导读:本文包含了免疫球蛋白样结构域论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域,CD155,结直肠癌,免疫组织化学染色
免疫球蛋白样结构域论文文献综述
王伟杰,彭根远,姜韬,张宁妹,李海[1]（2019）在《T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域在结直肠癌中的表达及意义》一文中研究指出目的:研究T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)在结直肠癌中的表达及临床意义。方法:选择2016年1月～2018年6月于宁夏医科大学总医院就诊的80例结直肠癌患者,采用免疫组织化学染色法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中TIGIT和CD155的表达,同时结合Western blot法和ELISA检测肿瘤组织和癌旁正常组织中TIGIT和CD155的表达水平。结果:TIGIT和CD155在结直肠癌组织中阳性表达率分别为78.8%(63/80)和83.8%(67/80),明显高于癌旁正常组织的表达率[分别为8.8%(7/80)和18.8%(15/80)](P<0.05)。肿瘤组织中TIGIT和CD155的表达呈正相关(r=0.867,P<0.01),且随着分期增高,TIGIT和CD155的表达水平增高。结直肠癌组织中TIGIT和CD155的阳性表达率与肿瘤分化程度、病理分期及淋巴结转移具有相关性(P<0.05)。结论:TIGIT及CD155与结直肠癌的发生和发展具有相关性,可以作为评估结直肠癌预后的指标之一。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2019年11期）
邹雪青[2]（2018）在《关于包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1的抑癌因子作用及其机制的研究》一文中研究指出研究背景与目的对肿瘤的发病,进展机制及其治疗的研究已有数十年时间,人们对于肿瘤的认知由宏观到微观,由细胞到分子,由信号通路到基因调控,越来越多的证据证明肿瘤的发生与基因调控密切相关,目前的主流观点认为:肿瘤本质上是一种基因疾病。肿瘤的发生与发展是一个多步骤逐渐演进的过程,而整个过程的核心步骤就是致癌基因获得功能性突变以及抑癌基因去功能性突变的发生。抑癌基因(tumor suppressor genes)是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用,它与致癌基因相互制约,维持正负调节信号的相对稳定。而近年来关于肿瘤的机制尤其治疗方面的研究热点多集中于致癌基因,其中许多研究成果已经投入实际临床应用,如格列卫等靶向药物,已经取得了一定的临床治疗效果,而针对抑癌基因的研究较少,目前仅有少量研究处于向治疗转化的摸索阶段。我们认为,在肿瘤研究领域,如果想要取得更进一步的研究进展,关于抑癌基因的研究更加需要我们的投入和关注。包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白(Transmembrane and immunoglobulin domain containing,TMIGD)家族是由本人所在实验室新发现的一类包含免疫球蛋白(Ig)结构域的细胞表面黏附分子(Immunoglobulin-like cell adhesion proteins,Ig-CAMs)。TMIGD蛋白是一种细胞表面糖蛋白,由包含一个或多个免疫球蛋白样结构域的胞外段,一个单次跨膜结构域,以及C端胞内段叁部分组成。目前该家族已发现的蛋白成员共有3个。TMIGD家族的第一位成员也是由本人所在实验室发现,我们称之为包含免疫球蛋白结构域的富脯氨酸受体-1(Ig containing and proline-rich receptor-1,IGPR-1,也称为 TMIGD2)。IGPR-1 在内皮细胞中的表达主要调控细胞间黏附,细胞的屏障功能以及血管新生,并且最近我们还发现了其具有一定的促进肿瘤细胞生长的作用。最近该家族的第叁个成员——包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白 3(transmembrane and immunoglobulin(Ig)domain containing 3,TMIGD3)也被发现。Swathi及他的研究团队在他们的研究中发现TMIGD3在骨肉瘤中可以发挥肿瘤抑制因子的作用,并通过抑制PKA-Akt-NF-kB通路的激活,抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移侵袭以及其对外界不良条件刺激的耐受能力。TMIGD1是本课题组发现的TMIGD蛋白家族的第二个成员,该蛋白编码序列位于17号染色体,由7个外显子编码262个氨基酸。此前我们发现,IGPR-1在人类及其他种类动物中有表达,但在小鼠基因组中没有表达,而TMIGD1蛋白在人类及小鼠基因组中均有表达,且氨基酸序列具有高度的同源性。TMIGD1蛋白的胞外结构域包含两个免疫球蛋白样结构域,随后为单次跨膜结构域及一个很短的胞内结构域。而TMIGD1与IGPR-1的一项主要不同点就是TMIGD1的胞内结构域明显较短,且不含有类似IGPR-1的脯氨酸富集段。此外,TMIGD1的胞外段含有两个免疫球蛋白样结构域,而IGPR-1只含有一个。在具体组织中,TMIGD1在人类及小鼠的肾脏组织中高表达,主要表达于近端小管与远端小管上皮细胞中,而在足细胞中未测及表达。TMIGD1在脑,胃,小肠及结肠上皮组织中也有一定程度的表达,而在其他组织中的表达明显低于以上组织。前期研究中我们发现,TMIGD1通过其免疫球蛋白样结构域在细胞间形成同源二聚体,进而介导细胞间的黏附作用。过表达TMIGD1的HEK293细胞在细胞黏附实验中能够形成更大的细胞团,而将其与转染空质粒的细胞混合后可明显减少大细胞团块的形成。此外,过表达TMIGD1可使细胞的跨膜电阻(Trans Epithellal Electric Resistance,TEER)升高,胞膜通透性降低,使细胞内的肌动蛋白纤维向胞膜集中排列。在过表达TMIGD 1的HEK293细胞系中,细胞增殖及细胞迁移运动均明显受到抑制,而TMIGD1可明显增强肾上皮细胞对缺氧及营养缺乏的耐受性。在小鼠肾动脉高压及缺血再灌注损伤模型中,TMIGD1在损伤后均呈一过性表达上调。综合上述发现,TMIGD1作为Ig-CAM,能够通过其胞外段与不同配体相互结合,形成连接结构以稳定细胞膜结构,进而强化细胞膜以及细胞所组成上皮结构的屏障功能,限制肾小管上皮细胞的增殖及运动,同时起到增强肾上皮细胞对环境不利因素抗性的作用。此外,我们还发现TMIGD1在多种肿瘤细胞中表达下调。综合此前研究发现,我们推测TMIGD1在肿瘤细胞中有可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。由于TMIGD1在肾脏组织中的表达明显高于其他组织,且TMIGD1在肾脏恶性肿瘤细胞系中表达均有所降低,加之TMIGD1在肾上皮细胞中的保护作用已经在此前研究中被证实。因此在本研究中,我们首先选取肾癌细胞系,研究TMIGD1在肿瘤细胞中的表达情况及其所发挥的作用,并通过ActiveSignal Assay检测探寻TMIGD1发挥作用所调控的信号通路,通过LASAGNA-Search 2.0启动子活性分析技术研究TMIGD1表达调控的机制;由于TMIGD1在胃,小肠,结肠等消化道上皮组织中也有较高的表达,因此我们选取结肠癌细胞,在其中进一步验证TMIGD1的抗肿瘤作用,并通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进一步探寻与 TMIGD1 相互作用的上下游信号分子,证明其肿瘤抑制因子的作用并尝试阐明其发挥作用的机制,为TMIGD1作为临床肿瘤早期诊断标志物提供参考和依据,为其在未来应用于抑癌因子靶向治疗提供思路和启发。第一部分 包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过调控p21Cip1/p27Kip1在肾癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.提取人类及小鼠各类组织中mRNA及蛋白,通过qPCR及western blot检测TMIGD1在人类及小鼠各类正常组织中的表达情况。对正常肾脏组织切片进行免疫组化染色,观察TMIGD1在肾脏组织中的表达情况。通过对TCGA肾细胞癌数据库数据进行收集分析,分析肾细胞癌组织中TMIGD1表达情况。通过qPCR及western blot对人类肾癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。对临床肾癌病例组织切片进行免疫组化染色分析其中TMIGD1表达情况的变化。2.通过逆转录病毒在肾癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后肾癌细胞形态变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后肾癌细胞增殖能力变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后肾癌细胞成瘤能力的差别。通过体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验分析转染TMIGD1后肾癌细胞迁移侵袭能力的变化。3.利用Active Signal Assay分析检测转染TMIGD1后肾癌细胞内各肿瘤相关信号通路的变化情况。并通过western blot对检测结果进行验证。4.利用LASAGNA-Search 2.0系统预测TMIGD1可能相关的转录因子,并通过电泳迁移率变动分析实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)验证预测所得的转录因子是否能够与TMIGD1的启动子序列物理结合。通过启动子活性检测技术检测分析所得转录因子是否能够上调TMIGD1的表达。5.分别检测分析所得转录因子在肾癌细胞系及肾癌病理组织切片中的表达情况,并与组织中TMIGD1的表达情况进行类比分析。在肾癌细胞系中过表达上述转录因子,通过qPCR及western blot检测TMIGD1表达情况变化。通过分枝化形态发生实验检测转染转录因子后,肿瘤细胞恶性生物学行为的变化。结果1.在人类组织芯片中,TMIGD1的mRNA水平在肾脏组织中最高,其次为脑组织,然而包括脑组织在内,TMIGD1的mRNA在卵巢,心脏,血管,肺,肝脏,胰腺,骨髓以及皮肤等其他组织中的表达水平均明显低于肾脏。Western blot结果与qPCR结果基本一致。在小鼠组织中的表达情况与人类组织相似,肾脏组织中TMIGD1 mRNA 水平明显高于其他组织,另外在胃,肠道以及唾液腺组织中也有测及,但低于肾脏组织。正常肾脏组织切片免疫组化染色显示TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,而足细胞无表达。在网络数据库搜集的病例样本中,肾乳头细胞癌占293例,嫌色细胞癌66例,透明细胞癌499例,对所有收集病例进行分析显示TMIGD1在肾癌中表达均下调。在所检测人类肾癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平均明显低于正常肾脏组织。在所检测的24例肾癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正组织及良性肾脏疾病组织。2.在人肾癌细胞系786-0细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色显示细胞形态发生变化,且肌动蛋白排布方式呈现非对称型,细胞出现极性,伪足装结构减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后786-0细胞增殖明显减慢。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,786-0细胞成瘤能力明显降低。体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验结构显示转染TMIGD1后,786-0细胞迁移侵袭能力受到明显抑制。3.通过Active Signal Assay分析检测平台对转染TMIGD1的肾癌细胞系786-0内的20余条肿瘤相关信号通路,70余种蛋白的变化情况进行分析。发现受到TMIGD1影响的蛋白主要与细胞周期及细胞增殖信号通路相关。其中上调最显着的为p21CIP1蛋白与p27KIPI蛋白。此外,TMIGD1还可减低周期蛋白D1(CyclinD 1)以及周期蛋白依赖激酶 1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1/Cdc2)的磷酸化,并可以促进视网膜瘤蛋白(Rb)以及p38MAPK(MAPK14)的磷酸化。加用p38MAPK抑制剂SB203580后,上述过表达TMIGD1后出现的细胞信号因子改变均被逆转。4.将TMIGD1编码区上游1241对碱基序列克隆入绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒Zgreen中后,转染HEK-293细胞,转染TMIGD1上游序列的细胞系表现出9%转录激活强度,转录对照组质粒的HEK293细胞表现出49.8%转录激活强度。利用LASAGNA-Search 2.0系统对TMIGD1上游非编码区碱基序列进行预测分析,系统提示该段序列内含有多个CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein,C/EBP)结合位点,推测 C/EBP β可能为调控TMIGD1的潜在转录因子。通过电泳迁移率变动分析实验(EMSA),证明C/EBPβ能够与TMIGDI上游核酸序列物理结合。将C/EBPβ激活形式肝脏激活蛋白(Liver Activating Protein,LAP)与启动子活性检测质粒共同转染入HEK-293细胞后,荧光强度增强90%。将C/EBP β灭活形式肝脏抑制蛋白(Liver Inhibiting protein,LIP)与启动子活性检测质粒共同转染后,荧光强度受到抑制。5.Western blot结果显示,在人类肾癌细胞系786-0,DLD1以及TK10中,LAP与TMIGD1表达均极低或无法测及,而在正常人肾小管上皮细胞中二者均呈阳性表达。在人类肾癌组织切片中,肿瘤组织区域LAP及TMIGD1的表达均明显降低,而肿瘤周围正常组织二者均呈阳性表达。且二者的表达减低具有明显相关性。在786-0中转染过表达LAP后,qPCR及western blot结果均显示TMIGD1表达上调。且分枝化形态发生实验结果显示,转染LAP后,786-0细胞分枝化结构明显减少。结论1.TMIGD1在人类及小鼠组织中以肾脏组织表达最高,其次为脑及消化道上皮组织。在正常肾脏组织中,,TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,足细胞无TMIGD1表达。TMIGD1在肾癌组织及细胞中表达均明显降低。2.TMIGD1可改变肾癌细胞内肌动蛋白的排列方式,抑制肾癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1通过促进p38磷酸化,及一系列信号传导,最终起到抑制肾癌细胞恶性生物学行为的作用。4.C/EBPβ通过与TMIGD1上游非编码区的结合位点直接结合,调控TMIGD1的表达,其激活形式LAP可显着上调TMIGD1表达,而其抑制形式LIP可明显抑制TMIGD1的表达。5.C/EBPβ通过调控肾癌细胞中TMIGD1的表达情况,调控肾癌细胞的恶性生物学行为。第二部分包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过抑制CYR61在结肠癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.通过对TCGA结肠癌数据库数据进行收集分析,分析结肠癌组织中TMIGD1表达情况。收集临床结肠癌病理组织,对病理切片进行免疫组化染色,对比癌组织与周围正常组织间TMIGD1染色情况。通过qPCR及western blot对人类结肠癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。2.使用逆转录病毒在结肠癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后结肠癌细胞的形态及排布方式变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析转染TMIGD1后结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞成瘤能力的变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后结肠癌细胞体外成瘤能力的差别。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系中通过western blot检测p38,p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的表达或磷酸化情况,以及加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后各蛋白的变化情况。通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。4.在结肠癌细胞中过表达C/EBPβ(LAP),通过western blot检测LAP及TMIGD1的表达情况,并通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。5.将TMIGD1胞外段序列克隆入pGEX质粒中,转化工程菌后生产GST-E-TMIGD1融合蛋白,进行GST-pulldown实验,所得样品经SDS凝胶电泳后通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行检测分析,寻找可能存在的TMIGD1胞外段配体。将分析所得配体与TMIGD1共同转染结肠癌细胞,通过GST-pulldown及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白是否能够直接结合。合成配体蛋白各结构域GST融合蛋白,探究TMIGD1与其结合的具体结构域。6.分别干预配体蛋白与TMIGD1的表达,利用各组细胞进行MTT及BrdU细胞增殖实验比较各组结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析比较各组结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较各组细胞成瘤能力的变化。给予不同浓度外源性配体蛋白刺激,观察转染TMIGD1前后细胞对不同浓度外源性配体蛋白刺激反应的变化。结果1.对网络数据库中入组的195例结肠癌病例分析结果显示,TMIGD1 mRNA水平在入组结肠癌病例中明显降低。在所检测人类结肠癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平较正常上皮细胞均明显减低。在所检测的43例结肠癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正常组织。2.在人结肠癌细胞系RKO,HCT116细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色结果显示,表达TMIGD1的HCT116及RKO细胞,细胞形态更加规则,在相似密度下表达TMIGD1的细胞较对照组细胞形成较少的细胞间连接,尤其通过伪足状结构形成的细胞间连接明显减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞的增殖明显受到抑制。Transwell及集落形成实验结果显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞系RKO及HCT116的迁移侵袭及体外成瘤能力受到明显抑制。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,RKO及HCT116细胞的体外成瘤能力明显降低。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系RKO中,western blot结果显示p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的量升高,p38表达量未见明显变化,加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后,此前p-Rb,p21CIP1,p27KIP1的升高被逆转,p-p38与p38无明显变化。MTT增殖实验结果显示,SB203580对未转染TMIGD1的结肠癌细胞RKO的增殖能力无明显影响,转染TMIGD1后,SB203580处理RKO细胞可明显逆转由转染TMIGD1所引起的细胞增殖能力下降。4.在结肠癌细胞RKO中过表达C/EBPβ(LAP)后,western blot检测结果显示LAP及TMIGD1的表达均上调,MTT增殖实验显示转染LAP的结肠癌细胞RKO增殖能力受到明显抑制。5.对GST-pulldown实验样品进行LC-MS/MS质谱分析,所得结果提示富半胱氨酸蛋白 61(cysteine rich angiogenic inducer 61,CYR61/CCNI)有可能为TMIGD1的胞外配体。将CYR61与TMIGD1共同转染结肠癌细胞HCT116,通过GST-pulldown实验及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白能够直接相互结合。分别合成CYR61四个不同结构的GST融合蛋白,并通过GST-pulldown实验证实CYR61通过第二个结构域,即假性血友病因子样结构域(Von Willebrand Factor-likemodule,VWC)与 TMIGD1 胞外段相互结合。6.单独干扰CYR61表达后,HCT116及RKO细胞的各类恶性生物学行为均有一定程度减低,而在过表达TMIGD1后,结肠癌细胞如之前实验,其增殖,迁移侵袭以及成瘤能力能力均受到抑制,而此时再干扰CYR61的表达对结肠癌细胞的各项恶性生物学行为并无进一步抑制作用。在过表达TMIGD1并干扰CYR61表达的RKO细胞系中,给予不同浓度的外源性CYR61刺激,两组细胞的增殖能力呈现错峰式上升。结论1.TMIGD1在结肠癌细胞系及结肠癌病理组织中表达均减低。2.TMIGD1能够抑制结肠癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1胞外段能够特异性地与CYR61蛋白的VWC结构域结合,抑制CYR61促进结肠癌细胞各项恶性生物学行为的作用。意义1.首次发现了 TMIGD1蛋白在肾癌及结肠癌细胞中能够抑制肿瘤细胞的增殖,成瘤以及迁移侵袭等恶性生物学行为的作用,明确了其作为抑癌因子的价值;2.阐明了 TMIGD1在肾癌细胞中通过促进p38磷酸化,进而调控CyclinD1,Rb,p21CIP1以及p27KIP1等信号分子,最终调控肾癌细胞恶性生物学行为的作用机制;发现了 C/EBPβ作为上游转录因子调控TMIGD1的表达;证明了TMIGD1在结肠癌细胞中可通过其胞外段与CYR61蛋白结合,进而抑制CYR61蛋白的促癌作用,发挥肿瘤抑制因子的作用;3.首次证实TMIGD1肿瘤抑制因子的作用,并初步阐明了其发挥作用的机制,证明TMIGD1具有作为抑癌因子用作临床肿瘤早期诊断标志物的潜在价值,其抑癌作用也可以为临床恶性肿瘤的靶向治疗提供参考和思路。(本文来源于《山东大学》期刊2018-04-02）
周林裕,包春燕,胡骁,代永庆,包志军[3]（2018）在《富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)增强顺铂诱导的人垂体瘤细胞凋亡》一文中研究指出目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白结构域1(LRIG1)在人垂体瘤组织中表达情况,并观察过表达LRIG1后对顺铂(DDP)诱导的垂体瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法采用免疫组织化学染色法检测45例垂体瘤患者肿瘤组织及瘤旁组织中的LRIG1表达,分析LRIG1阳性表达与患者临床病理指标的相关性。选取原代分离培养的人垂体瘤细胞,采用脂质体介导的基因转染技术将LRIG1基因过表达质粒p EGFP-N1-LRIG1转染进细胞中,筛选LRIG1过表达的细胞,同时选取转染空质粒p EGFP-N1的细胞作为对照组。两组细胞均经20μg/m L DDP诱导48 h,流式细胞术检测细胞凋亡情况,平板克隆实验检测细胞的增殖能力,Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白BAX、胱天蛋白酶3(caspase-3)和Bcl2的相对表达量。结果垂体瘤患者肿瘤组织中LRIG1阳性率显着低于瘤旁组织,且LRIG1在侵袭性肿瘤表达显着降低。与对照组相比,过表达LRIG1后,DDP诱导的细胞凋亡率显着增加、细胞增殖显着降低、BAX、caspase-3的水平显着增加,而Bcl2水平显着降低。结论过表达LRIG1增加DDP诱导的人垂体瘤细胞凋亡并抑制其增殖。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2018年01期）
吴莉莉,祁培培,章萍萍,王锦红,张婧[4]（2013）在《人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选》一文中研究指出目的使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点。方法通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G(SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建由该6个片段随机组合的噬菌体展示文库。再分别使用人和羊IgG对文库进行体外亲和筛选,以期能够获得具有特异优势结合能力的组合分子,并在Phage ELISA的水平上进一步验证筛选结果。结果成功构建了符合进行体外进化筛选要求的噬菌体展示单结合结构域随机组合文库后,经过6轮人IgG诱导筛选,文库的展示片段大小统一为3个结构域组合分子,E-B-B3;经过6轮羊IgG诱导筛选,文库的展示片段大小也统一为4个结构域组合分子,D-A-B3-B3。Phage ELISA进一步验证最终组合序列的对人和羊IgG的结合能力。结论首次得到两种天然SpA、SpG分子中不存在的,且分别特异地与人和羊IgG具有强结合作用的新型组合分子E-B-B3、D-A-B3-B3,在人和羊IgG的纯化和检测具有很大的应用前景。(本文来源于《安徽医科大学学报》期刊2013年08期）
吴莉莉[5]（2013）在《人和羊IgG诱导细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合噬菌体文库不同的体外进化结果》一文中研究指出金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)和链球菌蛋白G(streptococcal protein G，SpG)是细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin (Ig)-binding proteins, IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多个的序列高度同源的结合结构域重复组成的抗体结合区，各单结构域都具有完全的结合IgG的功能。本研究构建了两个由SpA和SpG各单结构域随机组成的噬菌体展示文库，通过人和羊IgG对这两个文库进行亲和筛选，以期能够获得对人和羊IgG具有特异优势结合能力的组合分子。使用PCR扩增法制备SPA(A、B、C、E)、SPG(B2、B3)以及SPA(A、B、、D、E)、SPG(B2、B3)各结构域核苷酸片段，在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基，同时在3’端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列，经XbaⅠ酶消化各结构域核苷酸片段，在LH连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S,并转化TG1细胞，经M13K07辅助噬菌体拯救，得到Ig结合分子单结构域随机组合噬菌体展示文库。用人和羊IgG同时对两个文库进行亲和筛选，每一轮筛选后均随机挑选单克隆进行PCR鉴定，检测片段插入的大小分布情况，以评价筛选有效性;同时对筛选后文库中的单克隆进行序列测定，获得展示序列终单结构域的排列组合情况。筛选结果统一后，制备最终得到的各特异优势组合分子的单克隆噬菌体，通过噬菌体ELISA的方法来比较其与人和羊IgG的结合特性。本研究成功构建了噬菌体展示SpA （A、B、C、E）、 SpG B2、B3）（库C）以及SpA（A、B、D、E）、SpG（B2、B3）（库D）共六个单结合结构域随机组合文库。其中单结构域随机组合文库库C的库容为8.5×10~6，噬菌体库滴度为1.82×1012TU/Ml，PCR鉴定阳性片段插入率为78%（其中1个domain的组合占50%；2个domain的组合占16.7%；3个及3个以上domain的组合占8%）；库D的库容为8.1×10~6，噬菌体库滴度为1.69×10~(12)TU/Ml，PCR鉴定阳性片段插入率为72%（1个domain的组合占40%；2个domain的组合占19.4%；3个及3个以上domain组合，占9.5%）。测序结果显示，各单结构域组合情况、正反向插入情况、连接肽均呈现随机分布，所建文库符合进行体外进化筛选要求。筛选最均获得了SpA天然分子中不存在的单结构域排列组合分子，库C经过人IgG诱导四轮筛选后，片段大小统一为2个domain，测序分析后组合为A-C，库C经过羊IgG诱导六轮筛选后，片段大小统一为2个domain，测序分析后组合为A-B3。库D经过人IgG诱导六轮筛选后，片段大小统一为3个domain，测序分析后组合为E-B-B3，库D经过羊IgG诱导六轮筛选后，片段大小统一为4个domain，测序分析后组合为D-A-B3-B3。噬菌体ELISA进一步证实库C得到的组合分子A-C对人IgG的结合能力高于组合分子A-B3，而组合分子A-C对羊IgG的结合能力低于于组合分子A-B3，与筛选结果完全吻合;然而，与库C筛选结果不同的是，库D得到的组合分子D-A-B3-B3对人和羊IgG的结合能力都高于组合分子E-B-B3，未显示出抗体结合的特异性。本研究成功使用人和羊IgG诱导细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合噬菌体文库完成体外进化筛选，分别获得到了与人和羊IgG具有不同结合优势的新型组合分子A-C、A-B3、E-B-B3、D-A-B3-B3，其中只有库C得到的新型组合分子分别与人和羊IgG具有特异性结合能力。本研究还可为细菌IBP结构功能以及IgG的Fc段结合分子的进一步研究提供新的手段；并为IgG的纯化、制备、检测提供了新的应用前景。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2013-04-01）
周亚丽,劳兴珍,袁玲,柳萌,郑珩[6]（2012）在《免疫球蛋白结合结构域的研究进展》一文中研究指出Z结构域,又叫免疫球蛋白结合结构域,是由金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A,SPA)中B结构域改构而成。SPA是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的能与多种哺乳动物的抗体相结合的天然蛋白,组成SPA的5个结构域中,以B结构域的抗体结合力及稳定性占绝对优势。将B结构域28～29位敏感性残基Asn-Gly定向诱变成为Asn-Ala后,得到的结构域被称为Z结构域,其稳定性更高,可耐受羟铵和溴化氢的处理。首尾相连的两个Z结构域,被命名为ZZ结构域,具有与SPA相类似的抗体结合容量以及更高的稳定性,可以耐受工业纯化中苛刻的环境。ZZ结构域以其独特的反3α螺旋结构、以及特有的抗体结合能力已广泛应用于外源蛋白的可溶表达及免疫检测、抗体纯化等领域。该文将对ZZ与抗体结合的机制研究以及它在各领域的应用研究进行综述。(本文来源于《药物生物技术》期刊2012年03期）
苏林,刘长征,邓艳春,杨克恭,梁植权[7]（2006）在《人干细胞因子受体膜外区1~3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性》一文中研究指出目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1~3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1~3),研究其配体结合活性。方法采用重迭延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1~3双突变片段(c-Kit/Ig1~3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1~3DM表达质粒,转化E·coliBL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化。将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1~3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293ET细胞构建c-kit/Ig1~3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白。His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性。结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1~3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低。在HEK293ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1~3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1~3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9·39nmol/L。结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1~3融合蛋白。(本文来源于《中国医学科学院学报》期刊2006年02期）
杨华[8]（2005）在《噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建及体外分子进化》一文中研究指出目的:通过比较不同抗体分子导向的噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外分子进化筛选过程及筛选获得的重组Ig 结合分子的结构与功能,研究细菌免疫球蛋白结合分子结构与功能的关系,与Ig 相互作用的机制及体外重组进化的规律,为进一步应用分子进化手段改造功能蛋白积累经验。方法:分别以人IgG、IgM、IgA 及基因工程IgG1 Fc四种分子作为诱饵对由噬菌体展示的分别由0,1,2,3 个氨基酸随机连接肽相连的protein A 的D(PA-D)、A (PA-A)结构域、protein G 的B2 结构域(PG)及protein L B3 结构域(PL)随机组合文库进行3-4 轮体外分子进化筛选。分别选取不同抗体分子诱导获得的具有不同结构形式的8 种代表展示序列,克隆于表达载体PET32a(+),原核表达N 端带His-Tag 的融合蛋白,Ni-NTA 柱亲和层析纯化,Western Blot 及ELISA 检测其结合活性。结果:该组合文库在IgM、IgA 导向的进化过程中,出现了相似的变化,其展示序列进化成一共同的新的在天然细菌Ig 结合分子中不存在的结构形式PA -A—PL,该结构虽因连接肽序列不同产生6 种不同的序列,但这些序列倾向于(5/6)同时出现在IgM 和IgA 的进化文库中。由IgG 与IgGFc 所导向的进化相似,其展示序列也进化成一共同的新的结构形式PA-A—PG,也因连接肽序列不同出现6 种不同的序列,与IgM 和IgA 情况不同,6 种中仅1种同时出现于两种文库中,其余分别出现在各自的文库中。8 种代表展示序列原核表达的融合蛋白经鉴定证实具有不同的Ig 结合活性,与进化结果相似。结论:本研究首次将3 种不同的Ig 结合分子的代表单结构域随机组合构建噬菌体展示文库,并应用4 种不同的人Ig 分子对该组合文库进行体外分子进化筛选,获得了2 种新的在天然分子中不存在的Ig 结合分子结构形式,这些结构均由来自不同细菌Ig 结合分子的单结构域组成,提示不同特性的Ig 结合结构域间可形成结合互补优势;此外,研究还提示各结构域之间的连接肽序列对其Ig 结合功能存在重要影响。该研究为Ig 结合分子结构和功能的研究提供了一新的途径,也为Ig 结合分子的定向改造及具有新的Ig 结合特性的重组Ig 结合分子的获得奠定了基础。(本文来源于《山西医科大学》期刊2005-05-20）
杨华,李连青,王蓓霞,徐容,沈毅珺[9]（2005）在《噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的构建》一文中研究指出目的:构建由免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合的噬菌体展示文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选研究打下基础。方法:PCR扩增制备分别编码Protein A 的A、D结构域、Protein G的B2 结构域和Pro tein L的B3结构域的序列片段,片段两端引入XbaⅠ酶切位点,3′端引入分别编码0、1、2、3个氨基酸大小随机连接肽的序列,并克隆于pMD 18T载体构建重组质粒。以上述16种重组质粒为模板,PCR扩增分别制备各种单结构域片段及两端部分T载体序列,XbaⅠ酶切,各种酶切片段混合后连接,并克隆于噬菌体展示载体pCANTAB5S,构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,挑取单克隆进行序列测定,评价文库的随机性。结果:噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库库容量为2×107,滴度为1.3×1011;文库中含77%以上的阳性克隆,其中由2个以上单结构域组成的阳性克隆占24%;序列分析显示组合文库包含上述4种单结构域序列,连接方式符合随机连接的特点,随机连接肽的编码核酸也呈随机分布。结论:成功构建了免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库,该文库库容、多样性和随机性完全可满足进行体外分子进化研究的要求。(本文来源于《第二军医大学学报》期刊2005年04期）
免疫球蛋白样结构域论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景与目的对肿瘤的发病,进展机制及其治疗的研究已有数十年时间,人们对于肿瘤的认知由宏观到微观,由细胞到分子,由信号通路到基因调控,越来越多的证据证明肿瘤的发生与基因调控密切相关,目前的主流观点认为:肿瘤本质上是一种基因疾病。肿瘤的发生与发展是一个多步骤逐渐演进的过程,而整个过程的核心步骤就是致癌基因获得功能性突变以及抑癌基因去功能性突变的发生。抑癌基因(tumor suppressor genes)是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用,它与致癌基因相互制约,维持正负调节信号的相对稳定。而近年来关于肿瘤的机制尤其治疗方面的研究热点多集中于致癌基因,其中许多研究成果已经投入实际临床应用,如格列卫等靶向药物,已经取得了一定的临床治疗效果,而针对抑癌基因的研究较少,目前仅有少量研究处于向治疗转化的摸索阶段。我们认为,在肿瘤研究领域,如果想要取得更进一步的研究进展,关于抑癌基因的研究更加需要我们的投入和关注。包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白(Transmembrane and immunoglobulin domain containing,TMIGD)家族是由本人所在实验室新发现的一类包含免疫球蛋白(Ig)结构域的细胞表面黏附分子(Immunoglobulin-like cell adhesion proteins,Ig-CAMs)。TMIGD蛋白是一种细胞表面糖蛋白,由包含一个或多个免疫球蛋白样结构域的胞外段,一个单次跨膜结构域,以及C端胞内段叁部分组成。目前该家族已发现的蛋白成员共有3个。TMIGD家族的第一位成员也是由本人所在实验室发现,我们称之为包含免疫球蛋白结构域的富脯氨酸受体-1(Ig containing and proline-rich receptor-1,IGPR-1,也称为 TMIGD2)。IGPR-1 在内皮细胞中的表达主要调控细胞间黏附,细胞的屏障功能以及血管新生,并且最近我们还发现了其具有一定的促进肿瘤细胞生长的作用。最近该家族的第叁个成员——包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白 3(transmembrane and immunoglobulin(Ig)domain containing 3,TMIGD3)也被发现。Swathi及他的研究团队在他们的研究中发现TMIGD3在骨肉瘤中可以发挥肿瘤抑制因子的作用,并通过抑制PKA-Akt-NF-kB通路的激活,抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移侵袭以及其对外界不良条件刺激的耐受能力。TMIGD1是本课题组发现的TMIGD蛋白家族的第二个成员,该蛋白编码序列位于17号染色体,由7个外显子编码262个氨基酸。此前我们发现,IGPR-1在人类及其他种类动物中有表达,但在小鼠基因组中没有表达,而TMIGD1蛋白在人类及小鼠基因组中均有表达,且氨基酸序列具有高度的同源性。TMIGD1蛋白的胞外结构域包含两个免疫球蛋白样结构域,随后为单次跨膜结构域及一个很短的胞内结构域。而TMIGD1与IGPR-1的一项主要不同点就是TMIGD1的胞内结构域明显较短,且不含有类似IGPR-1的脯氨酸富集段。此外,TMIGD1的胞外段含有两个免疫球蛋白样结构域,而IGPR-1只含有一个。在具体组织中,TMIGD1在人类及小鼠的肾脏组织中高表达,主要表达于近端小管与远端小管上皮细胞中,而在足细胞中未测及表达。TMIGD1在脑,胃,小肠及结肠上皮组织中也有一定程度的表达,而在其他组织中的表达明显低于以上组织。前期研究中我们发现,TMIGD1通过其免疫球蛋白样结构域在细胞间形成同源二聚体,进而介导细胞间的黏附作用。过表达TMIGD1的HEK293细胞在细胞黏附实验中能够形成更大的细胞团,而将其与转染空质粒的细胞混合后可明显减少大细胞团块的形成。此外,过表达TMIGD1可使细胞的跨膜电阻(Trans Epithellal Electric Resistance,TEER)升高,胞膜通透性降低,使细胞内的肌动蛋白纤维向胞膜集中排列。在过表达TMIGD 1的HEK293细胞系中,细胞增殖及细胞迁移运动均明显受到抑制,而TMIGD1可明显增强肾上皮细胞对缺氧及营养缺乏的耐受性。在小鼠肾动脉高压及缺血再灌注损伤模型中,TMIGD1在损伤后均呈一过性表达上调。综合上述发现,TMIGD1作为Ig-CAM,能够通过其胞外段与不同配体相互结合,形成连接结构以稳定细胞膜结构,进而强化细胞膜以及细胞所组成上皮结构的屏障功能,限制肾小管上皮细胞的增殖及运动,同时起到增强肾上皮细胞对环境不利因素抗性的作用。此外,我们还发现TMIGD1在多种肿瘤细胞中表达下调。综合此前研究发现,我们推测TMIGD1在肿瘤细胞中有可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。由于TMIGD1在肾脏组织中的表达明显高于其他组织,且TMIGD1在肾脏恶性肿瘤细胞系中表达均有所降低,加之TMIGD1在肾上皮细胞中的保护作用已经在此前研究中被证实。因此在本研究中,我们首先选取肾癌细胞系,研究TMIGD1在肿瘤细胞中的表达情况及其所发挥的作用,并通过ActiveSignal Assay检测探寻TMIGD1发挥作用所调控的信号通路,通过LASAGNA-Search 2.0启动子活性分析技术研究TMIGD1表达调控的机制;由于TMIGD1在胃,小肠,结肠等消化道上皮组织中也有较高的表达,因此我们选取结肠癌细胞,在其中进一步验证TMIGD1的抗肿瘤作用,并通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进一步探寻与 TMIGD1 相互作用的上下游信号分子,证明其肿瘤抑制因子的作用并尝试阐明其发挥作用的机制,为TMIGD1作为临床肿瘤早期诊断标志物提供参考和依据,为其在未来应用于抑癌因子靶向治疗提供思路和启发。第一部分 包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过调控p21Cip1/p27Kip1在肾癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.提取人类及小鼠各类组织中mRNA及蛋白,通过qPCR及western blot检测TMIGD1在人类及小鼠各类正常组织中的表达情况。对正常肾脏组织切片进行免疫组化染色,观察TMIGD1在肾脏组织中的表达情况。通过对TCGA肾细胞癌数据库数据进行收集分析,分析肾细胞癌组织中TMIGD1表达情况。通过qPCR及western blot对人类肾癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。对临床肾癌病例组织切片进行免疫组化染色分析其中TMIGD1表达情况的变化。2.通过逆转录病毒在肾癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后肾癌细胞形态变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后肾癌细胞增殖能力变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后肾癌细胞成瘤能力的差别。通过体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验分析转染TMIGD1后肾癌细胞迁移侵袭能力的变化。3.利用Active Signal Assay分析检测转染TMIGD1后肾癌细胞内各肿瘤相关信号通路的变化情况。并通过western blot对检测结果进行验证。4.利用LASAGNA-Search 2.0系统预测TMIGD1可能相关的转录因子,并通过电泳迁移率变动分析实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)验证预测所得的转录因子是否能够与TMIGD1的启动子序列物理结合。通过启动子活性检测技术检测分析所得转录因子是否能够上调TMIGD1的表达。5.分别检测分析所得转录因子在肾癌细胞系及肾癌病理组织切片中的表达情况,并与组织中TMIGD1的表达情况进行类比分析。在肾癌细胞系中过表达上述转录因子,通过qPCR及western blot检测TMIGD1表达情况变化。通过分枝化形态发生实验检测转染转录因子后,肿瘤细胞恶性生物学行为的变化。结果1.在人类组织芯片中,TMIGD1的mRNA水平在肾脏组织中最高,其次为脑组织,然而包括脑组织在内,TMIGD1的mRNA在卵巢,心脏,血管,肺,肝脏,胰腺,骨髓以及皮肤等其他组织中的表达水平均明显低于肾脏。Western blot结果与qPCR结果基本一致。在小鼠组织中的表达情况与人类组织相似,肾脏组织中TMIGD1 mRNA 水平明显高于其他组织,另外在胃,肠道以及唾液腺组织中也有测及,但低于肾脏组织。正常肾脏组织切片免疫组化染色显示TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,而足细胞无表达。在网络数据库搜集的病例样本中,肾乳头细胞癌占293例,嫌色细胞癌66例,透明细胞癌499例,对所有收集病例进行分析显示TMIGD1在肾癌中表达均下调。在所检测人类肾癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平均明显低于正常肾脏组织。在所检测的24例肾癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正组织及良性肾脏疾病组织。2.在人肾癌细胞系786-0细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色显示细胞形态发生变化,且肌动蛋白排布方式呈现非对称型,细胞出现极性,伪足装结构减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后786-0细胞增殖明显减慢。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,786-0细胞成瘤能力明显降低。体外3D分枝化形态发生实验及transwell实验结构显示转染TMIGD1后,786-0细胞迁移侵袭能力受到明显抑制。3.通过Active Signal Assay分析检测平台对转染TMIGD1的肾癌细胞系786-0内的20余条肿瘤相关信号通路,70余种蛋白的变化情况进行分析。发现受到TMIGD1影响的蛋白主要与细胞周期及细胞增殖信号通路相关。其中上调最显着的为p21CIP1蛋白与p27KIPI蛋白。此外,TMIGD1还可减低周期蛋白D1(CyclinD 1)以及周期蛋白依赖激酶 1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1/Cdc2)的磷酸化,并可以促进视网膜瘤蛋白(Rb)以及p38MAPK(MAPK14)的磷酸化。加用p38MAPK抑制剂SB203580后,上述过表达TMIGD1后出现的细胞信号因子改变均被逆转。4.将TMIGD1编码区上游1241对碱基序列克隆入绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒Zgreen中后,转染HEK-293细胞,转染TMIGD1上游序列的细胞系表现出9%转录激活强度,转录对照组质粒的HEK293细胞表现出49.8%转录激活强度。利用LASAGNA-Search 2.0系统对TMIGD1上游非编码区碱基序列进行预测分析,系统提示该段序列内含有多个CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein,C/EBP)结合位点,推测 C/EBP β可能为调控TMIGD1的潜在转录因子。通过电泳迁移率变动分析实验(EMSA),证明C/EBPβ能够与TMIGDI上游核酸序列物理结合。将C/EBPβ激活形式肝脏激活蛋白(Liver Activating Protein,LAP)与启动子活性检测质粒共同转染入HEK-293细胞后,荧光强度增强90%。将C/EBP β灭活形式肝脏抑制蛋白(Liver Inhibiting protein,LIP)与启动子活性检测质粒共同转染后,荧光强度受到抑制。5.Western blot结果显示,在人类肾癌细胞系786-0,DLD1以及TK10中,LAP与TMIGD1表达均极低或无法测及,而在正常人肾小管上皮细胞中二者均呈阳性表达。在人类肾癌组织切片中,肿瘤组织区域LAP及TMIGD1的表达均明显降低,而肿瘤周围正常组织二者均呈阳性表达。且二者的表达减低具有明显相关性。在786-0中转染过表达LAP后,qPCR及western blot结果均显示TMIGD1表达上调。且分枝化形态发生实验结果显示,转染LAP后,786-0细胞分枝化结构明显减少。结论1.TMIGD1在人类及小鼠组织中以肾脏组织表达最高,其次为脑及消化道上皮组织。在正常肾脏组织中,,TMIGD1主要表达于肾小管上皮细胞,足细胞无TMIGD1表达。TMIGD1在肾癌组织及细胞中表达均明显降低。2.TMIGD1可改变肾癌细胞内肌动蛋白的排列方式,抑制肾癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1通过促进p38磷酸化,及一系列信号传导,最终起到抑制肾癌细胞恶性生物学行为的作用。4.C/EBPβ通过与TMIGD1上游非编码区的结合位点直接结合,调控TMIGD1的表达,其激活形式LAP可显着上调TMIGD1表达,而其抑制形式LIP可明显抑制TMIGD1的表达。5.C/EBPβ通过调控肾癌细胞中TMIGD1的表达情况,调控肾癌细胞的恶性生物学行为。第二部分包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1通过抑制CYR61在结肠癌细胞中发挥抑癌因子作用及其机制的研究材料与方法1.通过对TCGA结肠癌数据库数据进行收集分析,分析结肠癌组织中TMIGD1表达情况。收集临床结肠癌病理组织,对病理切片进行免疫组化染色,对比癌组织与周围正常组织间TMIGD1染色情况。通过qPCR及western blot对人类结肠癌细胞系中TMIGD1表达情况进行检测。2.使用逆转录病毒在结肠癌细胞系中过表达TMIGD1,然后通过鬼笔环肽染色观察过表达TMIGD1后结肠癌细胞的形态及排布方式变化。通过MTT及BrdU细胞增殖实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析转染TMIGD1后结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较转染TMIGD1前后结肠癌细胞成瘤能力的变化。利用裸鼠皮下成瘤实验比较转染前后结肠癌细胞体外成瘤能力的差别。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系中通过western blot检测p38,p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的表达或磷酸化情况,以及加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后各蛋白的变化情况。通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。4.在结肠癌细胞中过表达C/EBPβ(LAP),通过western blot检测LAP及TMIGD1的表达情况,并通过MTT增殖实验检测各组细胞增殖能力的变化情况。5.将TMIGD1胞外段序列克隆入pGEX质粒中,转化工程菌后生产GST-E-TMIGD1融合蛋白,进行GST-pulldown实验,所得样品经SDS凝胶电泳后通过液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行检测分析,寻找可能存在的TMIGD1胞外段配体。将分析所得配体与TMIGD1共同转染结肠癌细胞,通过GST-pulldown及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白是否能够直接结合。合成配体蛋白各结构域GST融合蛋白,探究TMIGD1与其结合的具体结构域。6.分别干预配体蛋白与TMIGD1的表达,利用各组细胞进行MTT及BrdU细胞增殖实验比较各组结肠癌细胞增殖能力变化。通过transwell实验分析比较各组结肠癌细胞迁移侵袭能力的变化。通过集落形成实验比较各组细胞成瘤能力的变化。给予不同浓度外源性配体蛋白刺激,观察转染TMIGD1前后细胞对不同浓度外源性配体蛋白刺激反应的变化。结果1.对网络数据库中入组的195例结肠癌病例分析结果显示,TMIGD1 mRNA水平在入组结肠癌病例中明显降低。在所检测人类结肠癌细胞系中,TMIGD1 mRNA及蛋白水平较正常上皮细胞均明显减低。在所检测的43例结肠癌病理切片中,TMIGD1在恶性肿瘤组织中的染色明显低于周围正常组织。2.在人结肠癌细胞系RKO,HCT116细胞中过表达TMIGD1后,鬼笔环肽染色结果显示,表达TMIGD1的HCT116及RKO细胞,细胞形态更加规则,在相似密度下表达TMIGD1的细胞较对照组细胞形成较少的细胞间连接,尤其通过伪足状结构形成的细胞间连接明显减少。MTT及BrdU增殖实验显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞的增殖明显受到抑制。Transwell及集落形成实验结果显示转染TMIGD1后,结肠癌细胞系RKO及HCT116的迁移侵袭及体外成瘤能力受到明显抑制。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染TMIGD1后,RKO及HCT116细胞的体外成瘤能力明显降低。3.在过表达TMIGD1的结肠癌细胞系RKO中,western blot结果显示p-p38,p-Rb,p21CIP1,p27KIP1蛋白的量升高,p38表达量未见明显变化,加用p38MAPK抑制剂SB203580处理后,此前p-Rb,p21CIP1,p27KIP1的升高被逆转,p-p38与p38无明显变化。MTT增殖实验结果显示,SB203580对未转染TMIGD1的结肠癌细胞RKO的增殖能力无明显影响,转染TMIGD1后,SB203580处理RKO细胞可明显逆转由转染TMIGD1所引起的细胞增殖能力下降。4.在结肠癌细胞RKO中过表达C/EBPβ(LAP)后,western blot检测结果显示LAP及TMIGD1的表达均上调,MTT增殖实验显示转染LAP的结肠癌细胞RKO增殖能力受到明显抑制。5.对GST-pulldown实验样品进行LC-MS/MS质谱分析,所得结果提示富半胱氨酸蛋白 61(cysteine rich angiogenic inducer 61,CYR61/CCNI)有可能为TMIGD1的胞外配体。将CYR61与TMIGD1共同转染结肠癌细胞HCT116,通过GST-pulldown实验及双向免疫共沉淀实验验证两种蛋白能够直接相互结合。分别合成CYR61四个不同结构的GST融合蛋白,并通过GST-pulldown实验证实CYR61通过第二个结构域,即假性血友病因子样结构域(Von Willebrand Factor-likemodule,VWC)与 TMIGD1 胞外段相互结合。6.单独干扰CYR61表达后,HCT116及RKO细胞的各类恶性生物学行为均有一定程度减低,而在过表达TMIGD1后,结肠癌细胞如之前实验,其增殖,迁移侵袭以及成瘤能力能力均受到抑制,而此时再干扰CYR61的表达对结肠癌细胞的各项恶性生物学行为并无进一步抑制作用。在过表达TMIGD1并干扰CYR61表达的RKO细胞系中,给予不同浓度的外源性CYR61刺激,两组细胞的增殖能力呈现错峰式上升。结论1.TMIGD1在结肠癌细胞系及结肠癌病理组织中表达均减低。2.TMIGD1能够抑制结肠癌细胞的增殖,肿瘤形成以及迁移侵袭等恶性生物学行为。3.TMIGD1胞外段能够特异性地与CYR61蛋白的VWC结构域结合,抑制CYR61促进结肠癌细胞各项恶性生物学行为的作用。意义1.首次发现了 TMIGD1蛋白在肾癌及结肠癌细胞中能够抑制肿瘤细胞的增殖,成瘤以及迁移侵袭等恶性生物学行为的作用,明确了其作为抑癌因子的价值;2.阐明了 TMIGD1在肾癌细胞中通过促进p38磷酸化,进而调控CyclinD1,Rb,p21CIP1以及p27KIP1等信号分子,最终调控肾癌细胞恶性生物学行为的作用机制;发现了 C/EBPβ作为上游转录因子调控TMIGD1的表达;证明了TMIGD1在结肠癌细胞中可通过其胞外段与CYR61蛋白结合,进而抑制CYR61蛋白的促癌作用,发挥肿瘤抑制因子的作用;3.首次证实TMIGD1肿瘤抑制因子的作用,并初步阐明了其发挥作用的机制,证明TMIGD1具有作为抑癌因子用作临床肿瘤早期诊断标志物的潜在价值,其抑癌作用也可以为临床恶性肿瘤的靶向治疗提供参考和思路。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
免疫球蛋白样结构域论文参考文献
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标签：T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域; CD155; 结直肠癌; 免疫组织化学染色;