导读:本文包含了去细胞猪主动脉瓣论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:组织工程,去细胞方法,蛋白溶解,免疫原性
去细胞猪主动脉瓣论文文献综述
乔韡华[1]（2016）在《基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣生物力学性能的影响》一文中研究指出第一部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣结构及力学性能的影响目的：探讨叁种基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣去细胞效果,以及对瓣膜结构、细胞外基质(ECM)成分和力学性能的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：以单纯水溶性蛋白溶解(HSA)、单纯脂溶性蛋白溶解(LSA)、连续水溶性蛋白及脂溶性蛋白溶解(SHLS)和经典方法(TSI)对猪主动脉瓣进行去细胞处理。DAPI染色评价去细胞效果;组织学染色(HE、Masson和EVG染色)评价不同去细胞方法对瓣膜结构、胶原纤维和弹性纤维的影响。扫描电镜观察瓣膜表面的微观结构。定量检测瓣膜的含水量、胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(GAGs)的含量,评价不同去细胞方法对ECM成分的影响。应用单轴拉伸试验进行瓣膜力学性能测定,评价不同去细胞方法对力学性能影响。结果：HSA去细胞方法对瓣膜结构和ECM成分的损伤最小,但在四种去细胞方法中仅HSA不能完全去除瓣膜的细胞成分。LSA去细胞方法对瓣膜结构破坏严重,Masson染色显示胶原纤维染色较浅,EVG染色显示弹性纤维几乎被完全去除。SHLS去细胞方法对瓣膜结构影响较小,Masson染色显示胶原纤维保存良好,EVG染色显示弹性纤维轻度减少。TSI去细胞方法对瓣膜结构亦有影响,Masson染色显示胶原纤维有所减少,尤其是纤维层的胶原纤维：EVG染色显示弹性纤维明显减少。ECM定量检测结果显示四种去细胞瓣膜含水量均显着高于天然瓣膜,且胶原蛋白含量与天然瓣膜差异无统计学意义：仅HSA去细胞方法没有降低瓣膜弹性蛋白含量,而LSA、SHLS和TSI去细胞瓣膜弹性蛋白含量较天然瓣膜显着减少：四种去细胞方法均降低了瓣膜GAGs含量。力学性能测试结果显示四种去细胞方法增加了瓣膜在周向和径向上的极限拉伸应变,但HSA、SHLS和TSI去细胞方法并没有显着降低瓣膜的极限抗张强度和弹性模量,而LSA去细胞瓣的周向弹性模量显着下降。结论：SHLS去细胞方法能有效去除猪主动脉瓣膜细胞成分,且对瓣膜结构、ECM成分及力学性能损伤较小。第二部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外免疫原性及生物相容性的影响第一节：基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外免疫原性的影响目的：探讨叁种基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣中异种抗原的去除效果,评价不同去细胞方法处理的瓣膜体外对白细胞和补体系统激活的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：以HSA、LSA、SHLS和TSI对猪主动脉瓣进行去细胞处理。免疫荧光染色检测去细胞瓣膜和天然瓣膜中异种抗原α-Gal和MHCI,评价不同去细胞方法对其去除效果。将去细胞瓣膜和天然瓣膜分别与人血孵育,ELISA法检测PMN弹性蛋白酶和SC5b-9水平,评价不同去细胞方法处理的瓣膜体外对白细胞和补体系统激活的影响。结果：免疫荧光染色结果显示天然瓣膜中存在异种抗原α-Gal和MHC Ⅰ; HSA不能有效去除瓣膜中的α-Gal和MHCⅠ;LSA和SHLS可完全去除该两种抗原；TSI可以去除MHC Ⅰ,但不能完全去除α-Gal。与人血孵育后,LSA和SHLS去细胞瓣组PMN弹性蛋白酶水平显着低于HSA、TSI去细胞瓣组和天然瓣膜组；而HSA和TSI去细胞瓣组PMN弹性蛋白酶水平与天然瓣膜组差异无统计学意义。在四种去细胞瓣膜和天然瓣膜间,SC5b-9水平差异无统计学意义。结论：SHLS和LSA去细胞方法可有效去除猪主动脉瓣中的异种抗原α-Gal和MHC Ⅰ,其处理的瓣膜在体外能降低白细胞激活。第二节：基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外生物相容性的影响目的：分离、培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为组织工程瓣膜的种子细胞,探讨基于蛋白溶解的去细胞方法处理的瓣膜对细胞粘附、细胞增殖、细胞毒性以及血液相容性的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：采用全骨髓差异贴壁法,从Sprague Dawley大鼠骨髓中分离培养BMSCs。光镜下观察BMSCs细胞形态,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物,成骨、成脂诱导体系分别诱导BMSCs定向分化。将BMSCs种植于不同去细胞方法处理的瓣膜上,在细胞种植后2h和24 h以WST-8法测定各组瓣膜上的细胞粘附率。在细胞种植后2d、4 d和8 d,以WST-8法测定各组瓣膜上的细胞增殖数,并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组瓣膜的细胞毒性。将新鲜人血与各组瓣膜孵育进行溶血试验,检测各组瓣膜的溶血率。结果：成功分离培养大鼠BMSCs,第3代BMSCs在光镜下呈梭形贴壁生长,形态均一,呈放射状规则排列。流式细胞仪结果显示BMSCs表达特异性表面标记物CD90和CD29,不表达CD45,表明均质性好,表型稳定；成骨和成脂体系诱导2w后分别行茜素红染色和油红O染色呈阳性,表明分离的BMSCs具有多向分化潜能。BMSCs种植后2h和24 h,四种去细胞瓣膜上细胞粘附率显着高于天然瓣膜,且SHLS去细胞瓣膜表面细胞粘附率显着高于HSA、LSA和TSI去细胞瓣膜。BMSCs种植后2d,四种去细胞瓣膜上细胞相对增殖率均显着高于天然瓣膜上细胞相对增殖率；BMSCs种植后4d和8 d,四种去细胞瓣膜上细胞相对增殖率仍显着高于天然瓣膜上细胞相对增殖率,且SHLS去细胞瓣膜上细胞相对增殖率显着高于HSA、LSA和TSI去细胞瓣膜。BMSCs种植后2 d,TSI去细胞瓣的细胞毒性显着高于其他组,HSA、LSA和SHLS去细胞瓣膜的细胞毒性与天然瓣膜差异无统计学意义。TSI去细胞瓣的溶血率亦显着高于HSA、LSA、SHLS去细胞瓣膜和天然瓣膜。结论：分离培养的BMSCs可作为组织工程瓣膜种子细胞。在四种去细胞瓣膜中,BMSCs在SHLS去细胞瓣膜表面粘附增殖良好,且SHLS去细胞瓣膜对细胞毒性小、溶血率低。第叁部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体内组织重塑与钙化的影响目的：探讨基于蛋白溶解的去细胞方法处理猪主动脉瓣植入体内后的炎症反应、组织重塑与钙化,与经典去细胞瓣膜、天然瓣膜和戊二醛(GA)交联瓣膜比较,并探讨巨噬细胞极化在此过程的作用。方法：72只雌性大鼠随机分为6组,建立腹壁缺损模型,应用各组瓣膜对腹壁缺损进行修补。于术后2w和6w取出植入物,行HE和Masson染色观察炎症反应、组织降解、纤维包裹等并进行组织学评分;硝酸银染色和钙含量检测各组瓣膜钙化情况；行免疫荧光和免疫组化染色比较不同处理方法植入物中巨噬细胞的表型变化;RT-PCR检测促炎因子(IL-12、TNF-α、IL-6、IL-1p)、抗炎因子(IL-10、IL-1ra)、巨噬细胞相关指标(iNOS、ARG)、基质金属蛋白酶及其抑制剂(MMP1、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2)在不同时间点、不同植入物中的基因表达水平；原位明胶酶谱法荧光染色检测MMP2和MMP9活性。结果：组织学分析结果显示LSA和SHLS去细胞瓣膜在体内进行了较好的组织重塑,表现为植入物大量降解,原组织结构不明显,较为规则的ECM形成,组织中央可见肌细胞;HSA和TSI去细胞瓣膜在体内组织重塑较差,表现为植入物内和植入物周围细胞浸润减少,支架部分降解,ECM部分形成,肌细胞生长较少；天然瓣膜和GA交联瓣膜在体内以异物反应为主,表现为大量炎症细胞浸润,无肌细胞生长,组织结构基本完整,被致密的纤维组织包裹。植入体内6w后,硝酸银染色显示仅GA交联瓣膜中可见大量褐黑色沉淀物；钙含量检测结果显示四种去细胞瓣膜中的钙含量均显着低于天然瓣膜和GA交联瓣膜。组织重塑较好的植入物(LSA和SHLS去细胞瓣膜)M2：M1巨噬细胞比率在不同时间点均高于组织重塑较差的植入物(HSA和TSI去细胞瓣膜)和发生异物反应的植入物(天然瓣膜和GA交联瓣膜),而且HSA和TSI去细胞瓣膜的M2：M1巨噬细胞比率在不同时间点亦高于天然瓣膜和GA交联瓣膜的。在植入体内后2w和6 w,抗炎因子在LSA和SHLS去细胞瓣中表达较高,而促炎因子在天然瓣膜和GA交联瓣膜中表达较高。四种去细胞瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs在2w时表达较低,在6w时表达较高。LSA和SHLS去细胞瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs的表达水平在6w显着高于其他四组。GA交联瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs的在不同时间点表达均较高。原位明胶酶谱法荧光染色检测MMPs活性亦得到相同结果。结论：不同去细胞方法处理的瓣膜、天然瓣膜和GA交联瓣膜在体内均引起了程度不一的宿主反应。LSA和SHLS去细胞瓣膜在体内发生了组织重塑。巨噬细胞可通过转化为M1和M2表型,分泌并调节促炎因子与抗炎因子以及MMPs/TIMPs,影响瓣膜在体内组织重塑的过程。(本文来源于《华中科技大学》期刊2016-05-01）
郭利明,曾小飞,马瑞东,尚观胜,郝明[2]（2010）在《去细胞猪主动脉瓣RGD肽表面修饰促进细胞黏附的实验研究》一文中研究指出目的研究RGD肽(精-甘-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)表面修饰的去细胞瓣对细胞黏附性的影响。方法采用胰蛋白酶+TritonX-100法制备去细胞猪主动脉瓣(acellularized porcine aortic vavle,APAV),并用环氧氯丙烷(EC组)、戊二醛+环氧氯丙烷(GE组)以及再分别用RGD肽修饰(EC+RGD组、GE+RGD组)的各不同处理去细胞瓣组,与YGRGDSP肽(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)反应,通过茚叁酮法、荧光标记显示法比较各组的结合率。种植大鼠主动脉肌成纤维细胞(MFBs),沉淀法检测细胞黏附率。结果茚叁酮显示多肽可很好的交联到EC、GE组,最佳反应条件为:室温,1.5 mg/mL RGD、pH7.4、持续振荡12 h。经RGD肽修饰的EC、GE组细胞黏附率较单纯APAV提高(P<0.05)。结论利用EC,可将YGRGDSP肽以共价接枝的方式固定到APAV支架进行表面修饰,EC联合RGD肽表面修饰去细胞瓣可显着改善细胞黏附性。(本文来源于《四川大学学报(医学版)》期刊2010年06期）
刘洋,孙国成,刘珊珊,郑奇军,顾春虎[3]（2009）在《染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞毒性研究》一文中研究指出目的评价染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣膜的细胞毒性。方法将L929细胞经亚甲基蓝介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣浸提液培养后,用MTT比色法测定其相对增殖率。将L929细胞与染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣直接接触培养,于不同时间观察细胞的生长状态。将L929细胞种植于染料介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣表面,用扫描电镜观察其生长情况。结果染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的性质稳定,细胞毒性程度为0～Ⅰ级。L929细胞与瓣膜材料直接接触培养生长良好,形态学无明显改变。结论染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的细胞相容性良好。(本文来源于《心脏杂志》期刊2009年04期）
刘洋[4]（2009）在《原花青素交联去细胞猪主动脉瓣》一文中研究指出瓣膜置换术是治疗各种心脏瓣膜疾病的唯一有效手段。目前临床应用的人工瓣膜主要是机械瓣和生物瓣,其中生物瓣的应用越来越广泛,在西方国家有的已超过机械瓣的用量。主要原因是机械瓣的终生抗凝治疗及其抗凝并发症导致的远期效果与生物瓣没有明显差别。而生物瓣只需术后短期抗凝治疗,且有较好的仿生血流动力学特点,术后并发症较少。但是生物瓣钙化、耐久性差的问题是不容忽视的。目前认为,生物瓣钙化可能与瓣膜基质的丢失及戊二醛的作用,机械应力造成生物瓣损伤,宿主钙磷代谢影响,炎症和免疫反应等因素有关。针对这一问题,国内外众多实验室都在寻求解决的方法,但结果均不理想。而在组织工程瓣膜的研究中,对生物原性的瓣膜材料进行去细胞处理后所获得的去细胞瓣膜支架材料,由于去除了细胞成分,完整保存细胞外基质,具有较低的免疫原性和钙化潜能,为瓣膜的抗钙化处理指出了一条新的径路。但去细胞处理后的瓣膜尚需进一步处理,以增强其力学强度和耐久性能。本研究拟选取经去细胞处理的猪主动脉瓣膜为基础材料,应用一种新型的生物源性交联剂-----原青花素交联处理,构建新型去细胞生物瓣,并通过体外、体内试验,检测原青花素处理去细胞瓣膜的生物学、理化、抗钙化性能及组织、细胞相容性,为改进生物瓣交联处理方法做新的探索。第一部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜的构建及生物物理性能评价。取回新鲜猪主动脉瓣膜,按本实验室建立方法经去细胞处理后,检测其去细胞效果,进而经0.1%原花青素交联处理后,检测原花青素去细胞瓣膜的厚度、组织含水量、热皱缩温度、可溶性蛋白含量、断裂强度、耐久性、抗酶解性能、交联度等生物生物物理性能,并与新鲜未去细胞瓣膜、去细胞瓣膜、戊二醛交联去细胞瓣膜比较。结果显示:去细胞效果满意,细胞成分去除彻底,纤维支架保存完整;原花青素去细胞瓣膜组厚度(0.15±0.04)mm、含水量(89.1±3.4)%、热皱缩温度(71±4.1)℃,与未去细胞组(0.16±0.07)mm、(88.7±4.7)%、(74±2.9)℃,单纯去细胞组(0.18±0.11)mm、(90.3±4.3)%、(73.3±5.1)℃均无明显差别(p>0.05),而与戊二醛处理组(0.27±0.08)mm、(75.1±3.9)%、(87.4±4.3)℃差别显着(p<0.05);而原花青素去细胞瓣膜组可溶性蛋白含量(0.71±0.22)%,与未去细胞组(2.16±0.32)%、单纯去细胞组(1.47±0.27)%均差别显着(p<0.05),而与戊二醛处理组(0.76±0.16)%无明显差别(p>0.05);原花青素去细胞瓣膜组断裂强度(11.8±0.91)mPa较其余各组(8.71±1.12)mPa、(8.25±1.07)mPa、(9.15±0.97)mPa均明显增强;耐久性实验发现原花青素处理组在PBS保存45天后断裂强度无明显变化;24h抗酶解实验可见新鲜瓣膜组及去细胞瓣膜组至2h已几乎全部降解,失重率接近100%,而降解24h后,原花青素去细胞瓣膜组和戊二醛处理组失重率分别为(10.21±1.8)%、(7.17±1.1)%,两组间亦未见明显差异。由上可知,原花青素处理去细胞瓣膜,在去除细胞成分及钙结晶核、降低免疫原性的同时,保持了完整的瓣膜构型和结构特点,具有较好的力学性能和生物学特性。第二部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜生物相容性评价。进行原花青素去细胞瓣膜原花青素释放试验,并通过L929细胞直接、间接接触细胞毒性实验考察原花青素生物相容性。结果提示:处理后1d原花青素释放到达高峰,浓度为798.32±52.31 ug/ml,至4d后原花青素释放浓度下降至7.31±1.12 ug/ml,尔后再无明显释放;间接接触细胞毒性实验提示不同时相的细胞毒性分级均为0-1级;直接接触细胞毒性实验中光镜及扫描电镜结果可见L929细胞贴壁生长,形态良好,随时间延长,细胞数量增加,在各观察点,实验组和空白对照组细胞形态及数量均无明显差别。由上可知,原花青素处理去细胞猪主动脉瓣细胞毒性低,生物相容性好,成纤维细胞能够在其表面良好生长。第叁部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜抗钙化性能评价。通过大鼠皮下包埋实验,在1、2、3、4、6、8、10、12周提取标本,进行大体观察、组织切片HE染色、Masson染色观察组织相容性,并行Von-Kossa染色、扫描电镜-能谱分析检测各组材料抗钙化性能。结果提示包埋2w后组织炎症反应轻微,材料保存完好;Von-Kossa染色提示包埋21d单纯去细胞组可见轻度钙化,戊二醛处理组出现明显钙化,原花青素处理组未见钙盐沉积;包埋63d,单纯去细胞组钙化程度明显加重,戊二醛处理组钙化明显,原花青素处理组仍未见明显钙盐沉积;扫描电镜-能谱分析结果显示:包埋21d,单纯去细胞组未见钙峰出现,戊二醛处理组出现明显钙峰,原花青素处理组未见钙峰出现;包埋63d,单纯去细胞组出现少量钙峰,戊二醛处理组钙峰较前进一步增多、增高,原花青素处理组仍未见明显钙峰出现。由上提示,原花青素处理去细胞瓣具有良好的组织相容性和抗钙化性能。第四部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜人骨髓间充质干细胞种植实验。经分离、纯化、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞,选取3-5代2×106cm-2种植于原花青素去细胞瓣膜,观察人骨髓间充质干细胞在原花青素去细胞猪主动脉瓣的生长情况。结果提示:所获得的细胞经流式细胞仪检测,所培养的细胞不表达CD34,高表达CD44,CD44阳性率在(92.12±2.34) %,与平行对照组(3.57±1.16) %比较有显着性差异(P<0.01)。免疫组化鉴定,MSCs具有特征性的表面标志,不表达CD34,而CD44表达强阳性。种植细胞后HE染色光镜观察,种植3天瓣膜表面单层细胞覆盖,细胞具有活性。种植7天,可见瓣膜表面覆盖细胞层明显增厚,多层细胞生长,具有活性,并有细胞分泌的细胞外基质。细胞未有向瓣膜深层生长趋势,瓣膜基质完整。扫描电镜观察可见,种植7天,瓣膜表面细胞均匀覆盖。种植14天后,瓣膜表面覆盖细胞层明显增厚,多层细胞生长。由上可知,原花青素瓣膜能够提供细胞生长的微环境,而且细胞能够发挥正常的生理功能。说明原花青素瓣膜具有良好的细胞相容性,且具有能够在体外快速内皮化的特性。通过以上实验,初步揭示了原花青素交联去细胞瓣具有良好的生物学特性,较低的免疫原性、细胞毒性,具有良好的组织相容性和抗钙化性能,并且具有能够在体外快速内皮化的特性,明显优于戊二醛处理效果,对进一步改进生物瓣抗钙化性能及耐久性有良好的发展前景,为原花青素交联生物瓣处理方法的深入研究做了初步探讨。(本文来源于《第四军医大学》期刊2009-04-01）
周华松,顾春虎,陈文生,赵金超,王云雅[5]（2009）在《去细胞猪主动脉瓣的制备》一文中研究指出目的完全去除猪主动脉瓣的细胞,制备成去细胞猪瓣支架。方法采用胰酶+TritonX-100制备去细胞猪瓣支架,标本进行形态、组织结构观察,并进行DNA含量和力学强度测定。以新鲜猪瓣为对照将去细胞瓣叶家兔皮下埋藏4周后分别取材,光镜进行检查。结果采用胰酶+TritonX-100法能完全脱除猪主动脉瓣膜细胞,去细胞后瓣膜可溶性蛋白明显丢失[(0.24±0.04)%vs(0.48±0.12)%],瓣叶含水量增加[(92.2±1.5)%vs(89.2±1.6)%](P<0.01),但去细胞猪瓣仍保持了良好纤维支架结构,热皱缩温度[(67.9±1.0)℃vs(68.8±0.8)℃]和断裂强度[(489.3±19.0)g/mm2vs(540.7±19.5)g/mm2]未见显着变化(P>0.01)。埋藏于兔皮下的去细胞猪主动脉瓣有轻微组织反应,可见少量中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润,炎性反应明显轻于新鲜猪瓣组。结论成功制备去细胞猪瓣支架,并保持良好的纤维支架结构和机械强度,抗原性轻微。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2009年02期）
刘洋,孙国成,刘珊珊,谭红梅,欧阳辉[6]（2008）在《染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的生物学特性》一文中研究指出目的探讨染料介导光氧化处理猪主动脉瓣膜的生物学特性,以期获得性能良好的新型生物瓣膜材料。方法经去细胞处理的猪主动脉瓣30个,随机分为3组。光氧化处理组(n=10):去细胞瓣膜经染料介导光氧化处理;戊二醛处理组(n=10):去细胞瓣膜采用戊二醛处理;去细胞对照组(n=10):去细胞瓣不做固定处理,置于生理盐水中备用。分别测定并比较3组瓣膜的形态学改变、组织学特点、瓣膜厚度、含水量、热皱缩温度、断裂强度和可溶性蛋白含量。结果光氧化处理组主动脉瓣呈淡蓝色,瓣膜质地柔软,弹性大,瓣叶无皱缩。光氧化处理组主动脉瓣瓣膜厚度较戊二醛处理组薄(0.26±0.09mmvs.0.38±0.08mm;P<0.05),组织含水量较戊二醛处理组大(86.30%±4.03%vs.71.10%±3.23%;P<0.05),热皱缩温度低于戊二醛处理组(76.30±0.70℃vs.87.70±0.30℃;P<0.05);瓣膜厚度、组织含水量和热皱缩温度与去细胞对照组比较差异无统计学意义。光氧化处理组断裂强度较去细胞对照组明显增大(17.33±2.65mPavs.9.11±0.95mPa,P<0.05),可溶性蛋白含量较去细胞对照组明显减少(0.039%±0.013%vs.0.107%±0.024%;P<0.05),而与戊二醛处理组比较差异无统计学意义。结论染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣有较好的生物学特性。(本文来源于《中国胸心血管外科临床杂志》期刊2008年03期）
马浩[7]（2008）在《成人骨髓间充质干细胞和脱细胞猪主动脉瓣构建组织工程化人工心脏瓣膜的实验室研究》一文中研究指出第一部分:成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为内皮样细胞和成纤维样细胞的实验研究【目的】本研究通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞,并在体外定向诱导分化为内皮样细胞和成纤维样细胞,研究其增殖和生长的特性,探讨为构建组织工程化心脏瓣膜提供种子细胞的可能性。【方法】1、成人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增:采用密度梯度离心结合贴壁的方法,提取骨髓单个核细胞进行体外培养扩增,收集传代细胞行流式细胞仪检测细胞表型,并绘制培养细胞的生长曲线。2、骨髓间充质干细胞向内皮样细胞和成纤维样细胞的诱导分化:分别用含10ng/ml VEGF和5ng/ml bFGF的培养液诱导细胞分化,对所诱导的细胞进行形态学、免疫组化染色、细胞表型及功能的鉴定。【结果】1.通过密度梯度离心结合贴壁的方法,可以获取增殖活跃的骨髓间充质干细胞,该细胞高表达CD105、CD44、CD29,原代培养曲线显示第7-10天为对数增长期,传代培养曲线显示第4-6天为对数增长期,传代细胞多于P_(10)后开始出现衰老现象。2.经VEGF诱导的细胞具有内皮样细胞形态特点,vWF染色阳性,细胞上清液内NO浓度为166.58±1.91 umol/10~9cell/L。3.经bFGF诱导的细胞具有成纤维样细胞形态特点,SMA染色阳性,高表达CD105,不表达CD34。【结论】1.利用密度梯度离心结合贴壁的方法,可以提取足够量、高纯度、未分化、能大量增殖的骨髓间充质干细胞,能够满足构建TEHV的需要。2.骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化成为内皮样细胞和成纤维样细胞,并能做为构建TEHV的种子细胞。第二部分:不同方法制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架的实验研究【目的】本研究通过采用不同的洗剂来制备脱细胞的猪主动脉瓣膜支架,对比不同脱细胞方法处理后的瓣膜支架组织学结构,探讨最为有效的脱细胞瓣膜支架制备方法。【方法】将20个新鲜猪主动脉瓣膜随机平均分为新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组,新鲜对照组瓣膜置于4℃PBS液中备用,其余叁组分别使用Triton X-100、胰蛋白酶以及二者联合的方法制备脱细胞瓣膜支架,对比观察大体形态、HE染色、Mallory-Heidenhain染色和电镜下超微结构的不同。【结果】1.经Triton X-100脱细胞处理后,瓣叶柔软,内膜光滑;HE染色可见细胞已去除,少量蓝染核物质存留,纤维排列尚规整;Mallory-Heidenhain染色示纤维结构较疏松,蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维相互交错;电镜下纤维结构保存尚完整,波浪状排列,原纤维横纹清楚。2.经胰蛋白酶脱细胞处理后,瓣膜有塌陷,内膜尚光滑,HE染色可见细胞完全去除,纤维排列较紊乱,局部有断裂、裂隙变大;Mallory-Heidenhain染色示纤维结构更疏松,蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维交织成网状;电镜下纤维交错排列,部分断裂,仍可见原纤维横纹存在。3.经Triton X-100联合胰蛋白酶脱细胞处理后,瓣叶柔软,内膜光滑;HE染色可见细胞完全去除,纤维基本连续完整,排列较规整;Mallory-Heidenhain染色示蓝色的胶原纤维和红色的弹性纤维基本平行排列;电镜下纤维保存较好,但排列较正常稀疏,原纤维横纹仍清晰可见。【结论】1.Triton X-100、胰蛋白酶以及Triton X-100联合胰蛋白酶的方法均可以有效去除供体细胞,保持纤维结构相对完整。2.叁种方法比较而言,在完全清除供体细胞并保持纤维支架完整性方面,Triton X-100联合胰蛋白酶的方法更为有效。第叁部分:脱细胞瓣膜支架细胞相容性和生物力学特性的实验研究【目的】本实验通过检测不同方法制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,对比其细胞相容性和生物力学特性,从而探讨更为理想的组织工程用脱细胞瓣膜支架。【方法】取去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组叁组脱细胞猪主动脉瓣,另取培养板做对照,种植内皮样细胞并培养7天,组织学观察细胞生长情况,MTT法描绘生长曲线。另取新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂—酶消化组四组脱细胞猪主动脉瓣,制成1.5cm×0.5cm大小的试件条,分别测定其含水量、热皱缩温度和厚度,并在生物力学测定仪上进行单轴拉伸实验、应力-松弛实验和加载-卸载实验,测定各组瓣叶的断裂强度、断裂伸长率、应力松弛率和加载卸载曲线下面积比。【结果】1.细胞相容性:叁组脱细胞瓣膜支架种植内皮样细胞并培养7天后,HE染色和电镜观察可见细胞单层排列于支架表面,贴附生长,MTT法描绘生长曲线提示第3-6天为对数增长期。不同瓣膜支架细胞生长无明显差异。2.生物力学特性:叁组脱细胞瓣膜支架与新鲜瓣膜比较,厚度、热皱缩温度有所增加,差异无统计学意义;瓣叶含水量增高,差异有统计学意义;断裂强度有所下降,断裂伸长率和AR比值略增加,差异无统计学意义。【结论】1.种子细胞在叁种脱细胞猪主动脉瓣膜支架上贴附生长良好,2.叁种瓣膜支架理化性质和机械性能(抗拉伸能力、变形恢复能力和顺应性)稳定;3.经Triton X-100联合胰蛋白酶脱细胞处理的瓣膜支架是叁组中理想的组织工程用支架。第四部分:分层种植方式体外构建组织工程化心脏瓣膜的实验研究【目的】本实验通过以脱细胞猪主动脉瓣为支架,分层种植由成人骨髓间充质干细胞诱导分化的内皮样细胞和成纤维样细胞,研究构建具有分层结构的初级组织工程化心脏瓣膜,为以后的动态培养和移植实验奠定基础。【方法】取Triton X-100联合胰酶法脱细胞处理的猪主动脉瓣叶,制成1cm×0.5cm大小的支架片,并用纤维连接蛋白预处理。Brdu标记成纤维样细胞并在ECMgel凝胶中混悬,然后种植于经过预处理的瓣叶,静置培养24小时;DAPI标记内皮样细胞,接种于种植有成纤维样细胞-ECMgel的支架表面,静置培养7天。标本行HE染色和电镜扫描观察组织学结构,荧光显微镜观察种子细胞分布。【结果】Brdu标记的成纤维样细胞呈现明亮的黄绿色荧光,DAPI标记的内皮样细胞呈蓝色。ECMgel混悬成纤维样细胞后凝胶化,半透明,成纤维样细胞呈星状排列分布于凝胶中的不同层次。构建的组织工程化心脏瓣膜,HE染色下可见叁层结构:内皮样细胞层、成纤维样细胞—ECMgel凝胶层、脱细胞支架层。扫描电镜下可见内皮样细胞在支架材料表面贴附良好,细胞排列较紊乱,部分细胞已开始融合。直接荧光显微镜下可见支架材料表面铺满被DAPI标记的的内皮样细胞,呈蓝色;免疫荧光染色瓣膜横断面可见内皮下层内散在分布Brdu标记的成纤维样细胞,呈明亮的黄绿色荧光【结论】1.ECMgel是携带成纤维样细胞良好的基质;2.利用分层种植和复合培养的方法,可以构建与正常瓣膜组织结构相似的组织工程化心脏瓣膜。(本文来源于《中国协和医科大学》期刊2008-05-01）
周华松[8]（2008）在《去细胞猪主动脉瓣RGD表面修饰促进细胞粘附的实验研究》一文中研究指出对于心脏瓣膜疾病最为主要的治疗方式仍是手术进行瓣膜置换。目前临床应用的人工心脏瓣膜有机械瓣和生物瓣两大类,尽管均能改善和延长患者的生命,但都未达到理想程度。机械瓣需要终生抗凝,有一定的栓塞和出血率;生物瓣则存在衰坏、钙化的问题。同种瓣膜虽优于异种生物瓣,但来源受限,并且也存在衰败的问题。研究与开发组织工程心脏瓣膜是当前大势所趋。利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜,具有任何高分子可降解材料无法替代的优越性。但是由于在支架材料的去细胞过程中,会同时去除大量细胞外可溶性基质,其中包括已知的调控细胞粘附的蛋白分子。因此在利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜时,如何调控、促进种子细胞的粘附、增殖和ECM新生,是丞待解决的重要问题。借鉴目前对于“生物惰性材料”通过“表面修饰”的方式,可以改善或提高其生物相容性、材料的理化性能的成功经验,拟对去细胞瓣进行表面修饰,以改善其理化性能、促进种子细胞的粘附、增殖和分化。生物活性分子RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)作为天然ECM重要组成,是目前应用最广、最有效的促进细胞粘附的多肽。本研究首先通过应用我们实验室筛选的,胰蛋白酶+TritonX-100法制备去细胞猪主动脉瓣支架,并对本实验室筛选的交联剂-环氧氯丙烷处理去细胞瓣膜支架材料的影响进行进一步的对比研究。在此基础上,应用多肽(序列为YGRGDSP酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)与环氧氯丙烷联合对去细胞猪主动脉瓣膜进行表面修饰,并研究处理后材料细胞粘附性的变化。对去细胞支架材料的改良,以及通过交联RGD进行表面修饰做了初步的尝试。第一部分去细胞猪主动脉瓣膜的制备及环氧氯丙烷改性后的理化性能实验。采用胰蛋白酶消化和高渗、低渗性去垢剂TritonX-100漂洗的方法制备去细胞猪主动脉瓣,分别用GA、EC以及GA+EC(GE)的方法处理去细胞猪主动脉瓣,比较相互之间力学、组织稳定性、组织相容性上的差异。结果1、采用胰酶+TritonX-100法能完全脱除猪主动脉瓣膜的细胞成分。2、GA、EC以及GE叁种处理方法,均可使APAV在力学、热皱缩温度、体外抗酶解能力上得到加强,并且其中以GE效果最佳。3、动物皮下包埋、血浆蛋白及血小板粘附实验结果表明,EC处理不改变APAV的组织相容性和血液相容性,同时经EC处理的GA组APAV,显着的降低GA的生物毒性,其组织相容性、血液相容性明显优于GA处理组。结论本实验提示GE处理APAV,能够明显改善APAV理化性质,降低GA的生物毒性,有利于提高组织相和血液相容性。第二部分环氧氯丙烷联合RGD对去细胞猪主动脉瓣修饰的实验研究。目的研究含RGD肽表面修饰的去细胞瓣对细胞粘附性的影响。方法各不同处理去细胞瓣组与YGRGDSP肽反应,通过茚叁酮法、荧光标记显示法比较各组的结合率。种植大鼠主动脉MFBs,沉淀法检测细胞粘附率。结果茚叁酮、荧光显像法各组对比显示多肽可很好的交联到EC、GE组,最佳反应条件为:室温,1.5mg/ml RGD、pH7.4、持续振荡12h。经RGD肽修饰的EC、GE组细胞粘附率较单纯APAV显着提高。结论利用EC,可将YGRGDSP肽以共价接枝的方式固定到去细胞猪主动脉瓣支架进行表面修饰,EC联合RGD肽表面修饰去细胞瓣可显着改善细胞粘附性。(本文来源于《第四军医大学》期刊2008-05-01）
周华松,顾春虎,陈文生,赵金超,王云雅[9]（2007）在《去细胞猪主动脉瓣的制备》一文中研究指出目的：完全去除猪主动脉瓣的细胞,制备成去细胞猪瓣支架。方法：采用胰酶+TritonX-100制备去细胞猪瓣支架,标本进行形态、组织结构观察,并进行 DNA 含量和力学强度测定。以新鲜猪瓣为对照将去细胞瓣叶家兔皮下埋藏4周后分别取材,光镜进行检查。(本文来源于《中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册》期刊2007-11-01）
顾春虎,王云雅,易定华,张近宝,刘维永[10]（2006）在《猪主动脉瓣去细胞基质的制备》一文中研究指出目的完全去除猪主动脉瓣细胞,取得良好的去细胞支架材料。方法用5 g/L胰酶对标本中的某些基质和细胞加以消化后,再应用不同去垢剂(十二烷基硫酸钠、脱氧胆脂酸钠、Triton X-100)加以洗脱,结合溶液渗透压改变等去除猪主动脉瓣细胞;标本进行大体、光镜、电镜观察和热皱缩温度的检测。结果胆脂酸钠无法完全脱除猪主动脉瓣细胞,十二烷基硫酸钠和曲拉通均可完全去除猪主动脉瓣细胞,Triton X-100组的主动脉瓣胶原纤维和弹性纤维得以较好保持。结论Triton X-100可以成功脱除猪主动脉瓣细胞,为组织工程瓣膜的研究提供材料。(本文来源于《心脏杂志》期刊2006年05期）
去细胞猪主动脉瓣论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的研究RGD肽(精-甘-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)表面修饰的去细胞瓣对细胞黏附性的影响。方法采用胰蛋白酶+TritonX-100法制备去细胞猪主动脉瓣(acellularized porcine aortic vavle,APAV),并用环氧氯丙烷(EC组)、戊二醛+环氧氯丙烷(GE组)以及再分别用RGD肽修饰(EC+RGD组、GE+RGD组)的各不同处理去细胞瓣组,与YGRGDSP肽(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)反应,通过茚叁酮法、荧光标记显示法比较各组的结合率。种植大鼠主动脉肌成纤维细胞(MFBs),沉淀法检测细胞黏附率。结果茚叁酮显示多肽可很好的交联到EC、GE组,最佳反应条件为:室温,1.5 mg/mL RGD、pH7.4、持续振荡12 h。经RGD肽修饰的EC、GE组细胞黏附率较单纯APAV提高(P<0.05)。结论利用EC,可将YGRGDSP肽以共价接枝的方式固定到APAV支架进行表面修饰,EC联合RGD肽表面修饰去细胞瓣可显着改善细胞黏附性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
去细胞猪主动脉瓣论文参考文献
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[5].周华松,顾春虎,陈文生,赵金超,王云雅.去细胞猪主动脉瓣的制备[J].南方医科大学学报.2009
[6].刘洋,孙国成,刘珊珊,谭红梅,欧阳辉.染料介导光氧化处理去细胞猪主动脉瓣的生物学特性[J].中国胸心血管外科临床杂志.2008
[7].马浩.成人骨髓间充质干细胞和脱细胞猪主动脉瓣构建组织工程化人工心脏瓣膜的实验室研究[D].中国协和医科大学.2008
[8].周华松.去细胞猪主动脉瓣RGD表面修饰促进细胞粘附的实验研究[D].第四军医大学.2008
[9].周华松,顾春虎,陈文生,赵金超,王云雅.去细胞猪主动脉瓣的制备[C].中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册.2007
[10].顾春虎,王云雅,易定华,张近宝,刘维永.猪主动脉瓣去细胞基质的制备[J].心脏杂志.2006