导读:本文包含了双自杀基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:自杀基因,HSV-TK,CD20,RQR8
双自杀基因论文文献综述
家婷,张涛,邹强,郑武燕,赵日[1]（2019）在《HSV-TK/CD20双自杀基因系统慢病毒载体的构建及应用》一文中研究指出目的构建同时表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和RQR8膜蛋白双自杀可控开关的Jurkat细胞,使之可通过更昔洛韦药物(GCV)或利妥昔单抗(RTX)实现可控性细胞消除。方法 RQR8膜蛋白小分子含利妥昔单抗识别的模拟表位和抗CD34单抗表位。合成编码RQR8及HSV-TK的基因,构建慢病毒共表达载体pLV-RQR8-T2A-TK;脂质体Lipofectamine3000转染Jurkat细胞,流式荧光抗CD34单抗检测RQR8的表达,通过磁珠筛选获得RQR8~+TK~+Jurkat细胞;分别加入GCV或RTX检测自杀可控开关功能:CCK8法检测加药后细胞增殖情况,Annexin-V/PI检测细胞凋亡情况。结果慢病毒载体pLV-RQR8-T2A-TK酶切片段大约1 670 bp,测序进一步证实外源片段插入正确。慢病毒感染Jurkat细胞,感染率为45.21%,磁珠纯化得到99.4%纯度的RQR8~+TK~+Jurkat。GCV对RQR8~+TK~+Jurkat具有细胞毒性作用,GCV浓度为40μmol/L时,其存活率为(52.11±7.04)%,IC_(50)为20.66μmol/L。80μmol/L GCV作用RQR8~+TK~+Jurkat细胞72 h后凋亡率达(41.28±2.78)%。在血清(含补体)存在情况下,320μg/ml RTX可通过补体介导的细胞杀伤作用杀伤RQR8~+TK~+Jurkat,其存活率为(29.64±4.52)%。结论双自杀可控开关慢病毒载体pLV-RQR8-T2A-TK构建成功,加入GCV或RTX可通过2种不同路径成功杀伤细胞,达到细胞清除目的,提高了安全性,为临床治疗过继免疫不良反应提供多种选择。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2019年08期）
胡聪,杜晓燚,江德鹏,杨旭,张荣贵[2]（2019）在《超声靶向介导载CD-TK双自杀基因的微泡对肺癌的治疗作用》一文中研究指出目的:制备载胞苷脱氨酶-胸腺嘧啶激酶(colicytocinedeaminase-thymidinekinase,CD-TK)双自杀基因的超声微泡,检测其对肺癌的杀伤效应。方法:制备载CD-TK双自杀基因的微泡,观察形态和大小,用碘化丙啶染质粒,观察荧光和计算微泡与基因的结合率。培养肺癌H1299细胞系和建立肺癌裸鼠模型,随机分为对照、超声(ultrasound,U)+微泡(microbubble,M)+CD-TK、U+M+CD-TK+5-FC(5-fluorcytosine,5-氟胞嘧啶)、U+M+CD-TK+GCV(ganciclovir,丙氧鸟苷)、U+M+CD-TK+5-FC+GCV 5组,每组1×107个细胞。微泡转染H1299肺癌细胞,24 h后观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)荧光表达情况,测定细胞GFP转染效果和每组24 h细胞凋亡和周期。体内动物实验,每组6只裸鼠,对照组注射200μL PBS,其余各组尾静脉注射等量的载CD-TK双自杀基因的微泡。观察微泡的显影,同时在肿瘤部位超声辐照转染基因,每组按实验分组连续腹腔注射5-FC、GCV一周,每周记录每只裸鼠肿瘤的最长径和最短径,计算并记录肿瘤的体积变化。第5周取裸鼠肿瘤标本。免疫荧光测TdT(TUNEL法)和PCNA的表达,评估肿瘤组织细胞凋亡和增殖情况。结果:成功制备出载CD-TK双自杀基因的微泡,无毒前药5-FC和GCV联合载CD-TK双自杀基因的超声微泡治疗效果明显,有促进凋亡[凋亡率(28.45±1.75)%]、抑制增殖作用[S期(61.40±4.31)%],疗效明显优于对照组及单药组(5-FC组P=0.002和GCV组P=0.012,对照组P=0.000)。双药联合超声辐照载基因微泡组的肿瘤体积最小、质量最小、凋亡细胞最多、增殖受抑制最明显。结论:无毒前药5-FC+GCV联合微泡载CD-TK双自杀基因能促进肺癌细胞凋亡,抑制其增殖,对肺癌有明显杀伤作用。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2019年02期）
谭铖洸,林丽珠[3]（2018）在《肝癌双自杀基因逆转录病毒转染体系构建与鉴定》一文中研究指出目的进行肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及鉴定,为后续将其转染肝癌细胞、并进行抗肝癌细胞株的功能实验和功效研究奠定基础。方法采用基因工程的方法 ,将pWZLneoCDglyTK质粒转化到DH5α感受态菌后,提取质粒DNA,并采用酶切和PCR及A260 nm和A260 nm/A280nm吸光度测定等方法进行分析鉴定;再将其质粒DNA用脂质体介导转染PA317细胞,然后经G418筛选阳性克隆,进行扩增培养PA317/CD+TK细胞,即成功构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E. coli CD)和单状疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)的肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系。结果转化的阳性菌株可在含Amp的琼脂上生长;质粒经1%琼脂糖凝胶电泳后可见有质粒DNA存在;经单酶切和双酶切后,分别显示相应的电泳条带;PCR鉴定可见有扩增出的CD和TK阳性条带,测定DNA浓度为5.25μg/μl,纯度为1.81。同时,两种质粒转入PA317细胞48 h后荧光显微镜下可观察细胞内有绿色荧光产生,其转染效率约为20%～30%; CD、TK基因PCR分别扩增,已整合到PA317细胞基因组上,其基因PCR产物的相应处分别有一特异性条带;将RNA逆转录后进行PCR扩增,CD、TK基因在PA317细胞中得到表达,其基因RT-PCR产物的相应处也分别有一特异性条带;另外,透射电镜下观察到培养液上清液中病毒颗粒散在或聚集成堆,呈圆球形,边缘呈波状,直径约100 nm。结论采用上述方法并通过分析鉴定结果证实,已成功构建出肝癌双效自杀基因逆转录病毒转移体系,这将为今后该体系对人类肝癌细胞系的HepG2及联合肝癌双效自杀基因前体药物并结合天然抗癌药物共济增效及代谢协同杀伤肝癌细胞奠定治疗物质和方法学基础。(本文来源于《国际老年医学杂志》期刊2018年06期）
谭成光[4]（2017）在《双自杀基因与芪叁酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究》一文中研究指出肝癌系原发于人类肝脏组织及脏器的癌症,也是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性病变,是临床肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,也是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有极强的浸润性,其恶性程度极高,预后极差,且临床确诊患者超过80%以上已是晚期不适宜再进行手术切除,尤其是肝癌患者常出现对多种药物抗药性与耐药性,故对目前放疗和化疗均不敏感。因此,目前临床一线及二线治疗的疗效大多并不满意和理想,致使其发病早期便可发生癌症的肝转移,生存率极低。目的:为了更加深入和系统地探寻和创建更加安全、更有疗效、更有特色、更具实用价值的临床中西医结合抗肝癌疗法,本课题希望通过建立双自杀基因逆转录病毒转移体系在转染人肝癌细胞HepG2的实验研究,观察它们对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用;同时,本课题还希望探索研究天然药物芪叁酚对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用以及它可否共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK,以提高和增加它们之间联合增效的抗癌作用效果;而且,本课题也希望通过此实验研究,探寻天然药物芪叁酚共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK的最佳作用时间和剂量效应,为中西医结合应用在临床对人肝癌的有效治疗和早期干预提供新的研究思路和科学依据。方法:1、双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及共稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究的方法是:采用基因工程技术构建pWZLneoCDglyTK质粒,并将其转导至DH5α感受态菌中,再将扩增获得的大量质粒提取并通过脂质体载体进行介导,将含双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK导入至病毒包装细胞PA317中,经过G418筛选带病毒PA317/CD+TK阳性克隆细胞株,进行扩增培养后收集培养液中病毒上清液进行浓缩,随后再在Polybrene介导下转染人肝癌细胞株HepG2;然后经过G418的再次筛选阳性克隆、并进行扩增培养,以获得稳定表达双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞株及建立稳定转染双自杀基因的HepG2细胞系,再采用RT-PCR检测双自杀基因的表达情况。2、双功能融合自杀基因CDglyTK对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及芪叁酚协同增强杀伤效应的实验研究的方法:分别采用不同浓度的一种或两种联合的自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)、芪叁酚、以及自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)与芪叁酚组合物分次处理人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞,分别采用光镜和电镜观察其细胞形态学改变,采用凋亡小体细胞形态学、DNA Ladder、原位末端标记法(TUNEL)、凋亡相关基因检测、流式细胞检测观察其细胞凋亡情况;采用MTT检测和细胞克隆形成实验观察细胞增殖状况;采用流式细胞检测观察细胞周期变化,以综合观察、分析和评价它们分别或联合对人肝癌HepG2细胞和HepG2/CD+TK细胞的杀伤效果及其共济协同与联合增效的生物学作用。结果:第一部分:双自杀基因逆转录病毒转移体系建立及其稳定感染人肝癌细胞HepG2结果:1.双自杀基因逆转录病毒转移体系构建与稳定表达的结果:(1)pWZLneoCDglyTK质粒DNA含Amp抗性基因,其转化阳性菌株可在含Amp琼脂上生长,未转化菌无Amp抗性则不能生长,证实是含单一细菌克隆的转化菌落。(2)质粒pWZLneoCDglyTK经提取其DNA并纯化后检测清晰可见有质粒DNA存在。(3)含pWZLneoCDglyTK的质粒经BamH I单酶切后可形成1.19kb和6.9kb的两条电泳条带;经EcoR I单酶切后可形成8.09kb的一条电泳条带;经BamH I和EcoR Ⅰ双酶切后可形成1.19kb、1.31kb和5.59kb的叁条电泳条带,证实此质粒为pWZLneoCDglyTK。另以提取的质粒DNA为模板,以CD和TK引物进行PCR扩增,可见扩增的CD和TK的阳性条带,证实此质粒是含CD和TK基因为pWZLneoCDglyTK质粒。构建的双自杀基因经DNA测序并与genebank标准序列比对后证明其序列正确。对质粒pWZLneoCDglyTK阳性转化菌大量扩增培养提取质粒后进行电泳分析,结果有明亮的阳性条带,证明该质粒大量提取成功,对大量提取pWZLneoCDglyTK质粒纯度及浓度测定计算,DNA浓度(μ g/μ 1)=5.25,DNA纯度=1.81,其与理论预估值1.80基本一致。(4)逆转录病毒载体转入病毒包装细胞PA317后第2天即有80%细胞贴壁,生长状态良好,增殖旺盛,细胞形态呈成纤维样,可见分裂相,细胞透明,细胞内无颗粒。用脂质体将pWZLneoCDglyTK质粒及pLXSN.GFP质粒转入PA317细胞48h后可见对照组细胞有绿色荧光产生,证明质粒转染成功,其转染效率在20-30%。(5)对未转染细胞PA317及转染细胞PA317CD+TK的基因组DNA电泳,清晰可见DNA电泳条带;CD、TK基因PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到PA317细胞的基因组上。(6)对提取转染PA317细胞的总RNA进行电泳,有RNA电泳条带存在,证明RNA提取成功;RNA逆转录后PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物在730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物在650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD,TK基因均为阴性,证明CD,TK基因已在PA317细胞中有表达。(7)将pWZLneoCDglyTK质粒以脂质体包裹后导入病毒包装细胞PA317,电镜可见培养上清液中有病毒颗粒散在或聚集成堆呈圆球形,边缘呈波状,直径约100nm大小,说明其逆转录病毒包装成功。2.双自杀基因逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2的结果:(1)人肝癌HepG2细胞复苏第2天可见大部分细胞贴壁,细胞生长良好,形态呈上皮样,多见分裂相,细胞较透明,高倍镜可见细胞内有少许颗粒及细胞器。(2)荧光显微镜下观察,转有对照组病毒上清液中人肝癌HepG2细胞可见大量绿色荧光产生,感染效率达60-70%。(3)对PA317/CD+TK细胞培养上清液中逆转录病毒感染HepG2细胞镜检,该细胞形态未变,用G418筛选,第2天有少数细胞皱缩、死亡、脱落、形成细胞碎片,继续用G418加压培养,存活细胞持续增殖,形成多个细胞克隆,且细胞克隆密切相连。(4)提取未转染人肝癌细胞HepG2及转染细胞HepG2/CD+TK的DNA,电泳后清晰可见DNA电泳条带,证明其基因组DNA提取成功。进行CD、TK基因PCR扩增电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,未经转染HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到HepG2细胞的基因组上。(5)对提取转染细胞的总RNA电泳,有RNA电泳条带存在,证明其RNA提取成功;将RNA逆转录后PCR扩增后电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物650bp处有一特异性条带,而HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已在HepG2/CD+TK细胞中得到了表达。3.人肝癌HepG2/CD+TK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较结果:将转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞及空白对照HepG2细胞进行传代、冻存、复苏后镜检,处于对数生长期的这两种细胞一般形态学基本相同,均呈上皮样生长,且它们的生长曲线也基本一致,无显着性差异(p>0.05)。流式细胞仪对这两种细胞的细胞周期检测,发现它们的细胞周期分布也无明显差异(p>0.05)。第二部分:双自杀基因前体药物联合芪叁酚对人肝癌细胞HepG2细胞及转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的杀伤作用的实验研究结果1.双自杀基因前体药物分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h镜检结果:双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC无论单用或联用均对未转染自杀基因的人肝癌HepG2细胞无作用,但对转染自杀基因的HepG2/CD+TK细胞均有一定作用,联用效果较单一效果更好,且作用效果随前体药物浓度增加而增加,但不同自杀基因前体药物浓度作用HepG2/CD+TK细胞后尚未见死亡细胞增多。2.芪叁酚作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:不同浓度芪叁酚对人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞均有作用,且其作用效果随着芪叁酚作用浓度而增加,杀伤作用呈剂量相关性和浓度依赖性,但相同浓度芪叁酚分别作用两类靶细胞,其细胞形态及细胞死亡情况未见明显不同和差异。3.芪叁酚联合自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:应用双自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪叁酚联合对人肝癌HepG2细胞作用,其作用效果随药物浓度增加而增加,并与单用芪叁酚作用无明显差别。应用双自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪叁酚联合对转染双自杀基因HepG2/CD+TK细胞作用效果更明显,且影响程度也呈剂量效应和浓度依赖性。4.自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后镜检结果:(1)未转染自杀基因的HepG2细胞,在分别或联合应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)作用72h与作用24h时的情况基本相同;而对转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞在分别或联合应用自杀基因前体药物GCV和/或5-FC作用72h比作用24h时损伤目的细胞加重,且GCV和5-FC联合应用较两者单独作用的效果更好。5.芪叁酚分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后的镜检结果:与24h作用相比,芪叁酚作用72h对两类靶细胞损伤和杀伤均加重,且随药物浓度增加而增加。但芪叁酚在同一浓度分别作用两类靶细胞,其细胞形态及死亡情况未见明显差异。6.芪叁酚联合自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞后72h后的镜检结果:与24h相比,应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪叁酚联合对HepG2细胞作用72h的效果更明显,且随着药物浓度增加而增加,但与单用芪叁酚作用HepG2时无明显差别。但应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪叁酚联合对HepG2/CD+TK细胞作用72h与作用24h相比,随着药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞形态和生长状态更差,细胞数量更减少,死亡细胞增多更明显等,且它们之间关系呈剂量效应和浓度依赖性。7.自杀基因前体药物和芪叁酚对人肝癌细胞HepG2及HepG2/CD+TK的生长抑制作用:(1)分别单用或合用GCV或/和5-FC对人肝癌HepG2细胞作用时,对其生存与增殖影响不明显,而对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用则随药物浓度增加而增加。合用GCV和5-FC对该细胞生长抑制作用更明显。(2)应用芪叁酚对HepG2和HepG2/CD+TK细胞的抑制作用均随药物浓度增加而增加,但抑制程度在这两类细胞间无显着性差异。(3)应用芪叁酚和GCV或5-FC对HepG2细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,但芪叁酚联合GCV与芪叁酚联合5-FC应用,对该细胞增殖影响无明显差异,均与单独用芪叁酚对该细胞增殖抑制情况相似。应用芪叁酚和GCV或5-FC对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,芪叁酚联合GCV与芪叁酚联合5-FC,对该细胞增殖抑制无明显差异,但细胞抑制情况均明显高于单独应用芪叁酚组。8.凋亡细胞的瑞氏染色光镜观察结果:分别或联合加入GCV和/或5-FC对HepG2细胞作用,该细胞生长与增殖均未受影响,也未见该细胞出现凋亡,且GCV、5-FC、GCV+5-FC之间以及各药物浓度间均未见HepG2细胞凋亡现象。加入低浓度芪叁酚后也未见HepG2细胞凋亡;但随芪叁酚浓度增加,HepG2细胞凋亡现象逐渐明显。芪叁酚和自杀基因前体药物联用与单独使用芪叁酚的结果基本类似。而分别或联合加入低浓度GCV和/或5-FC对HepG2/CD+TK细胞作用与干预后,未见HepG2/CD+TK细胞出现凋亡;但随自杀基因前体药物作用浓度增加,HepG2/CD+TK细胞出现明显凋亡;尤其是GCV+5-FC合用,该细胞凋亡较单用GCV或5-FC更明显。加入低浓度芪叁酚作用未见HepG2/CD+TK细胞凋亡,但随芪叁酚浓度增加,HepG2/CD+TK细胞凋亡逐渐明显。同时加入芪叁酚和前体药物作用,HepG2/CD+TK细胞凋亡非常明显,即使在低浓度下亦可出现凋亡现象,且随药物浓度增加,凋亡细胞数增加。9.凋亡细胞DNA Ladder检测结果:加入不同浓度GCV(8μg/ml和4μg/ml)和/或5-FC(160μg/ml和80μg/ml)作用HepG2细胞72h,只在加样孔附近发现DNA条带,但未见有DNA Ladder条带产生。而加入低浓度(0.04mmol/L)和高浓度(0.08mmol/L)芪叁酚作用,可见微弱的HepG2细胞DNA Ladder产生,且随芪叁酚浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪叁酚和前体药物与单独加入芪叁酚作用效果类似。而在HepG2/CD+TK细胞中加入不同浓度的 GCV(8μg/ml、4μg/ml)和/或 5-FC(160μg/ml、80μg/ml)72h 后,均可见DNA Ladder产生,随自杀基因前体药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder更明显,且GCV+5-FC较单用GCV或5-FC效果更明显。加入低浓度(0.04mmol/L)和高浓度(0.08mmol/L)芪叁酚,可见有微弱的HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder产生,且随药物浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪叁酚和自杀基因前体药物作用HepG2/CD+TK细胞,其DNA Ladder较单用芪叁酚或自杀基因前体药物更明显。10.TUNNEL法检测细胞凋亡结果:在人肝癌HepG2中分别加入不同浓度GCV(8μg/ml 和 4 μ g/ml)和/或 5-FC(160 μ g/ml 和 80 μ g/ml)作用 72h,TUNEL 结果为阴性。加入芪叁酚作用,TUNEL结果为弱阳性;同时加入芪叁酚和前体药物共同作用,HepG2细胞大部分为弱阳性,最高浓度时有部分HepG2细胞为阳性。而HepG2/CD+TK中加入不同浓度 GCV(8μg/ml、4ug/ml)和/或 5-FC(160μg/ml、80ug/ml)作用,TUNEL 结果显示每种低浓度前体药物可使大部分HepG2/CD+TK细胞为弱阳性,但每种高浓度前体药物作用均可使少部分细胞为阳性;采用两种前体药物联用,细胞大部分为阳性。加入芪叁酚有部分HepG2/CD+TK细胞的为弱阳性,高浓度芪叁酚作用,其细胞核黄色加深。同时加入芪叁酚和前体药物,HepG2/CD+TK细胞均为阳性,且在高浓度时为强阳性。11.流式细胞检测细胞凋亡结果:在HepG2细胞中分别加入前体药物GCV(8μg/ml)或5-FC(160μg/ml)作用72h后,其细胞凋亡率分别为5.43%和5.49%,结果基本相同;而当二者联用时,其细胞凋亡率可达到11.09%,这可能与自杀基因前体药物联合应用后的非特异性毒性有关。而当加入浓度为0.08mmol/L的芪叁酚后,与前体药物组相比,HepG2细胞凋亡率可升至12.02%,说明芪叁酚可引起HepG2细胞的凋亡。但当同时加入芪叁酚和前体药物后,HepG2细胞凋亡率比单用芪叁酚有增高,HepG2细胞的凋亡率为16.32%。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入前体药物GCV(8μg/ml)或5-FC(160μg/ml)作用72h,与HepG2细胞相比,细胞凋亡率明显增加,分别为11.11%和14.37%;当二者联用时,细胞凋亡率为17.89%。加入芪叁酚后,HepG2/CD+TK细胞凋亡率为15.81%,稍高于HepG2。同时加入芪叁酚和前体药物作用,HepG2/CDTK细胞凋亡率明显增高,可达到22.64%。12.细胞克隆形成的实验结果:在HepG2细胞中分别加入不同浓度前体药物GCV(8 u g/ml 和 4 u g/ml)和/或 5-FC(160 μ g/ml 和 80 μ g/ml)72h,各孔 HepG2 细胞克隆形成率均在90%以上,各孔间无显着差异,细胞克隆较大,每一克隆有数百细胞,且细胞克隆间距离近,有些紧密相连。加入芪叁酚后与前体药物相比,HepG2细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加克隆形成率降低。芪叁酚浓度0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,每一细胞克隆均明显缩小,每一细胞克隆内仅有100-200个细胞。同时加入芪叁酚和前体药物与单独加入芪叁酚的差别不大,在高浓度时的HepG2细胞克隆形成率近50%,细胞克隆内细胞数仅数十个。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入不同浓度前体药物 GCV(8μg/ml,4μg/ml)和/或 5-FC(160μg/ml,80μg/ml)作用 72h,与 HepG2 细胞相比,HepG2/CD+TK克隆形成率明显减少,随前体药物随浓度增加,克隆形成率降低;当增至高浓度时,细胞克隆形成率近50%;两种药物联用,克隆形成率降低更明显,仅为400%,且克隆内细胞数量也逐渐减少,当GCV8μg/ml+5-FC160μg/ml时,细胞数仅数十个。与HepG2细胞实验相似,加入芪叁酚后,HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加,克隆形成率降低,在芪叁酚浓度为0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,细胞克隆也明显缩小,每一克隆仅有100-200个细胞。同时加入芪叁酚和前体药物作用的HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显降低,当叁者联用高浓度时,未见有细胞克隆产生。13.对相关基因表达水平影响的检测结果:HepG2细胞中分别加入GCV(8μg/ml)、5-FC(160μg/ml)及二者联用,对HepG2细胞凋亡抑制基因c-fos的表达水平影响不大,而bax基因几无表达,二者联用时仅有微弱bax基因表达;而加入芪叁酚后的c-fos基因表达明显降低,而bax基因表达明显增高;但前体药物与芪叁酚联用与芪叁酚单用相比,c-fos基因表达水平变化不大,而bax基因均有较明显表达,但与单用芪叁酚结果相比,无显着性差别(P>0.05)。在HepG2/CD+TK细胞中加入GCV(8μg/ml),5-FC(160μg/ml)后,c-fos基因表达水平均降低,bax基因表达水平均增高。两种前体药物联用的c-fos基因表达降低更明显,而bax基因表达均高于其中任何单一前药使用;加入芪叁酚后的c-fos基因表达水平与其对HepG2作用相差不大;但前体药物与芪叁酚联用与单用芪叁酚相比,c-fos基因表达降低更明显;当叁者联用时,c-fos基因几乎无表达。加入芪叁酚后,bax基因表达也明显增高;前体药物与芪叁酚联用,bax基因表达水平有更明显升高,而叁者联用时的bax基因表达水平最高。14.细胞迁移实验的观察结果:在HepG2细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,对该细胞迁移影响较小;加入芪叁酚后可抑制HepG2细胞迁移。芪叁酚和前体药物联用的细胞划痕间距与单用芪叁酚差别不大,对HepG2细胞起不到协同抑制细胞迁移的效果。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,该细胞划痕间距明显增大;当两种前药联用时,细胞划痕间距明显大于单种前药。同样,加入芪叁酚后对HepG2/CD+TK细胞划痕间距加大,细胞形态变差。芪叁酚和前体药物联用的细胞划痕间距明显增大,细胞形态更差;当叁者联用时的细胞划痕周围几乎无状态良好的细胞。15.流式细胞检测细胞周期结果:在HepG2细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞 G1、S、G2 期细胞比例分别为 22.95%、68.14%、8.91%或 30.31%、67.19%、2.50%,统计学处理差别不显着(P>0.05),且S期细胞所占比例最多;二者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为32.68%、64.51%、2.82%,差别均无显着性意义(P>0.05)。加入芪叁酚后该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为66.61%、33.39%、0%,S期细胞比例明显减少,而G1期细胞比例增多。芪叁酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为91.83%、8.17%、0%,比单用芪叁酚的G1期细胞比例有所增高;叁者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为92.23%、5.72%、2.04%。HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为33.62%、47.32%、19.06%和39.22%、58.85%、1.96%,与HepG2细胞相比,S期细胞明显降低,G1期细胞明显增多;两种前药联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为47.57%、49.24%、3.19%,虽S期变化不大,但G1期细胞明显增多,说明两种前体药物联用可使更多HepG2/CD+TK细胞阻止在G1期,不能进一步合成DNA。加入芪叁酚后,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为76.78%、23.22%、0%,该细胞DNA合成抑制。芪叁酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为97.77%、2.23%、0%,叁者联用时,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为99.93%、0.07%、0%,该细胞被阻止在G1期,几乎无DNA合成。16.细胞亚结构观察结果:在HepG2细胞中应用GCV和/或5-FC后,多数HepG2细胞表面光滑,无明显结构改变,且两种前体药物联合对HepG2细胞形态学影响不明显。应用芪叁酚后的HepG2细胞表面微绒毛增粗,变成长而粗的细丝,说明HepG2细胞有凋亡。同时应用GCV和/或5-FC后的HepG2/CD+TK细胞膜上出现许多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。应用芪叁酚后的HepG2/CD+TK细胞表面出现很多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡产生。联合应用前体药物和芪叁酚的HepG2细胞膜表面出现一些穿孔现象,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。联合应用自杀基因前体药物和芪叁酚后,HepG2/CD+TK细胞出现更加明显的凋亡小体。结论:1.自杀基因前体药物作用于未转染有双自杀基因的人肝癌HepG2细胞,在本实验设计的浓度剂量和作用时间等条件下,均未能表现出明显的杀癌或抑癌的生物学作用。2.以逆转录病毒为载体将双自杀基因转染至人肝癌HepG2细胞后,再使用双自杀基因前体药物作用,可分别对人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞发生不同程度的损伤和杀伤,从而有效控制人肝癌细胞的增殖性进展。3.自杀基因前体药物均能有效地抑制或杀伤人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的增殖性生长,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,其作用浓度越高,则效果越显着。4.自杀基因前体药物能诱导人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的凋亡,且自杀基因前体药物联合应用对肝癌细胞的抑制与杀伤效果更好,表现出明显的协同增效作用,即与单独使用GC V或5-FC比较,联合使用GCV和5-FC能是人肝癌细胞存活率明显降低,表明双自杀基因较单自杀基因有更强的抑癌效果。5.芪叁酚能影响人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的形态学,使其发生破坏性改变;同时,它还能有效抑制这两类细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;且芪叁酚能诱导这两类细胞的凋亡。6.自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪叁酚Res联合应用对人肝癌HepG2细胞具有单独使用芪叁酚的生物学作用及类似细胞形态学改变;而它们联合应用对人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞能发生更明显的杀伤及破坏性改变,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,浓度越高效果越显着,且表现出双自杀基因前体药物与芪叁酚联合应用后更好杀伤效果,呈现出明显的协同增效作用。7.双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪叁酚合理应用,特别是联合应用不仅能减低自杀基因前体药物的用量及副作用,还能发挥相互之间的协同效应,并且能发挥更好的效果,这很可能为今后中西医结合及天然抗癌药物与自杀基因及其前体药物的综合应用提供一种更加适应于临床肝癌治疗的新思路、新技术和新方法。(本文来源于《广州中医药大学》期刊2017-05-01）
谷洋,刘志毅,金虎,刘明,孙铁梁[5]（2017）在《pAdKDR/CD/TK双自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用的试验研究》一文中研究指出目的探讨含KDR启动子的双自杀基因CD/TK对肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法观察不同前药对HepG2细胞、血管内皮细胞ECV304和LST174细胞的杀伤作用,评估KDR启动子的靶向杀伤作用。观察不同前药对转染不同自杀基因的HepG2细胞的杀伤作用,及旁观者效应。结果转染腺病毒的HepG2细胞及血管内皮ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,而感染腺病毒的LST174细胞对前药不敏感(P<0.05)。当转染细胞混合比例为50%时,应用前药后,转染CD/TK,CD,TK的HepG2细胞生存率分别为11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%(P<0.05)。结论含KDR启动子的双自杀基因CD/TK对肝癌HepG2细胞具有高度靶向杀伤作用;联合用药对转染双自杀基因的肝癌HepG2细胞具有协调增强杀伤作用。(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2017年01期）
杨六成,吴凯,黄宗海,徐帅,王健俊[6]（2015）在《KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究》一文中研究指出目的:探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统(Ad-KDRP-CD/TK)联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。方法:将20只裸鼠随机分均为模型组(皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理)、双自杀基因转染组(皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶)、survivin si RNA转染组(皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivin si RNA/LipDMEM转染混合物)、联合转染组(双自杀基因转染+survivin si RNA转染处理)。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度(MVD)及survivin m RNA与蛋白表达。结果:各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组(均P<0.05),且联合转染组的抑瘤率最大(均P<0.05);肿瘤组织MVD、survivin m RNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显(均P<0.05)。结论:双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。(本文来源于《中国普通外科杂志》期刊2015年01期）
钱滢,周平,田双明,李家乐,邓金[7]（2014）在《超声辐照微泡介导双自杀基因转染对乳腺癌杀伤作用的在体研究》一文中研究指出目的:探讨超声辐照微泡介导CD/TK双自杀基因质粒转染对在体乳腺癌的杀伤效应。方法:用人乳腺癌MCF-7细胞建立裸鼠移植瘤模型后,将荷瘤裸鼠随机分为对照组、质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组,每组5只。对照组仅给予CD与TK相应的前药(5-氟胞嘧啶与更昔洛韦);质粒组注射质粒(含CD/TK基因)与前药;超声辐照组注射质粒与前药,并予超声辐照;超声辐照微泡组注射靶向超声造影剂(质粒与微泡混合物)与前药,并予超声辐照。实验期间记录裸鼠肿瘤生长情况;处理结束后5 d,剥除肿瘤,计算各组的抑瘤率;用倒置荧光显微镜观察目的基因瘤内转染情况,计算基因转染效率;RT-PCR法检测目的基因的表达;免疫组化法计数肿瘤的微血管密度(MVD)。结果:与对照组比较,质粒组肿瘤的生长无统计学差异(P>0.05),而超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤生长被明显抑制(均P<0.05),质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组的抑瘤率分别为3.72%、21.40%、47.13%。质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组基因转染效率分别为0.78%、2.81%、23.87%,后者转染效率明显高于前两组(均P<0.05)。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织中均出现CD/TK基因阳性片段,而对照组与质粒组的肿瘤组织中未见。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织MVD计数均明显低于对照组,且超声辐照微泡组低于超声辐照组(均P<0.05),质粒组MVD计数与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论:超声辐照微泡介导的双自杀基因系统能有效提高基因转染效率与表达,从而增强对肿瘤生长和肿瘤微血管的生成的抑制作用。(本文来源于《中国普通外科杂志》期刊2014年11期）
牛颖[8]（2014）在《核基质附着区MAR增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK靶向治疗胃癌的实验研究》一文中研究指出世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构（The International Agency forResearch on Cancer）发表的《2014年全球癌症报告》称：2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，中国新增癌症病例高居世界第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。胃癌（gastric cancer）是发生在消化系统胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤。它是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率为25.2/10万，占全部恶性肿瘤死亡的23.2%，居各类肿瘤的首位。早期胃癌多无症状或缺乏典型的临床表现，普查的依从性差，费用较高，大部分病人发现时多已处于进展期。传统的治疗效果不理想，预后较差，术后5年生存率并不能让人满意，死亡率仍保持在较高水平。因此寻找一种有效的、新的胃癌治疗方法以提高患者的生存率尤为重要。近年来，分子生物学的发展十分迅速，DNA重组技术日益成熟，基因治疗（gene therapy）在基础研究方面已经取得了很大的进展，成为了一种新的治疗手段。目前肿瘤基因治疗包括许多策略，如基因沉默治疗、自杀基因疗法、反义基因疗法、基因替换疗法、免疫基因治疗、抑癌基因治疗、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗、肿瘤DNA疫苗、抗端粒酶疗法等几个方面。随着基因治疗策略的不断发展和载体的开发应用，胃癌自杀基因治疗（suicidegene therapy）有望成为一种肿瘤治疗新方法为人们所接受，更多的癌症患者将从中获益。本课题组前期研究结果表明，在survivin基因启动子的驱动下，GFP基因可在胃癌细胞SGC-7901中表达，但在正常胃上皮细胞中不表达。转染的SGC-7901细胞中有胸苷激酶（thymidine kinase, TK）/胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase, CD）（CD/TK）融合基因的表达，但在转染的正常胃上皮细胞中未见CD/TK融合基因的表达产物；转染的胃癌SGC-7901细胞对前体药物高度敏感，CD/TK双自杀基因系统比任一单自杀基因有更好的杀伤靶细胞的效果；体内接种转染SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤实验结果表明，与任一单自杀基因相比，双自杀基因系统治疗抑制肿瘤的生长的效果更强更显着尽管自杀基因治疗目前已成功进行体内外实验研究，但是要达到理想的用于临床治疗胃癌的效果还有很大的差距，还有一些问题有待解决，比如外源基因的导入尚缺乏特异性和靶向性，载体特异性受体在肿瘤细胞中表达较低则会导致肿瘤细胞中病毒载体的表达较低等等。核基质附着区（matrix attachmentregion, MAR）是指真核生物染色质中能够与核基质（nuclear matrix）或核骨架产生特异性结合的DNA序列，又称为核骨架附着区（scaffold attachment region,SAR）。MAR序列的功能主要是参与DNA复制调控、转录调控等多种核生化过程，同时MAR可使染色质形成独立的环状结构，从而避免位置效应引起的基因沉默。鉴于MAR序列和基因表达间的这种关系，特别是它能显着地增强外源基因表达、克服位置效应、避免转基因沉默，目前作为一种顺式调控元件已应用于转基因生物工程中。目前，通过应用MAR序列增强survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统靶向治疗胃癌的研究，迄今为止国内外尚未见报道。因此，本研究中我们构建并验证了含有MAR序列的由survivin启动子介导的CD/TK双自杀基因表达系统是否可以增强对胃癌细胞及裸鼠的胃癌皮下移植瘤靶向杀伤作用，结果表明MAR序列元件可以显着增强CD/TK双自杀融合基因的表达，表达产物可以选择性的抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡，对裸鼠的胃癌皮下移植瘤具有显着的靶向杀伤作用。研究结果为胃癌的基因治疗提供重要的理论依据，为临床应用奠定实验基础。本实验研究内容共分为四部分：第一部分含有MAR的重组pMS-CD/TK双自杀基因表达载体的构建目的分别克隆Survivin启动子、CD、TK和MAR基因，构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因真核重组表达载体pMS-CD/TK。方法1. CD基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增CD基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-CD，进行酶切鉴定和测序验证。2. TK基因全长序列克隆和分析：设计引物，以提取的细菌E.coli基因组DNA为模板，PCR扩增TK基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-TK，进行酶切鉴定和测序验证。3. Survivin启动子基因序列克隆和分析：设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-Sur，进行酶切鉴定和测序验证。4. MAR序列克隆和分析：以人β珠蛋白MAR序列为参考设计引物，以提取的人Hela细胞基因组DNA为模板，PCR扩增MAR基因全长序列，回收纯化PCR产物与pMD19-T载体连接、转化细菌、筛选获得重组质粒pMD19-MAR，进行酶切鉴定和测序验证。5.重组pMS-CD/TK真核表达载体的构建：以质粒载体pEGFP-C1为基础，依次将Survivin启动子基因亚克隆连接构建中间载体pEGFP-Sur，再与CD和TK基因连接构建中间载体pS-CD/TK，最后将MAR基因序列连接构建含有MAR的重组真核表达载体pMS-CD/TK，并进行酶切鉴定和测序验证。结果1. PCR产物经酶切及测序鉴定成功克隆Survivin启动子基因（948bp），MAR基因（787bp），CD基因（约1302bp）和TK基因（约1175bp）。2.经不同体系双酶切和测序鉴定成功构建含有MAR的重组表达载体pMS-CD/TK和不含MAR的重组表达载体pS-CD/TK。第二部分重组pMS-CD/TK表达载体转染胃癌细胞及表达分析目的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转染胃癌SGC-7901并分析双自杀基因CD/TK在转染细胞的表达情况。方法1.采用脂质体法将构建好的重组表达载体pMS-CD/TK和pS-CD/TK分别转化人胃癌SGC-7901细胞（靶细胞）及人胃黏膜上皮细胞GES-1（对照细胞）并筛选稳定转化株。2.应用实时荧光定量PCR法（Quantitative real-time PCR, qPCR）检测转染细胞株中CD/TK基因表达量；Western blot法检测转染细胞中CD/TK蛋白的表达情况。结果1.通过脂质体介导方法可有效转染SGC-7901和GES-1细胞。RT-PCR结果表明，与未转染SGC-7901细胞组相比，质粒pS-CD/TK或pMS-CD/TK转染组分别扩增出一条与预期CD/TK片段大小相符的特异性条带，而在GES-1细胞各实验组中均检测到CD/TK基因的表达。2. qPCR结果显示，CD/TK基因在转染pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中的相对表达量是转染pS-CD/TK质粒的7.7倍。3. Western blot结果也表明，与未转染的SGC-7901细胞组相比，在转染pMS-CD/TK或pS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞中可检测到一条单一特异的蛋白条带。第叁部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对胃癌细胞的体外作用实验目的观察MAR序列增强pMS-CD/TK双自杀基因表达系统对胃癌SGC-7901细胞的体外杀伤作用。方法1. SGC-7901和GES-1转染细胞中分别加入前体药物5-FC+GCV，MTT法检测前体药物对转染细胞毒性，计算细胞的存活率。2.转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞和未转染的细胞按所设梯度比例混合，加入5-FC和GCV联合用药治疗，MTT检测细胞的存活率以观察有无旁观者效应。3.流式细胞技术进行转染细胞凋亡率的检测。结果1. MTT检测结果显示，与未转染细胞相比，5-FC和GCV联合应用可以显着降低转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的SGC-7901细胞的存活率，差异有统计学意义（P<0.01）。与转染pS-CD/TK质粒组相比，联合应用前体5-FC+GCV后转染pMS-CD/TK质粒组SGC-7901细胞的存活率降低显着，差异具有统计学意义（P<0.01）；与未转染细胞组相比，5-FC和GCV对转染的GES-1细胞存活率均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。2.随着不断增加转染细胞的比例，细胞的存活率呈现逐渐下降趋势，而且存在明显的旁观者效应。3.在给予5-FC+GCV前药处理后，pS-CD/TK和pMS-CD/TK质粒转染组细胞凋亡率分别为17.65±1.58%、26.25±2.63%，明显高于未转染组对照细胞凋亡率（5.01±0.22%（）P<0.05），且pMS-CD/TK转染组细胞凋亡率显着高于pS-CD/TK组。第四部分MAR增强双自杀基因CD/TK表达对体内裸鼠移植瘤的作用研究目的观察含有MAR的双自杀基因CD/TK表达系统对裸鼠胃癌SGC-7901细胞移植瘤的抑制作用。方法1.胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型的建立：Balb/c裸鼠右前肢腋窝皮下接种5×106SGC-7901细胞，第四天原位补种一次，建立胃癌移植瘤动物模型。2.双自杀基因系统对裸鼠胃癌移植瘤模型的疗效观察：等到裸鼠移植瘤生长至直径约为0.5cm时，将小鼠随机分成3组，6只/每组：A组，空白对照组，仅用PBS处理；B组，注射重组pS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组；C组，注射重组pMS-CD/TK质粒联合前药5-FC+GCV治疗组。在给药治疗后每叁天测量各组小鼠的肿瘤大小，计算瘤体体积，治疗结束时用颈椎脱臼法处死动物，取瘤测瘤重，计算抑瘤率，取肿瘤组织切片行HE染色，镜检观察肿瘤组织的病理变化。3. qPCR法检测裸鼠肿瘤组织中CD/TK双自杀基因的表达结果1.成功建立胃癌细胞裸鼠移植瘤动物模型，当裸鼠成瘤直径达0.5cm后开始进行治疗。各实验组最终瘤重和抑瘤率结果为： A组：557.1±8.9mg；B组：251.7±14.2mg，63.1%；C组：118.8±10.2mg，82.6%。与对照组相比，治疗组肿瘤体积、最终瘤重和抑瘤率明显减小，差异有统计学意义(均P<0.05)。2.肿瘤组织病理学观察结果显示，与对照组相比，治疗组可见肿瘤细胞变性坏死及多发灶性出血散在分布，细胞分裂相少，伴有纤维组织增生，并可见较多的凋亡小体。3. qPCR实验结果表明，在注射转染pS-CD/TK或pMS-CD/TK质粒的移植瘤中检测到CD/TK基因的表达，且后者的表达量是前者的约2.3倍；而PBS处理对照组未检测到CD/TK基因的表达。结论1.成功构建含有MAR的由survivin启动子驱动的CD/TK双自杀基因表达载体系统pMS-CD/TK。2.重组CD/TK融合基因在胃癌细胞SGC-7901中成功表达，MAR基因在转录和蛋白水平均可明显增加CD/TK的表达量。3.双自杀CD/TK融合基因系统对胃癌SGC-7901细胞具有显着的杀伤作用且有明显的旁观者效应。4. MAR序列可通过增强CD/TK基因的表达对胃癌SGC-7901转染细胞产生明显杀伤作用。5. MAR能增强Survivin启动子驱动的双自杀基因CD/TK抑制Balb/c小鼠移植瘤生长的作用(本文来源于《郑州大学》期刊2014-05-01）
王利华,周平,李兴华,钱滢,田双明[9]（2014）在《超声微泡联合脂质体介导双自杀基因杀伤MCF-7细胞的实验研究》一文中研究指出目的探讨超声辐照微泡联合脂质体介导双自杀基因(CD/TK)对MCF-7细胞的体外杀伤作用。方法将培养的MCF-7细胞分为5组:裸质粒组、脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡联合脂质体组。转染pEGFP-KDRp-CD/TK质粒于MCF-7细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。转染后,再分为空白对照组、未转染组、转染组;未转染组和转染组又各分为3个亚组,给予前药丙氧鸟苷(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)、GCV+5-Fc。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测双自杀基因对MCF-7细胞的体外杀伤作用。结果超声辐照微泡联合脂质体组绿色荧光蛋白(GFP)表达最多、最强。超声辐照微泡联合脂质体组转染率(39.59%±1.19%)最高(P<0.05)。MTT检测细胞抑制率结果显示,转染组细胞抑制率明显高于未转染组(P<0.01),转染组中联合用药组细胞抑制率明显高于单一用药组(90.77%±2.68%vs 64.75%±2.27%、67.81%±2.43%;P<0.05)。转染组各前药组细胞抑制率均显着高于超声辐照微泡联合脂质体对MCF-7细胞的转染率(P<0.05)。结论超声辐照微泡联合脂质体能明显提高基因转染效率,是较理想的乳腺癌基因治疗策略。(本文来源于《生物医学工程与临床》期刊2014年02期）
郭霞,董朝,郝轶[10]（2013）在《超声辐照联合双自杀基因慢病毒载体微泡对宫颈癌细胞的杀伤效应》一文中研究指出目的:探讨超声辐照联合双自杀基因慢病毒载体微泡对宫颈癌细胞体外杀伤效应,为宫颈癌的靶向基因治疗奠定基础。方法:构建双自杀基因慢病毒载体pLenti6-KDRP-CD/TK-EGFP,转染293T细胞并计算病毒滴度,与声诺维微泡混悬液混匀孵育,测定其包封率和载药量。运用载药微泡对宫颈癌HeLa细胞进行干预,试验设空白对照组、慢病毒组、慢病毒载体微泡组、2慢病毒载体微泡联合超声辐照组,分别使用4种超声声强(0.25、0.5、1.0、2.0 W/cm)300 kHz,辐照30 s。应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验和流式细胞仪检测各组干预方法对癌细胞增殖和凋亡率的影响。结果:荧光显微镜下可观察到EGFP的表达,说明12载体构建成功,转染后获得病毒滴度为3.5×10 pfu/L,包封率为90.6%±3.1%,载药量为29.2%±0.9%。MTT检测发现与空白对照组比较,慢病毒组、慢病毒载体微泡组、不同超声声强+慢病毒载体微泡组对细胞增殖均有明显抑制作用(P<0.05或<0.01),随2 2着超声辐照声强的增加,癌细胞的抑制率逐步增高(P<0.05),但2.0 W/cm组与1.0 W/cm组相比抑制率无明显差异(P>0.05);各组抑制作用于24 h后均有所下降(P均<0.05),48 h组与24 h组比较抑制作用无明显变化(P>0.05)。通过流式细胞术检测发现与空白对照组比较,各干预处理组对HeLa细胞的凋亡作用均显着升高(P均<0.05);运用超声辐照后,其凋亡率升高趋势更为显着(P<0.01)。结论:双自杀基因慢病毒载体对宫颈癌HeLa细胞具有显着的杀伤效应;联合超声辐照其载药微泡的杀伤效应可明显增强,具有协同作用。(本文来源于《癌变.畸变.突变》期刊2013年05期）
双自杀基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:制备载胞苷脱氨酶-胸腺嘧啶激酶(colicytocinedeaminase-thymidinekinase,CD-TK)双自杀基因的超声微泡,检测其对肺癌的杀伤效应。方法:制备载CD-TK双自杀基因的微泡,观察形态和大小,用碘化丙啶染质粒,观察荧光和计算微泡与基因的结合率。培养肺癌H1299细胞系和建立肺癌裸鼠模型,随机分为对照、超声(ultrasound,U)+微泡(microbubble,M)+CD-TK、U+M+CD-TK+5-FC(5-fluorcytosine,5-氟胞嘧啶)、U+M+CD-TK+GCV(ganciclovir,丙氧鸟苷)、U+M+CD-TK+5-FC+GCV 5组,每组1×107个细胞。微泡转染H1299肺癌细胞,24 h后观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)荧光表达情况,测定细胞GFP转染效果和每组24 h细胞凋亡和周期。体内动物实验,每组6只裸鼠,对照组注射200μL PBS,其余各组尾静脉注射等量的载CD-TK双自杀基因的微泡。观察微泡的显影,同时在肿瘤部位超声辐照转染基因,每组按实验分组连续腹腔注射5-FC、GCV一周,每周记录每只裸鼠肿瘤的最长径和最短径,计算并记录肿瘤的体积变化。第5周取裸鼠肿瘤标本。免疫荧光测TdT(TUNEL法)和PCNA的表达,评估肿瘤组织细胞凋亡和增殖情况。结果:成功制备出载CD-TK双自杀基因的微泡,无毒前药5-FC和GCV联合载CD-TK双自杀基因的超声微泡治疗效果明显,有促进凋亡[凋亡率(28.45±1.75)%]、抑制增殖作用[S期(61.40±4.31)%],疗效明显优于对照组及单药组(5-FC组P=0.002和GCV组P=0.012,对照组P=0.000)。双药联合超声辐照载基因微泡组的肿瘤体积最小、质量最小、凋亡细胞最多、增殖受抑制最明显。结论:无毒前药5-FC+GCV联合微泡载CD-TK双自杀基因能促进肺癌细胞凋亡,抑制其增殖,对肺癌有明显杀伤作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双自杀基因论文参考文献
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