR3信号通路的特征性变化 |
| 3.2.1 朊病毒感染脑组织IP10与神经细胞的关系 |
| 3.2.2 CXCR3在朊病毒感染动物脑组织和细胞中的表达特征 |
| 3.2.3 朊病毒感染动物和细胞模型中CXCR3的转录特征 |
| 3.2.4 朊病毒感染动物脑组织中CXCR3的分布 |
| 3.2.5 CXCR3-IP10与PrPSc沉积的相关性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多种朊病毒感染动物模型脑组织中CXCL10、KC、M-CSF变化情况 |
| 4.2 CXCL10-CXCR3在朊病毒感染中的特征性变化 |
| 5 结论 |
| 5.1 筛选出朊病毒感染脑组织罕见细胞因子IP10、KC、M-CSF |
| 5.2 阐明朊病毒感染脑组织IP10/CXCR3与朊病毒病相关性 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一节 朊病毒疾病概述 |
| 第二节 朊病毒的发现与研究现状 |
| 第三节 朊蛋白N端研究现状 |
| 第四节 研究朊蛋白N端的意义及其创新点 |
| 第五节 本文实验流程概述 |
| 第六节 朊蛋白其它研究热点简介 |
| 第一章 N端重组突变体朊蛋白的构建及基于sPMCA的重组突变体朊病毒扩增能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第二章 N端CC1区突变型稳定细胞系的建立与基于细胞系的朊病毒感染能力比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第三章 朊病毒感染小鼠模型的建立与鉴定 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第四章 朊蛋白N端与脂质体的相互作用 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析与讨论 |
| 结论与展望 |
| 第一节 全文结论 |
| 第二节 未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、朊病毒的检测方法（论文参考文献）
- [1]纤维素醚TC-5RW对朊病毒播种活性及蛋白酶抗性的作用研究[D]. 丁铭宣. 吉林大学, 2021(01)
- [2]藏羚羊和岩羊朊蛋白基因分析及五种动物重组朊蛋白在RT-QuIC中的应用[D]. 伍晶星. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [3]RT-QuIC在鉴定VPSPr和CWD与检测皮肤朊蛋白中的应用研究[D]. 张微观刘. 吉林大学, 2021(01)
- [4]朊病毒感染中巨噬细胞集落刺激因子及其受体变化特征研究[D]. 夏影. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [5]重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrPSc结合能力的鉴定[J]. 朱峰,谭家亮,吴江,杨茹,毕昊,夏剑波. 华中科技大学学报(医学版), 2021(01)
- [6]朊病毒感染与VCP关系初探[J]. 夏影,郑小亮,张爽,吴海燕,马权,陆鹏,陈嘉,胡超,陈操,陈志宝. 黑龙江畜牧兽医, 2020(23)
- [7]朊蛋白多抗制备及两种动物Prnp基因测序分析[D]. 杨雪花. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [8]E200K突变朊病毒病的疾病特征及朊病毒感染过程中线粒体自噬的研究[D]. 高利萍. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [9]朊病毒感染脑组织低丰度细胞因子筛选及其与朊病毒病相关性初探[D]. 陈嘉. 黑龙江八一农垦大学, 2020(08)
- [10]朊蛋白N端与朊病毒疾病发生发展的关系[D]. 张祥毅. 华东师范大学, 2020