导读:本文包含了脱氧核糖醛缩酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:脱氧核糖醛缩酶,固定化,荧光高通量筛选,分子对接
脱氧核糖醛缩酶论文文献综述
费辉[1]（2016）在《分子改造提高脱氧核糖醛缩酶的催化活性和底物耐受性》一文中研究指出2-脱氧-D-核糖醛缩酶(EC 4.1.2.4, DERA)催化的羟醛缩合反应可以生成两个手性中心,特别是它能够以叁分子乙醛为底物,经过两步连续羟醛缩合反应得到他汀类药物手性侧链。他汀类药物能够有效降低人体内胆固醇含量,是一种重要的的降血脂药物。尽管如此,DERA在应用上仍存在一些问题：底物谱窄,偏好磷酸化底物,对2-脱氧-D-核糖(DR)等非磷酸化底物催化活力低,对底物乙醛的耐受性差等。因此本课题在改进现有荧光高通量筛选方法的基础上,对DERA进行同源模建和分子动力学计算,综合运用定向进化和理性设计改造DERA,以提高其对非磷酸化底物的催化活力和对高浓度乙醛的耐受性,并用于手性药物前体的合成。(1)荧光高通量筛选方法的建立：为了快速有效的筛选新酶和测定改造后DERA的催化活性,在现有荧光高通量筛选方法的基础上,研究香豆素类衍生物荧光发光机制,发现母环分子中取代基的种类及其位置的变化能够对荧光强度产生作用。通过对荧光底物的结构进行重新设计,在香豆素母环3号位引入苯并咪唑基,在6号位引入甲氧基,使底物在可见光下散发强烈的绿色荧光,相比于现有方法,其检测灵敏度提高了58.2倍。(2)DERA的定向进化改造：从实验室前期重组表达的8种DERA中,选择对非磷酸化底物DR催化活力乙醛耐受性最高的DERAGth和DERASep作为研究对象。这两种酶均可在E. coli BL21(DE3)中实现过量表达,纯酶的比活分别为22.5U/mg和16.5U/mg。通过易错PCR对DERAGth和DERASep进行定向进化后,利用构建的高通量筛选方法获得突变株DERAGth (F159I,S209G),其比活为105.8U/mg,相比原始酶提高了3.7倍。(3)理性设计提高DERA对N-丙烯醛邻苯二甲酰亚胺的催化活力：考察了DERAGth, DERASep催化受体底物N-丙烯醛邻苯二甲酰亚胺(N-AMP)和乙醛缩合这一模型反应的活力,DERAGth和DERAGth (F159I, S209G)比活分别为0.52U/mg和0.71 U/mg,而DERASep比活为6.2U/mg,因此选择DERASep作为目标酶进行改造。以DERATma(PDB1o0y)为模板,采用同源建模法构建了DERASep的结构模型,并对模型进行评价。通过分子对接,发现残基Thr10,Ser205,Ala206的侧链可能阻碍N-APM进入催化口袋。根据对接能的大小选择Thr10,Ser205,Ala206进行模拟突变,突变体结合N-AMP的分子动力学计算,得到DERASep(A206G)和DERASep(S205E)的结合自由能分别为-12.39kcal/mol和-7.11kcal/mol(DERASep为-3.17kcal/mol),推测这两个位点的突变可能会引起酶活力的变化。定点突变后考察突变体对底物催化活力的变化,结果显示,DERASep突变体(A206G)比活为22.8U/mg,比DERASep提高了2.7倍。(4)理性设计提高脱氧核糖醛缩酶乙醛耐受性：以DERAsep和DERASep(A206G)为研究对象,根据研究报道发现酶的热稳定性和其乙醛等有机溶剂的耐受性有正相关性,因此提出通过增强DERASep的稳定性提高其乙醛耐受性的思路。利用分子模拟工作站Discovery Studio对DERASep的结构模型进行虚拟突变扫描计算,得到单个氨基酸的突变能。基于软件的运算规则,突变能越低,结构越稳定,选取七个突变能最低的单点位点D15F:S16I,T41C,T120I,G174Y,G174,G213C,在此基础上进行双点突变和多点虚拟突变,得到的组合突变能最低的突变体DERASep Variant10(T120C, G174I, G213C)和DERASep Variant11(T120C, G174I, A206G,G213C)。考察其乙醛耐受性,结果显示DERASep Variant10在300mM乙醛浓度下,静置2小时后,活力残余70.5%,DERASep Variant11在相同条件下静置2小时后,活力残余66.7%,而被广泛研究的DERAEco在同样条件下,静置2小时后活力残余几乎为O。在全细胞催化N-AMP (46.2mM)和乙醛(166.7mM)的缩合反应中,在24h内DERASep Variant11催化反应了43.6%的底物,比DERASep和DERAEco分别提高了1.32倍和3.1倍,是文献中报道的DERA催化活力的1.55倍。(5) DERAEco的固定化改造：通过交联将DERA结合在纳米Fe304磁性颗粒上,确定最适的交联条件为：酶量与载体量的比为1：10,交联pH为6.0,交联时间为5h。制备后的交联体中,76.8%的酶交联在载体上,酶活回收率最高为65.04%同时显着的提高了酶的热稳定性和乙醛耐受性,使其在300mM乙醛浓度下,25℃,静置10h后残余61.4%的2-脱氧-D-核糖(DR)裂解活力。(本文来源于《浙江大学》期刊2016-06-01）
刘松[2]（2014）在《脱氧核糖醛缩酶的基因工程菌构建与表达及初步应用研究》一文中研究指出脱氧核糖醛缩酶(DARE)是一种醇醛缩合裂解酶，普遍存在于动植物及微生物体内。DERA在碳碳加成反应中，起着重要作用。特别是它能够以叁分子乙醛或者其他醛酮结构为底物，经过两步羟醛缩合反应得到他汀类药物手性侧链。他汀类药物能够降低体内胆固醇含量，在降血脂药物中占有重要地位。DERA作为一个生物催化剂，能够避免化学方法合成他汀类药物中所碰到的手性选择问题，因而，在手性合成反应中具有潜在的应用价值。本文主要通过构建一株原核工程菌和一株真核工程菌来表达DERA，并且研究比较了它们各自所得到的DERA的特性及初步应用研究。主要研究成果如下：1.DERA真核工程菌的构建及表达：采用PCR反应从E.coliBL21(DE3)plysS中扩增得到DERA基因片段，将DERA基因片段与质粒载体pPIC9K连接构建得到重组载体pPIC9K-DERA，用SalI酶对其酶切后再电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，经G418抗性获得多拷贝产DERA的重组毕赤酵母工程菌(GS115-pPIC9K–DERA)；用1%甲醇在不同时机对重组GS115菌株进行诱导表达DERA，经SDS-PAGE电泳测定，分子量为28.6kDa，该酶在文中表示为：GS-DERA。2.DERA原核工程菌的构建及表达：采用PCR反应从BL21扩增得到DERA基因片段，将该基因片段与pET-DsbA载体连接得到的重组载体pET-DsbA-DERA；将该重组载体转化至宿主菌BL21，构建得到产DERA的工程菌BL21(pET-DsbA-DERA)；采用IPTG对BL21(pET-DsbA-DERA)菌株诱导培养，离心收集细胞，超声波破碎细胞后，SDS-PAGE电泳检测显示，实现了DERA与DsbA的融合表达，得到50kDa左右大小的融合蛋白(DERA：28.6kDa，DsbA：21kDa)，该融合蛋白在文中表示为：BL-DERA。3.DERA的分离纯化及酶学性质研究：1%甲醇诱导培养GS115-pPIC9K–DERA菌株后的发酵液冷冻离心可分离得到单一的GS-DERA蛋白；IPTG诱导BL21(pET-DsbA-DERA)菌株表达后，离心收集细胞，超声波破碎细胞，即得到BL-DERA粗酶液，经镍柱材料纯化，得到纯度达90%以上的目标蛋白。酶活检测显示：1%甲醇对GS115-pPIC9K–DERA菌株诱导72h时，GS-DERA比活力最高(2.4U/mg)；纯化后的BL-DERA比活力为2.2U/mg，略低于GS-DERA活性。对酶学性质研究的结果表明：BL-DERA和GS-DERA的最佳反应pH6-8，并且确定pH7.5的咪唑-HCl缓冲液为其最佳反应体系；BL-DERA在20-60℃下保温30min后仍保留90%以上活性，而GS-DERA只在20℃-40℃表现较好的稳定性，比BL-DERA热稳定范围窄一些；从pH稳定性看，GS-DERA在pH3-10都能有较好的稳定性，比BL-DERA更耐受酸性pH，BL-DERA只在pH5-10范围保持稳定。4.两株重组菌株表达的DERA的应用研究：探究了BL-DERA和GS-DERA乙醛耐受能力，结果表明，它们对乙醛耐受力都不好，300mM乙醛处理30min后，DERA活力急速下降，处理1h后，GS-DERA保留40%的活性，BL-DERA保留24%的活性；2h后它们的活力都完全丧失。同时也发现，30-120min内GS-DERA比BL-DERA对乙醛耐受力稍微强一点。从研究BL-DERA和GS-DERA催化反应来看，它们对乙醛连续缩合能力都较差，未能检测到缩合产物，但是它们都能催化甘油醛-3-磷酸和乙醛缩合得到2-脱氧核糖-5磷酸(DRP)，并且乙醛浓度为100-150mM时，催化效率更高。(本文来源于《南昌大学》期刊2014-05-01）
陈丽伟[3]（2010）在《脱氧核糖醛缩酶同源基因的克隆、过表达与分子模拟研究》一文中研究指出本文采用基因采矿方法从Genbank中选取八种革兰氏阳性菌。以其基因组中预测的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)作为研究目标,用PCR方法扩增了编码BamDERA, GthDERA, SepDERA, BthDERA, LmoDERA, BsuDERA, CaceDERA, BliDERA的基因,在大肠杆菌BL21中实现过量表达,并考察了热稳定性和最优pH。八种来源于革兰氏阳性菌的DERA在70℃仍然保持40～100%的活性,尤其100℃下加热10 min后,GthDERA能保持77%的活性,而来源于E.coli K12的野生型DERA (EcoDERA)大于60℃时活性显着降低。这八种DERA催化天然底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸(DRP)裂解反应的活性和EcoDERA接近,但对非磷酸化底物2-脱氧-D-核糖(DR)的催化能力要远大于EcoDERA,八个酶对两种底物的专一性常数之比([kcat/Km(DR)]/[kcat/Km(DRP)])均比EcoDERA高两到叁个数量级。同源建模成功构建了八个DERA的结构,经序列比对和活性位点迭加发现几种酶底物结合位点具有相似的结构特征,EcoDERA中组成磷酸结合袋子的大部分残基在几个克隆的DERA中是保守的,在CaceDERA中Lys172,Val206,Arg207和Ser239分别被Phe, Ile, His和Ala取代,在BsuDERA, BliDERA和BamDERA中Lys172,Val206和Ser239分别被Phe, Ile和Ala取代,在BthDERA, LmoDERA和SepDERA中Lys172和Ser239分别被Phe和Ala取代,在GthDERA中Lys172被Phe取代,并且EcoDERA中Phe200在八个酶中均被替换为Val。分析表明这种替换可能影响底物结合位点静电环境变化和两个关键活性位点Lys残基架构周围的疏水相互作用。对八个DERA和两个底物的相互作用进行分子对接研究,结果与实验结果趋势相符,八个DERA对DR的对接打分结果要比EcoDERA高一到两个数量级。(本文来源于《浙江大学》期刊2010-05-14）
脱氧核糖醛缩酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
脱氧核糖醛缩酶(DARE)是一种醇醛缩合裂解酶，普遍存在于动植物及微生物体内。DERA在碳碳加成反应中，起着重要作用。特别是它能够以叁分子乙醛或者其他醛酮结构为底物，经过两步羟醛缩合反应得到他汀类药物手性侧链。他汀类药物能够降低体内胆固醇含量，在降血脂药物中占有重要地位。DERA作为一个生物催化剂，能够避免化学方法合成他汀类药物中所碰到的手性选择问题，因而，在手性合成反应中具有潜在的应用价值。本文主要通过构建一株原核工程菌和一株真核工程菌来表达DERA，并且研究比较了它们各自所得到的DERA的特性及初步应用研究。主要研究成果如下：1.DERA真核工程菌的构建及表达：采用PCR反应从E.coliBL21(DE3)plysS中扩增得到DERA基因片段，将DERA基因片段与质粒载体pPIC9K连接构建得到重组载体pPIC9K-DERA，用SalI酶对其酶切后再电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，经G418抗性获得多拷贝产DERA的重组毕赤酵母工程菌(GS115-pPIC9K–DERA)；用1%甲醇在不同时机对重组GS115菌株进行诱导表达DERA，经SDS-PAGE电泳测定，分子量为28.6kDa，该酶在文中表示为：GS-DERA。2.DERA原核工程菌的构建及表达：采用PCR反应从BL21扩增得到DERA基因片段，将该基因片段与pET-DsbA载体连接得到的重组载体pET-DsbA-DERA；将该重组载体转化至宿主菌BL21，构建得到产DERA的工程菌BL21(pET-DsbA-DERA)；采用IPTG对BL21(pET-DsbA-DERA)菌株诱导培养，离心收集细胞，超声波破碎细胞后，SDS-PAGE电泳检测显示，实现了DERA与DsbA的融合表达，得到50kDa左右大小的融合蛋白(DERA：28.6kDa，DsbA：21kDa)，该融合蛋白在文中表示为：BL-DERA。3.DERA的分离纯化及酶学性质研究：1%甲醇诱导培养GS115-pPIC9K–DERA菌株后的发酵液冷冻离心可分离得到单一的GS-DERA蛋白；IPTG诱导BL21(pET-DsbA-DERA)菌株表达后，离心收集细胞，超声波破碎细胞，即得到BL-DERA粗酶液，经镍柱材料纯化，得到纯度达90%以上的目标蛋白。酶活检测显示：1%甲醇对GS115-pPIC9K–DERA菌株诱导72h时，GS-DERA比活力最高(2.4U/mg)；纯化后的BL-DERA比活力为2.2U/mg，略低于GS-DERA活性。对酶学性质研究的结果表明：BL-DERA和GS-DERA的最佳反应pH6-8，并且确定pH7.5的咪唑-HCl缓冲液为其最佳反应体系；BL-DERA在20-60℃下保温30min后仍保留90%以上活性，而GS-DERA只在20℃-40℃表现较好的稳定性，比BL-DERA热稳定范围窄一些；从pH稳定性看，GS-DERA在pH3-10都能有较好的稳定性，比BL-DERA更耐受酸性pH，BL-DERA只在pH5-10范围保持稳定。4.两株重组菌株表达的DERA的应用研究：探究了BL-DERA和GS-DERA乙醛耐受能力，结果表明，它们对乙醛耐受力都不好，300mM乙醛处理30min后，DERA活力急速下降，处理1h后，GS-DERA保留40%的活性，BL-DERA保留24%的活性；2h后它们的活力都完全丧失。同时也发现，30-120min内GS-DERA比BL-DERA对乙醛耐受力稍微强一点。从研究BL-DERA和GS-DERA催化反应来看，它们对乙醛连续缩合能力都较差，未能检测到缩合产物，但是它们都能催化甘油醛-3-磷酸和乙醛缩合得到2-脱氧核糖-5磷酸(DRP)，并且乙醛浓度为100-150mM时，催化效率更高。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
脱氧核糖醛缩酶论文参考文献
[1].费辉.分子改造提高脱氧核糖醛缩酶的催化活性和底物耐受性[D].浙江大学.2016
[2].刘松.脱氧核糖醛缩酶的基因工程菌构建与表达及初步应用研究[D].南昌大学.2014
[3].陈丽伟.脱氧核糖醛缩酶同源基因的克隆、过表达与分子模拟研究[D].浙江大学.2010