本文主要研究内容
作者郭文文（2019）在《奶牛子宫内膜永生化细胞系的建立》一文中研究指出：奶牛子宫内膜作为子宫的壁层具有促进发情周期循环、孕育胎儿、内分泌等作用,在病原微生物侵入子宫时,奶牛子宫内膜不仅作为物理性屏障抵御微生物入侵,还可通过激活子宫局部先天免疫反应恢复自身稳态。奶牛子宫内膜结构复杂、功能交错,导致在体情况下很难对妊娠、子宫内膜炎等生理、病理过程的分子机制作出系统的阐明。虽然以原代细胞为模型进行研究能够最真实的接近在体情况,但是原代细胞仍存在耗时、费力、个体差异大等缺点。因此,建立稳定传代的奶牛子宫内膜细胞体外培养模型,为深入揭示奶牛子宫内膜在发情周期、妊娠、子宫内膜炎过程中的分子机制建立基础,对于奶牛子宫内膜炎症的防控、治疗、提高奶牛的妊娠率具有重要意义。本试验通过将人端粒酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)转入奶牛子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)和上皮细胞(endometrial epithelium cells,EECs)中,成功筛选构建了永生化奶牛子宫内膜基质细胞系和上皮细胞系,并通过检测角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)、细胞生长曲线分析、端粒长度分析、核型分析、雌激素和孕酮刺激等方法对构建的细胞系的功能进行了检测,试验结果如下:(1)通过0.25%的胰酶消化法、组织块培养法获得了ESCs和EECs。通过显微镜形态观察和细胞免疫荧光的方法对分离得到的两种细胞纯度进行了形态和细胞类型鉴定,鉴定结果显示:ESCs形态呈梭形,贴壁生长。EECs呈典型的铺路石样、聚团贴壁生长;奶牛ESCs波形蛋白表达为阳性、EECs角蛋白表达为阳性。证明成功获得纯度较高的ESCs和EECs。(2)将pCI-neo-hTERT质粒转ESCs中,经过浓度为400μg/mL的新霉素(G418)筛选14 d后获得ESCs阳性克隆株,扩大培养后命名为TERT-ESCs,TERT-ESCs目前已传至50代。经细胞免疫荧光鉴定,TERT-ESCs中hTERT表达为阳性;通过显微镜观察,TERT-ESCs在传代过程中形态仍为梭形,贴壁生长;CCK 8分析结果显示TERT-ESCs的增殖活力良好;凋亡分析结果表明,和原代ESCs相比TERT-ESCs在传至50代时凋亡率差异不显著;血清依赖性分析结果显示血清促进TERT-ESCs增值呈浓度依赖性;核型分析结果显示转染了hTERT基因的奶牛ESCs在传至50代时,染色体数目保持正常;RT-PCR检测结果显示与原代ESCs相比50代TERT-ESCs正常表达类固醇激素受体;雌激素对TERT-ESCs促增殖作用呈浓度依赖性,低浓度的孕酮对TERT-ESCs具有促增殖作用,高浓度的孕酮具有抑制增殖作用;RT-qPCR分析结果显示,TERT-ESCs在传至30代、50代时端粒长度保持稳定;以上结果表明hTERT基因可以促使TERT-ESCs的永生化。(3)将pCI-neo-hTERT质粒转入EECs,经过浓度为300μg/mL的新霉素(G418)筛选14 d后获得EECs阳性克隆株,扩大培养后命名为TERT-EECs,TERT-EECs目前已传至20代。经细胞免疫荧光鉴定,TERT-EECs中hTERT表达为阳性;传代过程中,TERT-EECs波形蛋白仍呈阳性表达;CCK 8分析结果显示TERT-EECs仍保持良好的增殖活力;通过RT-PCR鉴定分析,TERT-EECs与原代EECs相比可正常表达类固醇激素受体;雌激素对TERT-EECs促增殖作用呈浓度依赖性,低浓度的孕酮对TERT-EECs具有促增殖作用,高浓度的孕酮具有抑制TERT-EECs增殖作用;血清依赖性分析结果显示血清促进TERT-EECs增值呈浓度依赖性;核型分析结果显示转染了hTERT的EECs在传代过程中,染色体数目保持正常。综上所述,本试验将pCI-neo-hTERT质粒转入奶牛ESCs和EECs成功筛选获得了永生化奶牛子宫内膜基质细胞系和上皮细胞系。并通过一系列检测方法鉴定表明两种细胞系可以在体外无限传代且具有正常的生物学功能,证明所得细胞系可以用于后期的试验。
Abstract
nai niu zi gong nei mo zuo wei zi gong de bi ceng ju you cu jin fa qing zhou ji xun huan 、yun yo tai er 、nei fen bi deng zuo yong ,zai bing yuan wei sheng wu qin ru zi gong shi ,nai niu zi gong nei mo bu jin zuo wei wu li xing bing zhang di yu wei sheng wu ru qin ,hai ke tong guo ji huo zi gong ju bu xian tian mian yi fan ying hui fu zi shen wen tai 。nai niu zi gong nei mo jie gou fu za 、gong neng jiao cuo ,dao zhi zai ti qing kuang xia hen nan dui ren shen 、zi gong nei mo yan deng sheng li 、bing li guo cheng de fen zi ji zhi zuo chu ji tong de chan ming 。sui ran yi yuan dai xi bao wei mo xing jin hang yan jiu neng gou zui zhen shi de jie jin zai ti qing kuang ,dan shi yuan dai xi bao reng cun zai hao shi 、fei li 、ge ti cha yi da deng que dian 。yin ci ,jian li wen ding chuan dai de nai niu zi gong nei mo xi bao ti wai pei yang mo xing ,wei shen ru jie shi nai niu zi gong nei mo zai fa qing zhou ji 、ren shen 、zi gong nei mo yan guo cheng zhong de fen zi ji zhi jian li ji chu ,dui yu nai niu zi gong nei mo yan zheng de fang kong 、zhi liao 、di gao nai niu de ren shen lv ju you chong yao yi yi 。ben shi yan tong guo jiang ren duan li mei ji yin (human telomerase reverse transcriptase,hTERT)zhuai ru nai niu zi gong nei mo ji zhi xi bao (endometrial stromal cells,ESCs)he shang pi xi bao (endometrial epithelium cells,EECs)zhong ,cheng gong shai shua gou jian le yong sheng hua nai niu zi gong nei mo ji zhi xi bao ji he shang pi xi bao ji ,bing tong guo jian ce jiao dan bai (Keratin)、bo xing dan bai (Vimentin)、xi bao sheng chang qu xian fen xi 、duan li chang du fen xi 、he xing fen xi 、ci ji su he yun tong ci ji deng fang fa dui gou jian de xi bao ji de gong neng jin hang le jian ce ,shi yan jie guo ru xia :(1)tong guo 0.25%de yi mei xiao hua fa 、zu zhi kuai pei yang fa huo de le ESCshe EECs。tong guo xian wei jing xing tai guan cha he xi bao mian yi ying guang de fang fa dui fen li de dao de liang chong xi bao chun du jin hang le xing tai he xi bao lei xing jian ding ,jian ding jie guo xian shi :ESCsxing tai cheng suo xing ,tie bi sheng chang 。EECscheng dian xing de pu lu dan yang 、ju tuan tie bi sheng chang ;nai niu ESCsbo xing dan bai biao da wei yang xing 、EECsjiao dan bai biao da wei yang xing 。zheng ming cheng gong huo de chun du jiao gao de ESCshe EECs。(2)jiang pCI-neo-hTERTzhi li zhuai ESCszhong ,jing guo nong du wei 400μg/mLde xin mei su (G418)shai shua 14 dhou huo de ESCsyang xing ke long zhu ,kuo da pei yang hou ming ming wei TERT-ESCs,TERT-ESCsmu qian yi chuan zhi 50dai 。jing xi bao mian yi ying guang jian ding ,TERT-ESCszhong hTERTbiao da wei yang xing ;tong guo xian wei jing guan cha ,TERT-ESCszai chuan dai guo cheng zhong xing tai reng wei suo xing ,tie bi sheng chang ;CCK 8fen xi jie guo xian shi TERT-ESCsde zeng shi huo li liang hao ;diao wang fen xi jie guo biao ming ,he yuan dai ESCsxiang bi TERT-ESCszai chuan zhi 50dai shi diao wang lv cha yi bu xian zhe ;xie qing yi lai xing fen xi jie guo xian shi xie qing cu jin TERT-ESCszeng zhi cheng nong du yi lai xing ;he xing fen xi jie guo xian shi zhuai ran le hTERTji yin de nai niu ESCszai chuan zhi 50dai shi ,ran se ti shu mu bao chi zheng chang ;RT-PCRjian ce jie guo xian shi yu yuan dai ESCsxiang bi 50dai TERT-ESCszheng chang biao da lei gu chun ji su shou ti ;ci ji su dui TERT-ESCscu zeng shi zuo yong cheng nong du yi lai xing ,di nong du de yun tong dui TERT-ESCsju you cu zeng shi zuo yong ,gao nong du de yun tong ju you yi zhi zeng shi zuo yong ;RT-qPCRfen xi jie guo xian shi ,TERT-ESCszai chuan zhi 30dai 、50dai shi duan li chang du bao chi wen ding ;yi shang jie guo biao ming hTERTji yin ke yi cu shi TERT-ESCsde yong sheng hua 。(3)jiang pCI-neo-hTERTzhi li zhuai ru EECs,jing guo nong du wei 300μg/mLde xin mei su (G418)shai shua 14 dhou huo de EECsyang xing ke long zhu ,kuo da pei yang hou ming ming wei TERT-EECs,TERT-EECsmu qian yi chuan zhi 20dai 。jing xi bao mian yi ying guang jian ding ,TERT-EECszhong hTERTbiao da wei yang xing ;chuan dai guo cheng zhong ,TERT-EECsbo xing dan bai reng cheng yang xing biao da ;CCK 8fen xi jie guo xian shi TERT-EECsreng bao chi liang hao de zeng shi huo li ;tong guo RT-PCRjian ding fen xi ,TERT-EECsyu yuan dai EECsxiang bi ke zheng chang biao da lei gu chun ji su shou ti ;ci ji su dui TERT-EECscu zeng shi zuo yong cheng nong du yi lai xing ,di nong du de yun tong dui TERT-EECsju you cu zeng shi zuo yong ,gao nong du de yun tong ju you yi zhi TERT-EECszeng shi zuo yong ;xie qing yi lai xing fen xi jie guo xian shi xie qing cu jin TERT-EECszeng zhi cheng nong du yi lai xing ;he xing fen xi jie guo xian shi zhuai ran le hTERTde EECszai chuan dai guo cheng zhong ,ran se ti shu mu bao chi zheng chang 。zeng shang suo shu ,ben shi yan jiang pCI-neo-hTERTzhi li zhuai ru nai niu ESCshe EECscheng gong shai shua huo de le yong sheng hua nai niu zi gong nei mo ji zhi xi bao ji he shang pi xi bao ji 。bing tong guo yi ji lie jian ce fang fa jian ding biao ming liang chong xi bao ji ke yi zai ti wai mo xian chuan dai ju ju you zheng chang de sheng wu xue gong neng ,zheng ming suo de xi bao ji ke yi yong yu hou ji de shi yan 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的郭文文，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于子宫内膜基质细胞论文,子宫内膜上皮细胞论文,基因论文,永生化论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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