周建军，梁平，罗聪
(重庆医科大学附属儿童医院神经外科重庆市，400014)
摘要目的通过观察超顺磁性壳聚糖质粒(pDsVEGF165Red1-N1)明胶微球(SPCPGM)与磷酸钙骨水泥的复合支架在外加振荡磁场下修复颅骨缺损的作用，探讨其成骨效果。方法将50只新西兰大白兔随机分为5组，并制成颅内颅骨缺损模型，分别植入超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球(SPCPGM-VEGF165)/多孔磷酸钙骨水泥(CPC)复合支架、超顺磁性壳聚糖明胶微球((SPCPG)/多孔磷酸钙骨水泥(CPC)复合支架、多孔磷酸妈骨水泥(CPC)支架，经振荡磁场处理。于术后2周、4周、8周、12周时通过大体、X线检测、组织切片观察血管化及成骨情况，图像分析系统分析、求积仪测量对骨缺损处成骨情况进行测定，评估各组成骨的情况。结果在振荡磁场下超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球(SPCPGM-VEGF165)/多孔磷酸钙骨水泥(CPC)复合支架组支架开始降解吸收速度、血管化、成骨作用优于对照组。结论在振荡磁场下超顺磁性壳聚糖质粒明胶控释微球局部控释增加了持续作用时间，同时促进了质粒VEGF165细胞转染，从而促进新生骨血管化及成骨的作用，可用于颅骨缺损修复。
关键词:颅骨缺损;超顺磁性纳米微球;振荡磁场;质粒VEGF165
中图分类号R944文献标识码A
Thestudyofsuperparamagneticchitosan(pDsVEGF165)gelatin
microsoheresforthecranialdefects
ZhouJian-jun,Linagping,Luocong
(DepartmentofNeurosurgery,theChildren'sHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400014)
AbstactObjective:ToobservetheadvanceofcranialbonedefectshealingoftheporosityscaffoldsfilledwiththeSPCPGMthintheoscillatingmagneticfeild,toinvestigatetheeffectofosteogenesisandclinicalapplicationvalue.Methods:Productsufficentrecombinantplasmidsvascularendothelialgrowthfactor(VEGF165)thatcanexpresseinthedemiccells;Thesuperparamagneticchitosangelatinmicrospheres(SPCGM)werepreparedbythechemicalco-precipitation;Thesuperparamagneticchitosanplasmid(pDsVEGF165)compounds(SPCPGM)werepreparedwithcombination;TheSPCPGMandSPCGMwereallpreparedbythemethodofemulsificationcross-linked.Theporosityscaffoldsweremadeofthecementofthecalciumphosphateceramic(CPC)andgelatinmicrospherescomposite;Thenthespecimenswereobtainedin2,4,8and12weekspostoperatively.Observatiivedtheabilityofcranialboneskulldefectshealingindifferentgroups.Result:ThestudyindicatesthatSPCPGMpromotetheosteogenesisincranialbonedefectshealingbyoscillatingmagneticfield.GroupEarebetterthanothers.Theorderofeffectivenessfortheosteogenesisisasfollowing:GroupE>GroupD>GroupB,C,A.Conclusion:SPCPGMwasdischargedcontrolingandpromotedthetransfectionofplasmids.Thecompositescaffoldspromotetheosteogenesisofcranialbonedefectsandvascularization.
KeyWords:cranialbonedefects;superparamagnetismnanomicrosphere;oscillatingmagneticfield;VEGF165
目前的血管化研究发现，血管内皮细胞生长因子（VEGF）用用于整个成血管过程，包括成血管细胞的趋化性移动、激活、增殖、分化和成熟。不仅能促进血管的新生，也能调节成骨细胞的活性，促进分泌细胞外基质从而促进成骨。人体内的VEGF主要的分泌形式是VEGF165，也是主要的效应分子。因此，在骨缺损基因治疗中，VEGF165是组织工程骨血管化的首选基因。
1.材料与方法
1.1实验动物与材料新西兰成年大白兔50只，体重2.5~3kg（重庆医科大学验动物中心）；用化学共沉淀法制备超顺磁性壳聚糖微球(SPFCN)，与质粒（PDsVEGF165)按N/P=2.5/1混合，制备超顺磁性壳聚糖明胶微球（SPCPGM-VEGF165)；将自制明胶微球与磷酸钙骨水泥(上海瑞邦生物材料有限公司)混合制成直径为1.9cm,厚0.3cm的圆型多孔支架。分别置于多孔支架中制成不同复合支架。振荡磁场仪器
1.2方法新西兰兔50只，随机分为5组，手术制成2cm大小完全的兔颅骨缺损模型，分别植入不同多孔支架。A组：空白支架；B组、C组：SPFCN支架；D组、E组：SPCPGNI-VEGF165支架。术后第3天，将C组和E组分别置于振荡磁场下，1小时/天，连续8W。主要观察检测指标及资料收集方法:术后2、4、8、12W以DR机行X线摄片、大体观察、墨汁血管灌注后进行组织切片显微观察，评估血管生长及成骨。
1.3统计学分析采用Spss17.0软件包进行统计分析和处理，全部数据以mean士SD差表示，采用方差分析(ANOVA)，P<0.05表示具有统计学差异。
2结果
2.1大体形态观察A组、B、C组:术后2W支架表面有少许纤维组织，支架边缘呈虫蚀状，无新生血管形成；8W有骨纤维连接，支架约有25%被降解，边缘未见少许新生骨的形成与支架紧密结合；12W仅边缘有少量新生骨，支架约有50%被降解，其间有由软组织填充。D、E组：2W支架表面少量纤维组织，支架小孔内可见带有小量新生血管的纤维组织长入；4WD组:支架表面较多纤维组织，少量微血管长入小孔，边缘呈虫蚀状，有少量新生骨连接。E组：支架被纤维组织包裹，有较多带有新生血管的纤维组织长入支架小孔，边缘及底面有较多新生骨，有少量微球残留。8WE组：支架表面大量纤维组织，可见带有较多新生血管的纤维组织长入支架小孔，小孔内微球残留极少许，支架边缘及表面呈虫蚀状，支架约有40%被降解，支架边缘降解处及底面有较多新生骨。12WD组：支架约有70%被降解，在缺损处有较多新生骨，仍有少许微球残留。E组:支架约有80%被新生骨代替，残留的支架与新生骨结合紧密。
2.2X线检查结果A、B、C组:4W支架开始降解，支架与缺损边缘密度止常颅骨较低;12W支架影明显缩小，缺损边缘变得不规则，缺损处未见骨密度影。D组：4W支架边缘较模糊、不整齐；8W支架缩小，支架影不规则，支架缩小区域见较正常颅骨密度稍低的新生骨影。E组：4W支架边缘较模糊、不整齐，8W支架明显缩小，支架与骨缺损交界线不规则，支架缩小区域见较正常颅骨密度稍低的新生骨影，8W缺损面积进一步缩小。
2.3HE染色观察:A、B、C组:8W见有少量新生骨生长，支架内仅有少许微血管。D组:4W支架内有少量微血管形成，缺损边缘有少量新生骨，第8周微血管和新生骨较4W时有所增加，12W可见成熟的微血管，缺损边缘有少量成熟骨组织，仍可见残留微球。E组:术后2W支架周围及小孔内有结缔组织长入，可见不成熟的毛细血管形成，墨汁灌注时有漏出现象。4w结缔组织明显增多，墨汁灌注血管呈网状，可见少量新生骨，少量微球残留。8W可见较多成熟血管，支加边缘大量的新生骨并紧密结合。术后12W可见大量的微血管，可见成熟的小骨梁形成，镜下观与周围骨相似。
2.4求积仪测定新生骨组织的相对面积求积仪测定X线检测结果新生骨组织的相对面积结果如下表：
表1成骨的相对面积
Table1Thecorrespondenceofnewbone
注：将相对面积百分数按公式2Sin-1√￣P转换(P值为原始数据的百分数转换而成的弧度),方差分析(Q检验)。
4W：E组成骨面积明显大于D组,D组大于A、B、C组，有显著差异(P<0.01)，A、B和C组成骨百分比相近,(P>0.05，差异无统计学意义)；8W：E组成骨面积明显大于D组,D组大于C组，C组和A组及A和B组成骨百分比相近,差异无统计学意义(P>0.05)；12W：E组成骨大于D组,差异有统计学意义(0.01<P<0.05)，D组大于C组，有显著差异(P<0.01)，C组、A组及A、B组成骨面积相近，无显著差异(P>0.05)。
3讨论
骨移植后的修复过程包括移植物血管化、骨再生、骨端融合,而血管化作用贯穿于整个移植修复过程,对骨再生、融合的方式和效果起决定性作用，所以血管的形成是成骨过程的一个关键步骤，因此促进组织工程骨材料的血管化是构建组织工程骨的关键环节。血管内皮生细胞生长因子（VEGF），作用于血管内皮细胞，刺激血管内皮细胞分裂增殖，促进血管形成，是目前公认的特异性最高的血管内皮刺激因子。有研究证实采用VEGF转基因组织工程骨对兔颅骨缺损修复中证实VEGF可加快缺损区域的骨形成[1]。
2002年Mah等首次将磁性微球通肝素与重组相关病毒2基因载体连接并植入C12S细胞和小鼠体内，在外加高梯度强磁场的作用下成功将基因与磁性纳米颗粒的复合物定向聚集、转染靶区细胞[2]，其后磁性转染的有效性在各类细胞中也得到了验证。将质粒与磁性纳米微粒结合形成磁性因子，在外加磁场下进行体内转染时，将靶区置于外加磁场，使磁性因子聚集于靶区，有效增加了与组织接触、吸收，从而提高转染效率。质粒pDsVEGF165微球与支架结合植入体内，pDsVEGF165在无外加磁场时，可防止微球聚集，有利于组织细胞的吸取；外加振荡磁场增加了磁性因子向细胞沉降过程中的运动力，转染效率比静磁场更大的提高[3]。本实验C组、E组的微球残留比例较其它3组明显少，E组的墨汁灌注的组织切片中微血管的数量较D组明显多，也得到了证实。
骨移植中的血管再生除了与目的基因的表达，材料种类及性质对微血管的生长有着重要作用，须具有良好的生物相容性及一定的孔隙率和降解速度以利于血管长入最终实现移植骨血管化。磷酸钙骨水泥的终产物羟基磷灰石，是自然骨组织成分之一，具备上述特性而被用作骨组织工程支架材料被广泛研究应用[4]。SimonC等[5]用聚丙交乙交酯微球作为制孔剂与磷酸钙骨水泥混合，微球降解后成多孔支架，有利于成骨细胞及骨组织长入。厉孟等[6]运明CPC温合部体积的2.5%的明胶球制成多孔支架，混入经体内实验证实6个月时支架材料大部分降解。本实验采用明胶微球与CPC混合制成的复合支架，混合比例为10%，以提高明胶微球降解后支架的成孔率及孔径，置入兔颅骨缺损处，经12W的观察各实验组支架降解率均在50%以下，其中E组降解比例达75%。主要可能与下面两个因素有关：多孔支架增加了组织细胞与支架的接触面；同时外孔支架有利于微血管长，提高了组织的局部交换，通过血液循环运送的吞噬细胞，同时转运降解的CPC微粒。
在振荡磁场的作用下VEGF165的磁性微球转染局部靶细胞，持续表达VEGF165与体内其它细胞因子共同作用，促进血管的生成，促使支架材料的血管化，VEGF165表达同时也可促进周围骨组织中的骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化、增殖，活化的内皮细胞可产生BMP（骨生长形态蛋白）与其它细胞因子协同促进成骨，为骨修复过程中的血管化实验研究的探索提供了新的思路。
参考文献
[1]ZhaoDM,YangJF,LiuJL,etal.EffectofpcDNA3.1-VEGFl65recombinedvectoronbonedefectsJ.ChinaJ0rthop,2006,26:769-772.
[2]Mahc,Fraites’rJJr,zolotukhinI,eta1.IrnprovedmethodofrecombinaIltAAV2deliveryforsystemictargetedgenetherapyJ.MolTher.2002,6(1):106-112.
[3]KamauSW,HassaPO,SteitzB,etal.EnhancementoftheefficiencyofnonviralgenedeliverybyapplicationofpulsednlagneticfieldJ.NucleicAcidsResearch,2006,34(5):40.
[4]CarolineS,JaSonB,MereDithW,etal.Cranialbonedefects:currentandfuturestrategiesJ.NeurosurgFocus2010,29(6):1-11.
[5]SimonC,GJr,eta1.Preliminaryreportonthebiocompatibilityofamoldable，resorbable,compositebonegnatconsistingofcalciumphosphatecementandpoly(1aetide-eo-glycol-ide)microspheresJ.JOrthoRes,2002,20:473.
[6]厉孟,刘旭东,刘兴炎,等.多孔明胶微球／磷酸钙骨水泥的制备及其性能研究J.中国矫形外科杂志.2009,7（17）:526-529.