导读:本文包含了无神经节细胞性巨结肠病论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:细胞移植,无神经节,巨结肠病
无神经节细胞性巨结肠病论文文献综述
张飞[1]（2011）在《神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究》一文中研究指出该病的治疗过程中,很多方法都已尝试,但是效果并不明显。出现了新的思路,就是在干细胞理论和干细胞移植技术上的新进展,展现出一条崭新的途径。考虑以上的观点,设计了这项研究,实验的目的是为了能够很好的探索研究神经干细胞在治疗无神经节方面的可行性,并且为治疗无神经节细胞性巨结肠病的治疗寻找一个新的方法。本文有一下几部分组成:神经干细胞的分离培养和纯化扩增、神经干细胞的肠壁移植后检测和内移植、无神经节细胞性巨结肠病模型的建立。(本文来源于《中外妇儿健康》期刊2011年07期）
董云玲[2]（2008）在《神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究》一文中研究指出干细胞(stem cell)能够不断进行自我更新,具有不同的分化潜能,在特定的条件下,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的细胞。根据分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞(totipotential stemcell)、多能干细胞(multipotential stem cell)和单能干细胞(unipotential stem cell)。根据细胞来源的不同又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。来源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)可以形成除了滋养层细胞以外的所有类型的细胞,进一步形成血液、神经等系统的干细胞,如造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSC)和神经干细胞(neural stem cells,NSC)等,它们存在于多种胚胎和成体组织中,在组织修复和细胞数目的动态平衡中起重要作用。近年来,干细胞研究一直处于生命科学研究的前沿位置。干细胞具有的多项分化潜能和自我更新能力使其成为重要的种子细胞,在各种因素导致的组织和器官缺损性、退行性疾病以及先天缺陷性疾病的细胞替代治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞(neural stem cells,NSCs),是一种组织特异性干细胞,能自我更新、增殖,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。目前人们已从胚胎、新出生动物和成年动物的小脑、大脑皮层、纹状体、室下区、海马及脊髓等部位成功地分离培养出了这种细胞。近年来,神经干细胞或者整合了特定基因的神经干细胞移植治疗神经损伤和神经退行性疾病的研究取得了令人瞩目的进展。来源于大脑皮层的神经干细胞具有较强的分化潜力和增殖能力,并且数量多、易分离提取,在体内外不同的微环境中可以被诱导分化为具有特定递质类型的神经元,从而可用于细胞替代治疗。肠神经系统(enteric nervous system,ENS)是存在于肠壁的相对独立的神经调节网络,调节消化管的吸收、分泌和运动功能。肠神经节中的神经细胞和神经胶质细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。神经节细胞和神经纤维在肠壁环形肌与纵形肌之间形成肌间神经丛,在粘膜下形成粘膜下神经丛。如果神经嵴细胞不能正常迁入原始消化管,或者迁入的神经嵴细胞不能分化为神经节细胞,就会引起诸多消化道神经运动障碍性疾病,如无神经节细胞性巨结肠病就是这样一种先天性疾病。无神经节细胞性巨结肠病(aganglionic megacolon)又称Hirschsprung氏病(Hirschsprung's disease,HD,),是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,发病率居消化道畸形第二位,据统计高达1/3000～1/5000。其主要病理变化是一段结/直肠肠壁内无神经节细胞,该段结/直肠持续性痉挛,肠腔狭窄,而其邻近的近端肠腔则扩张,内容物潴留。HD主要临床表现是腹胀,顽固性便秘,不完全性肠梗阻。手术切除病变狭窄肠段并进行端一端吻合是目前临床上唯一有效的治疗方法,但治疗效果并不令人十分满意。由于手术损伤和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症,严重者可致结肠破裂。如果病变累及直肠下段或大段结肠,手术切除后,还会引起大便失禁和代谢紊乱。干细胞理论和干细胞移植技术的进展,为该病的治疗提供了新思路,展现出一条崭新的途径。基于上述原因和理念,我们设计了该项研究,目的是为了探讨神经干细胞治疗无神经节细胞性巨结肠病的可行性,为此类疾病的治疗开辟一条新途径。本研究由叁部分组成,即无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立、神经干细胞的分离培养和纯化扩增、神经干细胞的肠壁内移植和移植后检测。第一部分无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立进行神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究,首先必须建立一种适宜的该病动物模型。我们根据无神经节细胞性巨结肠病的病理变化特征及原理,以大鼠为实验动物,并根据阳离子表面活性剂苯扎氯胺(benzalkoniumchloride,BAC)能选择性地杀灭神经细胞而不损伤其他组织细胞的原理,经多次实验,找到了使用该药的最佳方式、最佳剂量和最佳作用时间,去除了直肠上段肠壁内肠神经丛的的神经节细胞,而肠壁的其他组织细胞未受损伤。术后4w,肉眼观察发现,BAC作用节段的肠管痉挛、狭窄,其上方肠管则扩张明显、内容物潴留。组织化学、免疫荧光染色等检查证实,BAC作用段肠壁内的肌间和粘膜下神经节细胞消失,神经纤维明显减少,乙酰胆碱酯酶的活性明显降低;直肠内测压显示直肠抑制反射(rectoanal inhibitory reflex,RAIR)消失。通过局部应用BAC的方法,我们成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,为进一步研究该病的治疗方法奠定了基础。第二部分神经干细胞的分离培养和纯化、扩增进行治疗性干细胞移植实验研究的另一个关键问题是选择理想的和足够数量的供体细胞。由于胚胎大脑皮层中的神经干细胞数量多、易提取、抗原性弱等优点,我们采用了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞,并对其提取、分离时间、培养纯化、扩增方法进行多次实验优化。从孕16天的Wistar大鼠胚胎中分离大脑皮层组织,经胰蛋白酶消化结合机械吹打获得单细胞悬液。用添加B27、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)的无血清DMEM/F12培养基进行培养。培养72h后开始出现许多由十几个细胞聚集形成的集落样的小细胞团,呈悬浮状态。第6d-7d每个集落的细胞增至几十甚至上百个,形成神经球(neurosphere)。继续培养,每5-7天传代一次。然后通过巢蛋白Nestin的免疫细胞化学染色以检测神经干细胞及其纯度。用含10%胎牛血清的培养液培养进行诱导分化培养,培养7天后的细胞进行MAP2(microtubule associated protein 2)、GFAP(glial fibrillaryacidic protein)免疫细胞化学染色,以检测神经干细胞向神经元细胞和神经胶质细胞分化的特性。结果显示,原代培养和传代培养的细胞球内大多数细胞均呈Nestin强阳性着色。而在含血清培养基中培养7d后可见大量细胞从神经球中迁出,并呈神经元样及胶质细胞样形态,免疫细胞化学染色显示,MAP2阳性细胞占细胞总数的40.64%,GFAP阳性细胞占细胞总数的55.32%。以上结果显示培养的细胞具有神经干细胞的分化潜能。为了检测细胞的增殖情况,我们进行了5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)掺入实验。结果表明,神经球中有近90%的细胞呈BrdU阳性,这说明培养中的NSCs具有较强的增殖能力。第叁部分神经干细胞肠壁内移植和移植后检测在成功建立无神经节细胞性巨结肠动物模型以及成功分离培养、纯化扩增了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞的基础上,我们进行了神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验。取已预先标记的第5代的神经干细胞,移植于用化学方法去除了神经节细胞的直肠上段。移植后用多种方法检测移植细胞的存活、分化和肠功能恢复情况。结果显示:移植8周后肠壁内有移植细胞存活,并可见部分细胞分化为PGP9.5阳性的神经细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞,主要分布于肌间和环形肌层。Western Blot结果表明,BAC去神经节细胞未移植组肠壁内神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide sythase,nNOS)及胆碱乙酰转移酶(Choline Acetyltransferase,ChAT)的表达较正常组明显降低,而干细胞移植组在移植后其肠壁内nNOS和ChAT的蛋白表达较未进行细胞移植的模型组明显增强。球囊扩张刺激测压结果显示,去神经节细胞未移植组直肠肛门抑制反射(rectoanal inhibitory reflex,RAIR)消失,而NSCs移植组RAIR恢复;直肠离体肌条的电场刺激(electrical field stimulation,EFS)实验结果也表明,正常对照组和NSCs移植组的直肠肌条在电场刺激(EFS)诱导下均出现较强的收缩反应,而未进行移植的HD模型组则未见明显反应。上述实验结果显示,大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞在肠壁内的微环境中可以存活并可分化为功能性神经细胞,从而使肠神经反射和运动功能得到一定程度的恢复。结论本项研究通过建立无神经节细胞性巨结肠病的大鼠实验模型,优化体外分离培养、增殖和纯化大脑皮层神经干细胞的条件,将神经干细胞进行无神经节细胞的肠壁内移植并进行了多项移植后检测,结果证明:取自胚胎大脑皮层的神经干细胞移植到无神经节细胞性巨结肠病动物模型的肠壁中可以存活,并能分化为具有神经节细胞特性的功能性神经细胞,对无神经节细胞性巨结肠有明显的治疗作用。尽管如此,神经干细胞移植的远期治疗效果还有待于进一步研究。(本文来源于《山东大学》期刊2008-11-08）
刘伟[3]（2008）在《大鼠神经上皮干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究》一文中研究指出干细胞(stem cell)是一类具有自我复制和分化潜能的未分化细胞,在适宜的条件下或给予适宜的信号,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。根据分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞(totipotential stem cell)、多能干细胞(multipotential stem cell)和单能干细胞(unipotential stem cell)。胚胎干细胞具有发育的全能性,可分化为人体所有的组织和细胞,是全能干细胞。成体干细胞或组织干细胞,具有组织特异性,能分化产生所属组织的细胞类型,是多能或单能干细胞。这一发现不仅对于细胞生物学理论的发展有着重大的意义,对于各种因素导致的组织和器官缺损性、退行性疾病以及先天缺陷性疾病的细胞移植替代治疗也具有深远的影响。神经干细胞(neural stem cell,NSC)具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能,能自我更新,从胚胎和成年动物的室下区、纹状体、海马及脊髓等部位已成功地分离培养出了这种干细胞。近年来,神经干细胞或导入特定基因的神经干细胞移植治疗神经损伤和神经退行性疾病的研究取得了重大进展。神经管(neural tube)是中枢神经系统的原基,构成神经管壁的神经上皮细胞(neuroepithelial cell)是最原始的神经干细胞,又称神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cell,NESC)。其数量多、易提取,移植后有较强的存活和向神经细胞方向分化的能力,因此在细胞移植治疗神经系统疾病方面较其它来源的神经干细胞更具优势。无神经节细胞性巨结肠病(aganglionic megacolon)又称先天性巨结肠病(Hirschsprung's disease,HD),是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,其发病率高达1/3000～1/5000。其主要病理变化是一段结肠壁内缺乏神经节细胞,致使该段结肠持续性痉挛,肠腔狭窄,其近端肠腔扩张,内容物潴留。其主要临床表现是腹胀,顽固性便秘,不完全性肠梗阻。手术切除狭窄段结肠并进行端一端吻合是目前唯一有效的治疗方法。但由于手术损伤和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症,如果累及直肠下段或进行大段结肠切除,还会引起大便失禁和代谢紊乱。多年来的研究证明,肠壁内存在着一个由神经节细胞和神经纤维构成的、相对独立的神经调节网络,调节消化管的运动功能,称肠神经系统(entericnervous system,ENS)。肠神经节细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。神经嵴位于神经管背外侧,与神经管同源,同属神经干细胞。在人胚发育的第5-12周,神经嵴细胞迁入原始消化管,并在此分化为神经节细胞和神经胶质细胞,在肠壁的环形肌与纵形肌之间形成肌间神经丛,在粘膜下形成粘膜下神经丛。如果神经嵴细胞不能迁入原始消化管,或迁入的神经嵴细胞不能分化为肠神经节细胞,就会引起无神经节细胞性巨结肠病等消化管神经运动障碍性疾病。基于上述理念,我们设计了该项研究课题,即在无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型上,探讨神经上皮干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的可行性,为该病的治疗开辟一条新路。实验分叁部分进行:第一部分神经上皮干细胞的分离培养和体外标记神经上皮干细胞的分离培养和体外标记是进行干细胞移植的前提条件。经多次试验,我们成功地摸索出了一个分离培养、体外标记神经上皮干细胞的最佳方案。从孕11.5天的Wistar大鼠胚胎中分离神经管,机械吹打后获得单细胞悬液,接种于无血清培养基DMEM/F_(12)(含B_(27)),并加入碱性成纤维细胞生长因子静置培养。72小时后开始出现许多十几个细胞聚集形成的细胞团,呈悬浮状态,即神经球。第6天每个细胞集落由几十甚至几百个细胞聚集形成,Nestin染色呈强阳性。将神经球置于含10%胎牛血清的DMEM/F_(12)培养基中进行分化培养7天后进行微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学染色,染色结果显示,神经上皮干细胞能分化为MAP2阳性的神经细胞及GFAP阳性的胶质细胞。通过进一步的RT-PCR检测,显示培养的神经上皮干细胞在体外表达肠神经营养因子受体系统rearranged during transformation(RET)receptortyrosine kinase和GFRα1(GDNF family receptorα1),说明这种细胞可接受肠壁环境中的生长因子信号的调控,更有利于移植后向肠神经细胞方向分化。为了移植后可以在体内示踪,我们在体外对细胞进行了5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记,于移植前3d在细胞中掺入BrdU,经BrdU免疫细胞化学染色,神经球中有大约90%的细胞呈BrdU阳性,为下一步的移植实验提供了良好的示踪标记细胞的方法。第二部分无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立建立无神经节细胞性巨结肠病的动物模型是进行细胞移植治疗实验研究的基本条件。为此,我们根据无神经节细胞性巨结肠病的病理变化,以大鼠为实验动物,选用阳离子表面活性剂—苄基-二甲基-十四烷基氯化铵(benzalkoniumchloride,BAC)作为神经细胞的选择性灭活剂,作用于大鼠的远段结肠浆膜表面,选择性的灭活肠神经节细胞,成功地建立了该病的动物模型。术后4周大体解剖发现,BAC作用处肠管痉挛狭窄,其上方肠管扩张、肠内容物潴留;结肠测压球囊扩张刺激反射实验显示无神经节细胞段结肠的反射性收缩消失;HE染色、免疫荧光染色及组织化学染色证实,BAC作用处肌间和粘膜下神经节细胞消失,乙酰胆碱酯酶的活性明显减低;Western blot也证实神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase,ChAT)的表达明显降低。证明了该动物模型与人类的无神经节细胞性巨结肠病类似,为进一步研究该病的发病机理和治疗方法提供了适宜的动物模型。第叁部分无神经节细胞肠壁内神经上皮干细胞的移植和移植后的检测在成功建立动物模型的基础上,我们进行了神经上皮干细胞的移植。取BrdU标记的第5代的神经上皮干细胞,移植到模型鼠去除肠神经节细胞的肠段。移植4周时检测发现,移植细胞存活良好,并部分分化为蛋白基因产物9.5(proteingene product 9.5,PGP9.5)阳性的神经细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞。移植8周后移植细胞分化成为nNOS及ChAT阳性的神经细胞。结肠测压球囊扩张刺激反射实验显示细胞移植后肠神经反射性收缩恢复,肠离体肌条试验结果也表明神经上皮干细胞移植组结肠较未移植细胞的模型组结肠有明显的EFS诱导的舒张或收缩反应。这提示神经上皮干细胞在肠壁的微环境中可以存活,并分化为功能性的肠神经细胞,而且可恢复无神经节细胞结肠段的神经运动功能。结论本项研究成功地分离培养、鉴定和标记了神经上皮干细胞,成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,并成功地进行了肠壁内干细胞移植,通过移植后的检测,证明了移植细胞在肠壁中能够分化成功能性的肠神经细胞,并能恢复肠神经运动功能。这表明神经干细胞肠壁内移植有望成为治疗无神经节细胞性巨结肠病的新方法。(本文来源于《山东大学》期刊2008-05-12）
刘伟,吴荣德,董云玲,高英茂[4]（2007）在《无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立》一文中研究指出目的用化学方法选择性去除大鼠肠神经节细胞,建立类似于人类无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型。方法通过开腹手术将0.5%的苄基-二甲基-十四烷基氯化铵(BAC)作用于大鼠降结肠远端2 cm长的肠管浆膜表面30 min,用生理盐水作对照组。术后4周处死大鼠,观察作用部位的大体解剖变化,并通过冰冻切片及整装片的免疫荧光和组织化学染色观察局部肠神经节细胞及神经丛的消除情况。结果术后4周的大体解剖发现,在BAC作用处肠管痉挛狭窄,其上方肠管扩张、肠内容物潴留;组织学检查证实,BAC作用处肌间和黏膜下神经节细胞消失,神经纤维明显减少,其乙酰胆碱酯酶的活性明显减低。结论用BAC化学去除法成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,为进一步研究该病的发病机制和治疗方法提供了适宜的动物模型。(本文来源于《中华小儿外科杂志》期刊2007年04期）
王萍[5]（2002）在《Duhame式无神经节细胞性巨结肠根治术的手术配合》一文中研究指出无神经节细胞性巨结肠 ,是由先天性肠壁无神经节细胞使肠壁痉挛 ,慢性狭窄 ,引起便秘 ,而导致近端结肠扩张 ,肠壁增厚 ,以直肠上段 ,乙状结肠、降结肠多见 ,过去被错误称作先天性巨结肠[1] ,临床上广泛应用一期剖腹结肠根治术 ,我院自1999年 11(本文来源于《现代护理》期刊2002年08期）
无神经节细胞性巨结肠病论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
干细胞(stem cell)能够不断进行自我更新,具有不同的分化潜能,在特定的条件下,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的细胞。根据分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞(totipotential stemcell)、多能干细胞(multipotential stem cell)和单能干细胞(unipotential stem cell)。根据细胞来源的不同又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。来源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)可以形成除了滋养层细胞以外的所有类型的细胞,进一步形成血液、神经等系统的干细胞,如造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSC)和神经干细胞(neural stem cells,NSC)等,它们存在于多种胚胎和成体组织中,在组织修复和细胞数目的动态平衡中起重要作用。近年来,干细胞研究一直处于生命科学研究的前沿位置。干细胞具有的多项分化潜能和自我更新能力使其成为重要的种子细胞,在各种因素导致的组织和器官缺损性、退行性疾病以及先天缺陷性疾病的细胞替代治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞(neural stem cells,NSCs),是一种组织特异性干细胞,能自我更新、增殖,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。目前人们已从胚胎、新出生动物和成年动物的小脑、大脑皮层、纹状体、室下区、海马及脊髓等部位成功地分离培养出了这种细胞。近年来,神经干细胞或者整合了特定基因的神经干细胞移植治疗神经损伤和神经退行性疾病的研究取得了令人瞩目的进展。来源于大脑皮层的神经干细胞具有较强的分化潜力和增殖能力,并且数量多、易分离提取,在体内外不同的微环境中可以被诱导分化为具有特定递质类型的神经元,从而可用于细胞替代治疗。肠神经系统(enteric nervous system,ENS)是存在于肠壁的相对独立的神经调节网络,调节消化管的吸收、分泌和运动功能。肠神经节中的神经细胞和神经胶质细胞由神经嵴细胞迁移、分化而来。神经节细胞和神经纤维在肠壁环形肌与纵形肌之间形成肌间神经丛,在粘膜下形成粘膜下神经丛。如果神经嵴细胞不能正常迁入原始消化管,或者迁入的神经嵴细胞不能分化为神经节细胞,就会引起诸多消化道神经运动障碍性疾病,如无神经节细胞性巨结肠病就是这样一种先天性疾病。无神经节细胞性巨结肠病(aganglionic megacolon)又称Hirschsprung氏病(Hirschsprung's disease,HD,),是一种严重危害婴幼儿健康的先天性畸形,发病率居消化道畸形第二位,据统计高达1/3000～1/5000。其主要病理变化是一段结/直肠肠壁内无神经节细胞,该段结/直肠持续性痉挛,肠腔狭窄,而其邻近的近端肠腔则扩张,内容物潴留。HD主要临床表现是腹胀,顽固性便秘,不完全性肠梗阻。手术切除病变狭窄肠段并进行端一端吻合是目前临床上唯一有效的治疗方法,但治疗效果并不令人十分满意。由于手术损伤和结肠缩短,术后常出现小肠结肠炎、稀便、患儿心理障碍等后遗症,严重者可致结肠破裂。如果病变累及直肠下段或大段结肠,手术切除后,还会引起大便失禁和代谢紊乱。干细胞理论和干细胞移植技术的进展,为该病的治疗提供了新思路,展现出一条崭新的途径。基于上述原因和理念,我们设计了该项研究,目的是为了探讨神经干细胞治疗无神经节细胞性巨结肠病的可行性,为此类疾病的治疗开辟一条新途径。本研究由叁部分组成,即无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立、神经干细胞的分离培养和纯化扩增、神经干细胞的肠壁内移植和移植后检测。第一部分无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立进行神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究,首先必须建立一种适宜的该病动物模型。我们根据无神经节细胞性巨结肠病的病理变化特征及原理,以大鼠为实验动物,并根据阳离子表面活性剂苯扎氯胺(benzalkoniumchloride,BAC)能选择性地杀灭神经细胞而不损伤其他组织细胞的原理,经多次实验,找到了使用该药的最佳方式、最佳剂量和最佳作用时间,去除了直肠上段肠壁内肠神经丛的的神经节细胞,而肠壁的其他组织细胞未受损伤。术后4w,肉眼观察发现,BAC作用节段的肠管痉挛、狭窄,其上方肠管则扩张明显、内容物潴留。组织化学、免疫荧光染色等检查证实,BAC作用段肠壁内的肌间和粘膜下神经节细胞消失,神经纤维明显减少,乙酰胆碱酯酶的活性明显降低;直肠内测压显示直肠抑制反射(rectoanal inhibitory reflex,RAIR)消失。通过局部应用BAC的方法,我们成功地建立了无神经节细胞性巨结肠病的大鼠模型,为进一步研究该病的治疗方法奠定了基础。第二部分神经干细胞的分离培养和纯化、扩增进行治疗性干细胞移植实验研究的另一个关键问题是选择理想的和足够数量的供体细胞。由于胚胎大脑皮层中的神经干细胞数量多、易提取、抗原性弱等优点,我们采用了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞,并对其提取、分离时间、培养纯化、扩增方法进行多次实验优化。从孕16天的Wistar大鼠胚胎中分离大脑皮层组织,经胰蛋白酶消化结合机械吹打获得单细胞悬液。用添加B27、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)的无血清DMEM/F12培养基进行培养。培养72h后开始出现许多由十几个细胞聚集形成的集落样的小细胞团,呈悬浮状态。第6d-7d每个集落的细胞增至几十甚至上百个,形成神经球(neurosphere)。继续培养,每5-7天传代一次。然后通过巢蛋白Nestin的免疫细胞化学染色以检测神经干细胞及其纯度。用含10%胎牛血清的培养液培养进行诱导分化培养,培养7天后的细胞进行MAP2(microtubule associated protein 2)、GFAP(glial fibrillaryacidic protein)免疫细胞化学染色,以检测神经干细胞向神经元细胞和神经胶质细胞分化的特性。结果显示,原代培养和传代培养的细胞球内大多数细胞均呈Nestin强阳性着色。而在含血清培养基中培养7d后可见大量细胞从神经球中迁出,并呈神经元样及胶质细胞样形态,免疫细胞化学染色显示,MAP2阳性细胞占细胞总数的40.64%,GFAP阳性细胞占细胞总数的55.32%。以上结果显示培养的细胞具有神经干细胞的分化潜能。为了检测细胞的增殖情况,我们进行了5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)掺入实验。结果表明,神经球中有近90%的细胞呈BrdU阳性,这说明培养中的NSCs具有较强的增殖能力。第叁部分神经干细胞肠壁内移植和移植后检测在成功建立无神经节细胞性巨结肠动物模型以及成功分离培养、纯化扩增了大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞的基础上,我们进行了神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验。取已预先标记的第5代的神经干细胞,移植于用化学方法去除了神经节细胞的直肠上段。移植后用多种方法检测移植细胞的存活、分化和肠功能恢复情况。结果显示:移植8周后肠壁内有移植细胞存活,并可见部分细胞分化为PGP9.5阳性的神经细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞,主要分布于肌间和环形肌层。Western Blot结果表明,BAC去神经节细胞未移植组肠壁内神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide sythase,nNOS)及胆碱乙酰转移酶(Choline Acetyltransferase,ChAT)的表达较正常组明显降低,而干细胞移植组在移植后其肠壁内nNOS和ChAT的蛋白表达较未进行细胞移植的模型组明显增强。球囊扩张刺激测压结果显示,去神经节细胞未移植组直肠肛门抑制反射(rectoanal inhibitory reflex,RAIR)消失,而NSCs移植组RAIR恢复;直肠离体肌条的电场刺激(electrical field stimulation,EFS)实验结果也表明,正常对照组和NSCs移植组的直肠肌条在电场刺激(EFS)诱导下均出现较强的收缩反应,而未进行移植的HD模型组则未见明显反应。上述实验结果显示,大鼠胚胎大脑皮层来源的神经干细胞在肠壁内的微环境中可以存活并可分化为功能性神经细胞,从而使肠神经反射和运动功能得到一定程度的恢复。结论本项研究通过建立无神经节细胞性巨结肠病的大鼠实验模型,优化体外分离培养、增殖和纯化大脑皮层神经干细胞的条件,将神经干细胞进行无神经节细胞的肠壁内移植并进行了多项移植后检测,结果证明:取自胚胎大脑皮层的神经干细胞移植到无神经节细胞性巨结肠病动物模型的肠壁中可以存活,并能分化为具有神经节细胞特性的功能性神经细胞,对无神经节细胞性巨结肠有明显的治疗作用。尽管如此,神经干细胞移植的远期治疗效果还有待于进一步研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
无神经节细胞性巨结肠病论文参考文献
[1].张飞.神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究[J].中外妇儿健康.2011
[2].董云玲.神经干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究[D].山东大学.2008
[3].刘伟.大鼠神经上皮干细胞移植治疗无神经节细胞性巨结肠病的实验研究[D].山东大学.2008
[4].刘伟,吴荣德,董云玲,高英茂.无神经节细胞性巨结肠病动物模型的建立[J].中华小儿外科杂志.2007
[5].王萍.Duhame式无神经节细胞性巨结肠根治术的手术配合[J].现代护理.2002