（沈阳药科大学辽宁沈阳110016）
【摘要】目的：本研究拟采用病毒蚀斑试验，通过不同血清浓度下的乙型脑炎病毒P3株感染Vero细胞后形成的蚀斑形成单位来分析不同血清浓度对乙脑病毒感染细胞能力的影响。方法：将经过稀释的乙脑病毒P3株与不同浓度的无乙脑病毒抗体血清等量混合后接种到长满单层Vero细胞的6孔细胞板上，通过病毒蚀斑试验测定蚀斑形成单位。结果：在乙脑病毒接种量不变的情况下，血清终浓度不高于30%时对乙脑病毒感染Vero细胞能力的影响相差不多，当血清终浓度达到40%～50%，乙脑病毒感染Vero细胞的能力明显增加。结论：乙脑病毒P3株在不同血清浓度下对Vero细胞的感染能力的确存在差异，当血清浓度增加到30%以上时，其感染Vero细胞的能力呈指数增长。
【关键词】乙型脑炎病毒；蚀斑形成单位；血清浓度；Vero细胞
【中图分类号】R373【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）28-0085-02
TheeffectofdifferentSerumconcentrationforJapaneseencephalitisvirusinfectioncells
GaoFei,ZhangJinghai,YaoYu.
ShenyangPharmaceuticalUniversity110016,China
【Abstract】ObjectiveThisstudyusedtheplaqueassay,JEV-P3strainindifferentserumconcentrationswereadsorbedwithcells,usingtheplaqueformingunittoanalyzetheeffectsofdifferentserumconcentrationsontheabilityofJEVinfectedcells.MethodsMixturecomposedofequalamountofdilutedJEVanddifferentconcentrationofserumwithoutJEvirusantibodywasinoculatedontoMonolayerVerocellsgrownon6-wellcellplate.PFUwasdeterminedbytheplaqueassay.ResultsIncaseofunchangedJEVinoculum,iftheconcentrationisnotabove30%,theinfectionabilitiesofJEVonVerocellsaresimilar,howeveraftertheconcentrationof40%-50%,theinfectionabilitieswillincreaseobviously.ConclusionTheinfectionabilitiesofJEVonVerosellswithdifferentconcentrationserumexistdifferences.Whenserumconcentrationincreasedtomorethan30%,theinfectionabilitiesofJEVonVerosellswillincreaseexponentially.
【Keywords】Japaneseencephalitisvirus;Plaqueformingunit;Perumconcentration;Verocell
乙型脑炎又称日本脑炎，是亚洲常见的流行性疾病，其病原体为乙型脑炎病毒（以下简称JEV），外观呈球形，直径40nm，是黄病毒科黄病毒属中的一种，其感染人或动物后可导致严重的中枢神经系统病变，严重威胁人畜的健康[1]，JEV可分为5个基因型[2]。目前国内乙脑疫苗市场以地鼠肾细胞减毒活疫苗和Vero细胞灭活疫苗为主，Vero细胞灭活疫苗以其安全性高的特点越发受到关注，对其制备过程进行的调控以生产出更优质的乙脑疫苗是主要的研究方向。JEVP3株是国内最常用的生产Vero细胞乙脑灭活疫苗的毒株，Vero细胞是WHO和《日本药典》对乙脑疫苗检测推荐使用的细胞，其对JEV敏感性高且能够形成蚀斑[3]，本实验通过不同血清浓度下的JEV感染Vero细胞后形成的蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)即空斑数来分析不同血清浓度对JEVP3株感染细胞能力的影响。
1.材料与方法
1.1主要材料
乙型脑炎病毒P3株第58代。
144～150代Vero细胞。
无乙脑抗体的新生牛血清（本文内均简称为血清）。
含10%血清的MEM细胞培养液。
稀释液：98%Hank's液、2%双抗溶液。
其它试剂：甲基纤维素覆盖液；结晶紫染色液。
1.2主要设备
生物安全柜；二氧化碳培养箱；恒温水浴锅；离心机；显微镜；移液器；混匀器。
1.3病毒稀释度确定
采用病毒蚀斑试验对JEV进行预实验，结果显示50%血清终浓度的病毒出现的空斑最多，所以选取血清终浓度为50%的病毒进行测算，以六孔细胞培养板每孔100个空斑数作为计算终点，得出当JEV稀释至2×107时的病毒量约为200PFU/孔，与血清等量混合后形成的理论空斑数为100个/孔。
1.4细胞板制备
取Vero细胞消化后显微镜下计数，以约为105个/ml的细胞浓度接种6孔细胞板，每孔4ml，将细胞板置37℃5%CO2条件下培养24～48小时，长满单层待用。
1.5病毒稀释
用稀释液将JEV稀释至2×107，取2ml稀释后的病毒液加入等量的不同浓度的血清，具体如下：血清终浓度为50%的加入2ml血清；40%的加入1.6ml血清再加入0.4ml稀释液；30%的加入1.2ml血清再加入0.8ml稀释液；20%的加入0.8ml血清再加入1.2ml稀释液；10%的加入0.4ml血清再加入1.6ml稀释液；5%的加入0.2ml血清再加入1.8ml稀释液；0%的加入2ml稀释液；共得到7个血清终浓度不同的病毒液各4ml。在进行上述实验的同时，用稀释液替代JEV进行相同操作，作为空白对照组。
1.6接种细胞培养
将不同血清终浓度的病毒液于37℃水浴90分钟，每30分钟摇匀一次，然后接种至已长满单层Vero细胞的6孔细胞板中，每种浓度各接种6个孔，空白对照的每个浓度接种2个孔，0.4ml/孔，然后将所有6孔细胞板置37℃、5%CO2条件下吸附90分钟，吸出各孔中的液体后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，继续培养5天。
1.7染色计数
上述6孔细胞板培养5天后，吸出各孔中的甲基纤维素覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温放置20分钟后弃去染色液，用流动水冲洗至水流无色，晾干后计数每孔的空斑数。
2.结果
2.1不同血清浓度JEV的空斑数
病毒蚀斑试验染色后的细胞板见图1，空白对照组的所有血清终浓度的孔均未出现空斑，7个血清浓度的JEV形成的空斑数见表1，不同血清浓度对JEV感染Vero细胞的能力有较大影响，其中50%血清对JEV感染Vero细胞的促进能力最强，无血清的最弱，但整体上并未呈倍比增长，血清浓度到达40%才开始出现大幅增长的情况，说明血清浓度在低水平（不高于30%）状态下对JEV感染Vero细胞的能力相对影响较小，但当血清浓度到达40%及以上时会大幅促进JEV感染Vero细胞的能力，7个血清浓度的JEV空斑数的趋势见图2。
图2不同血清终浓度的JEV空斑数平均值趋势图
3.讨论
毒力是JEV的一个重要指标，代表着乙脑病毒感染动物或细胞的能力，已发现影响JEV毒力的相关因素较多，如病毒与细胞受体结合的能力、病毒与细胞融合的速率、病毒RNA合成酶的合成速率等，均会不同程度地影响该病毒的毒力[4]，本研究拟采用灵敏度相对较高的病毒蚀斑试验[5]，通过不同血清浓度下的JEV感染Vero细胞后形成的PFU来分析不同血清浓度对JEVP3株感染细胞能力的影响，并以此为生产过程中如何调控JEVP3株感染Vero细胞的能力提供参考和选择
【参考文献】
[1]Venugopal,K.Goulrd,E.A.Towardsanewgenerationofflavivirusvaccines.Vaccine,1994,12(11),966-975.
[2]UchilPD,SatchidanandamV.PhylogeneticanalysisofJapaneseencephalitisvirus:envelopegenebasedanalysisrevealsafifthgenotype,geographicclustering,andmultipleintroductionsofthevirusintotheIndiansubcontinent[J].AmJTropMedHyg,2001,65(3):242-251.
[3]汤德元，郭万柱.日本脑炎病毒及其疫苗的研究.中国兽医学报，2005，25：217-221.
[4]李晓宇，梁国栋.乙型脑炎病毒毒力基因定位的研究[J].病毒学报，2003，19（2）：187-191.
[5]BorgesMB,KatoSE,DamasoCR,etal.Accuracyandrepeatabilityofamicroplaquereductionneutralizationtestforvacciniaantibodies[J].Biologicals,2008,36(2):105-110.