导读:本文包含了损伤修复蛋白类论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:电离辐射,DNA双链断裂,DNA-PKcs,RNA免疫共沉淀
损伤修复蛋白类论文文献综述
宋志全[1]（2019）在《电离辐射对DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs及其结合RNA作用的研究》一文中研究指出目的:环境中电离辐射对人体细胞基因组DNA造成最严重的一种损害是DNA双链断裂(DNA double strand breaks,DSBs),当发生DSBs时,人体细胞最主要的修复通路是以DNA-PKcs蛋白(DNA-dependent Protein Kinase Catalytic Subunit)为核心因子主导的DNA非同源性末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)。近年来,对DNA-PKcs进行了大量研究,DNA-PKcs作为上游的关键蛋白激酶在NHEJ通路中发挥重要的作用。因此,我们关注电离辐射致人体细胞基因双链断裂损伤后DNA-PKcs蛋白激酶活性的变化,研究其激酶活性增强具有辐射时间剂量效应,从而可以作为人体细胞基因放射损伤修复机制研究的靶蛋白。随着近年来不断有研究表明DNA-PKcs蛋白可以通过结合RNA发挥功能,我们进一步从RNA-蛋白复合体角度研究DNA-PKcs蛋白在电离辐射损伤修复过程中的作用。方法:(1)在室温条件下使用本院60 Coγ射线照射构建细胞DSBs模型。8Gy剂量照射U2OS细胞,分别收取未照射对照组(con)和照后(0.5、1、2、4、8 h)时间点的细胞,通过Western Blots实验观察电离辐射后不同时间点DNA-PKcs蛋白及其Ser2056位点磷酸化表达情况;接下来对U2OS细胞进行不同剂量(0,2,4,8 Gy)60Coγ射线照射处理,收取2h时间点细胞,Western Blots实验观察DNA-PKcs蛋白及其Ser2056位点磷酸化表达情况。同时为了排除细胞特异性实验采用不同剂量(0,2,4,8 Gy)的60Coγ射线照射HeLa细胞、293T细胞、HepG2细胞,Western Blots实验观察照射后2h时间点各细胞中DNA-PKcs蛋白Ser2056位点磷酸化表达情况。(2)以DNA-PKcs为目标蛋白,实验用8Gy 60Coγ射线照射U2OS细胞,分别提取未照射对照组(con)和照射后(0.5、1、2、4、8 h)各个时间点样品核蛋白,对其分别进行特异性RNA结合蛋白免疫沉淀,分离提取沉淀中蛋白质和RNA,Western Blots实验验证抗体蛋白富集效果,利用RNA分光光度仪和电泳实验对免疫沉淀复合物中分离纯化的RNA质量进行初步检验;高通量测序分析(诺禾致源公司)实验备选RNA样品,对于测序数据结果,使用Fast QC进行质量控制与统计,通过BWA软件与参考基因进行比对,使用cufflink软件拼接比对结果并计算表达量。通过差异分析将对照组(con)分别和实验照射组(0.5h、1h)差异表达基因的交集作为研究与DNA-PKcs蛋白结合RNA的目标基因组。然后对目标基因组进行功能注释(GO注释和KEGG注释),筛选出富集度较高的RNA分子作为后续研究的候选RNA并进行qRT-PCR实验表达验证,选出差异大的RNA作为最后研究对象。使用siRNA抑制目标RNA表达的方法进行功能实验,同时选用敲低DNA-PKcs表达和使用DNA-PKcs激酶活性抑制剂的实验组进行结果对照。结果:(1)60Coγ射线照射后DNA-PKcs蛋白激酶活性增强具有时间效应。(2)60Coγ射线照射后DNA-PKcs蛋白激酶活性增强具有剂量效应。(3)60Coγ射线照射对DNA-PKcs蛋白激酶活性的剂量效应不具有细胞特异性。(4)实验所选DNA-PKcs抗体能够有效的免疫沉淀DNA-PKcs蛋白。(5)实验分离纯化获得的RNA分光光度计测得OD260/280范围在1.8-2.2,凝胶电泳质检RNA有较完整、清晰的RNA条带。(6)筛选出KEGG通路分析及GO富集分析共同选取的富集度高的3条代谢通路,3条富集通路交集有5个基因分别是ITGA3、ITGA5、ITGAV、CD44和SDC4。(7)目标基因在qRT-PCR实验表达均有增高趋势,其中ITGA5和SDC4基因表达差异最明显。(8)使用siRNA抑制ITGA5、SDC4基因表达,实验中细胞迁移率均明显降低,实验结果与通过敲低DNA-PKcs表达或使用DNA-PKcs激酶活性抑制剂导致细胞迁移率降低趋势具有一致性。结论:(1)研究了人体细胞DNA-PKcs蛋白激酶活性表达具有电离辐射的时间和剂量效应,因此DNA-PKcs蛋白可作为人体细胞基因放射损伤修复机制研究的靶蛋白。(2)成功获得了与U2OS细胞DNA-PKcs蛋白复合体结合的RNA高通量测序库。(3)DNA-PKcs蛋白与ITGA5、SDC4基因可能在细胞运动能力方面有相互调节作用。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-05-30）
王欢[2]（2019）在《自噬底物p62泛素化降解DNA损伤修复蛋白Rad51在幽门螺杆菌致病中的机制研究》一文中研究指出背景与目的:据统计,胃癌在全球恶性肿瘤致死率中居于第3位。胃癌的发病因素众多,目前已明确幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染在慢性非萎缩性胃炎发展到胃癌这一过程中发挥关键作用。细胞毒素相关蛋白(CagA)为Hp致病的关键毒力因子之一。目前,Hp确切的致病机制尚未阐明。DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是指DNA双链在相邻位点发生的断裂,是DNA损伤最致命的形式之一。DSBs可导致细胞基因组不稳定,并可能最终导致细胞恶变。我们的前期研究及新近国内外研究均发现Hp感染可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs。而DSBs的精确修复依赖DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)及同源重组修复机制(homologous recombination,HR)。Rad51蛋白是同源重组修复的关键蛋白,可在BRCA2B等的募集和负载下,结合至经切除修饰的DNA损伤部位,参与同源部位搜寻与DNA单链交换等过程。我们的前期研究发现,Hp感染在诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs的同时,抑制HR修复关键蛋白Rad51的表达。进一步研究发现,Hp感染通过抑制细胞自噬促进DSBs发生,且Rad51在自噬调控DNA损伤过程中起着重要作用。然而,自噬调控Rad51的分子机制及其在Hp致病中的作用仍不清楚。P62,又称SQSTM1,是一种多功能蛋白,除了作为自噬受体蛋白外其本身也是自噬的选择性底物之一。当细胞发生自噬时,p62蛋白降解;而当自噬活性减弱或自噬功能缺陷时,p62蛋白则在细胞中累积,因此p62是反映自噬活性的标记蛋白之一。同时,p62是链接泛素化蛋白到自噬机制的重要调控分子,可链接LC3和泛素化底物,进而被整合到自噬体中,并在自噬溶酶体中被降解。P62含多个结构域,其C端包含一个泛素联合结构域(UBA域),其UBA序列可选择性结合多泛素化蛋白,并通过N端UBL结构域能够直接作用于蛋白酶体的亚基,将多泛素化蛋白底物定位于蛋白酶体并降解。基于我们的前期研究基础及以往文献报道的综合分析,我们推测:Hp感染导致的DNA损伤修复蛋白Rad51表达下调是由p62介导其发生泛素化降解导致。本研究将探讨Hp感染及毒力因子CagA对p62、Rad51的影响,进一步明确Hp感染致病过程中自噬底物p62对Rad51的分子调控机制。材料与方法:(一)体内外研究Hp感染对p62、Rad51蛋白的影响及毒力因子CagA在其中的作用:1.Hp7.13活菌体外与GES-1及AGS细胞共培养,改变感染复数及感染时间,通过Western blot检测不同感染条件下p62及Rad51的表达;2.构建HpSS1感染C57BL/6小鼠动物模型,通过免疫组化及荧光原位杂交检测Hp在小鼠胃内的定植情况,荧光定量PCR检测小鼠胃内炎症因子改变,通过免疫组化、Western blot检测小鼠胃黏膜组织p62及Rad51的表达。3.Hp7.13及Hp7.13-CagA~-活菌分别与GES-1及AGS细胞共培养,通过Western blot检测毒力因子CagA对p62及Rad51蛋白的影响。(二)Hp感染通过p62泛素化降解Rad51蛋白的机制探讨:1.探讨Hp感染致病过程中干扰p62的表达对Rad51蛋白的影响:将p62过表达及敲减质粒转染至GES-1和AGS细胞中,Western blot检测Rad51蛋白表达的变化;Hp7.13活菌与p62敲减的GES-1及AGS共培养,Western blot检测Rad51蛋白表达的变化;构建HpSS1感染C57BL/6小鼠的动物模型,干预小鼠胃黏膜组织p62的表达水平后,通过免疫组化及Western blot检测Rad51蛋白表达的变化。2.研究Hp感染后p62与Rad51蛋白是否存在相互作用:Hp7.13活菌与GES-1及AGS细胞共培养,细胞免疫荧光检测感染后p62及Rad51蛋白的细胞定位;将Myc-p62及Flag-Rad51质粒共转染细胞,免疫共沉淀(Co-IP)检测p62及Rad51的相互作用;String数据库预测p62与Rad51蛋白互作关系;3.Hp感染通过p62泛素化降解Rad51的机制探讨:蛋白酶体抑制剂MG-132预处理AGS细胞后与Hp共培养,Western blot检测Rad51蛋白的表达变化;将HA-Ub及Flag-Rad51质粒共转染细胞,并与Hp共培养,通过免疫共沉淀检测Hp感染对Rad51泛素化水平的影响;对AGS细胞中p62蛋白进行敲减,检测Rad51蛋白半衰期的变化;将Myc-p62、Flag-Rad51及HA-Ub质粒共转染至GES-1及AGS细胞中,通过泛素化实验检测p62能否引起Rad51的泛素化降解。结果:(一)体内外研究Hp感染对p62、Rad51蛋白的影响及毒力因子CagA在其中的作用:Hp 7.13标准菌株以不同感染复数(MOI)作用于GES-1及AGS细胞24h,或以MOI=200作用于细胞不同时间,发现Hp体外感染以浓度依赖的方式导致p62蛋白表达升高,Rad51蛋白表达减少。同时,在HpSS1体内感染的C57BL/6小鼠中,同样发现p62蛋白表达水平升高,而Rad51蛋白表达水平则下降。另外,将Hp 7.13标准菌株与Hp7.13 CagA~-活菌分别与GES-1及AGS细胞共培养,通过Western blot检测p62及Rad51蛋白表达水平的变化。实验发现,CagA敲除后可显着降低Hp感染引起的p62蛋白积累,并上调Hp感染导致的Rad51蛋白表达下降。上述实验提示:Hp体内外感染可导致p62蛋白堆积及Rad51蛋白水平下降,且毒力因子CagA在其中起重要作用。(二)Hp感染通过p62泛素化降解Rad51蛋白的机制探讨:将p62过表达质粒或敲减质粒转染至细胞中,发现p62过表达时,Rad51蛋白水平明显下降;而将p62敲减时,Rad51蛋白水平则明显升高。在Hp体内外感染同时干预小鼠胃内p62蛋白的表达水平,发现干扰p62蛋白表达后,Rad51蛋白表达水平发生改变。以上结果提示:在Hp体内外感染过程中,p62蛋白可负性调控Rad51蛋白的表达。随后,我们采用细胞免疫荧光检测在Hp7.13感染后p62与Rad51蛋白的细胞内定位,发现Hp感染后二者存在共定位,提示二者存在相互作用。进一步,我们利用免疫共沉淀的方法验证了p62与Rad51的相互作用关系。为探讨p62对Rad51的调控机制,我们使用String数据库发现p62与Rad51蛋白通过泛素化UBB蛋白连接在一起,提示p62泛素化调控Rad51的表达。蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后可显着抑制Hp感染引起的Rad51蛋白水平下降。进一步,我们将Flag-Rad51、HA-Ub共转染至细胞中,其后分别与Hp7.13、Hp 7.13 CagA~-活菌共培养,发现Hp 7.13感染的细胞中可见明显的Rad51蛋白泛素化条带,而在Hp 7.13 CagA~-感染的细胞中,Rad51蛋白泛素化水平明显下降。表明Hp感染可诱导Rad51泛素化降解,毒力因子CagA在其中起重要作用。此外,我们发现Hp感染时敲减p62蛋白可显着延长Rad51蛋白的半衰期,提示p62降解Rad51蛋白参与了Hp感染的致病过程。最后,我们将Myc-p62、Flag-Rad51及HA-Ub质粒共转染至细胞中,通过泛素化实验发现转染p62过表达质粒后,Rad51蛋白的泛素化水平明显升高,表明p62可泛素化降解Rad51蛋白。结论:1.Hp体内外感染可导致p62蛋白堆积及Rad51蛋白水平下降,且毒力因子CagA在其中起重要作用。2.Hp感染通过自噬底物p62介导DNA损伤修复关键蛋白Rad51的泛素化降解。(本文来源于《南昌大学》期刊2019-05-01）
黄巧婷,许杰,林家仕[3]（2018）在《运动性骨骼肌损伤大鼠膜修复蛋白dysferlin的作用机制》一文中研究指出背景:目前关于dysferlin的研究多集中在肌肉疾病(如肌营养不良)上,而针对运动后肌损伤发生后细胞膜的修复与dysferlin的关系鲜有研究。目的:观察急性离心运动后大鼠腓肠肌细胞膜通透性及膜修复蛋白dysferlin及calpain3表达变化,为深化肌组织再生分子机制及肌肉疾病的运动治疗提供理论参考。方法:将32只大鼠随机分为对照组、运动后24,48,72 h组。采用免疫组织化学染色、Western blot及qRT-PCR等方法检测大鼠腓肠肌细胞膜完整性和dysferlin,calpain3蛋白及基因表达。结果与结论:与对照组相比,运动后24 h组血清肌酸激酶活性、Calpain3 mRNA,dysferlin蛋白表达及骨骼肌细胞膜损伤程度均增高(P<0.05或P<0.01);运动后24,48 h组大鼠dysferlin mRNA表达量高于运动后72 h组(P<0.05)。结果说明,离心运动后24 h,骨骼肌细胞膜损伤最为严重,人体通过Ca~(2+)内流,激活了细胞内钙激活酶calpain3基因表达,进而通过促进膜特异性修复蛋白dysferlin表达修复受损的骨骼肌细胞膜。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2018年16期）
黄瑜琳,熊建平,王章定,周建伟[4]（2015）在《DNA修复蛋白JWA对DEN致肝损伤的作用和机制研究》一文中研究指出【目的】环境中常见能引起肝脏损伤的毒物有黄曲霉毒素,藻毒素,亚硝胺类等,其中二乙基亚硝胺(DEN)作为化学诱导剂,可引起肝脏损伤并能诱导肝癌发生。JWA作为环境应答基因,广泛参与细胞对多种环境理化因素的应答反应,是典型的DNA修复蛋白并作为BER复合物中新的分子参与DNA的单链损伤修复过程。本研究旨在初步阐明JWA调控的DNA修复信号网络对DEN致肝损伤的保护作用及其分子机制。【材料和方法】细胞实验:人正常肝细胞L02经不同浓度及时间的DEN处理后,检测JWA表达水平变化并观察细胞损伤及凋亡情况,确定IC50值。同时应用JWA的siRNA及高表达质粒处理L02细胞,选取适当剂量DEN处理,蛋白免疫印迹(WB)和免疫荧光(IF)检测改变JWA表达水平后DEN致DNA损伤及相应修复分子表达,同时应用TUNEL实验和流式细胞仪检测细胞凋亡水平。动物实验:建立JWA~(+/+)和JWA~(△2/△2)小鼠JWADEN体内亚急性染毒模型,每组5只,DEN处理剂量为100 mg/kg体重,以生理盐水为对照,观察肝脏损伤,检测体内氧化水平;首次腹腔注射48小时后后剖杀小鼠,收集肝脏及血清进行相关指标测定。【结果】DEN能明显诱导L02细胞DNA损伤及细胞凋亡并伴随JWA表达升高,均呈时间-和剂量-效应关系;高表达JWA的L02细胞对于DEN诱导的DNA损伤敏感性明显降低,细胞成活率明显高于对照组;而JWA表达缺陷的L02细胞对DEN更敏感,DNA损伤加重,凋亡增多。高表达丁WA后,DNA损伤减轻,凋亡减少;IF检测γH2AX和8-OHdg结果显示高表达JWA相较于对照组能减轻DEN诱导的DNA单链损伤及DNA双链损伤,JWA缺陷的L02细胞相较于对照组DEN诱导的DNA损伤明显加重;JWA是通过碱基切除修复通路中的XRCC1及Polyβ两个关键分子参与DEN诱导L02细胞DNA损伤修复过程;DEN体内亚急性染毒结果显示对比JWA~(+/+)小鼠,JWA~(△2/△2)小鼠体重丢失增加,肝组织损伤更重,γH2AX表达增加,肝组织病理切片HE染色JWA~(△2/△2)小鼠肝损伤明显重于JWA~(+/+)小鼠。【结论】DEN处理引起明显的人正常肝L02细胞DNA损伤及细胞凋亡,以及诱导小鼠发生肝损伤;DNA修复蛋白JWA可通过碱基切除修复通路减轻DEN诱导的肝损伤。(本文来源于《中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集》期刊2015-10-25）
贾金婧,曾宪思[5]（2015）在《DNA损伤修复蛋白在炎症免疫反应中的作用》一文中研究指出细胞代谢或细胞应激均可以引起DNA损伤。DNA损伤可以引起一系列级联反应即DNA损伤反应。炎症免疫反应是活体组织对损伤因子所起的防御反应。DNA损伤反应与炎症的发生发展密切相关,而DNA损伤修复蛋白在免疫系统中具有重要作用。本文将就DNA损伤修复蛋白在炎症免疫反应中的作用及其机制进行综述。(本文来源于《生命的化学》期刊2015年04期）
徐诚,严丽锋,王心如,顾爱华[6]（2014）在《DNA损伤修复蛋白XRCC1的研究进展》一文中研究指出X线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)在碱基切除修复(BER)以及单链断裂损伤修复(SSBR)中起着支架蛋白的作用。XRCC1可以与多个DNA修复相关蛋白交互作用并招募到DNA损伤部位,最终完成DNA的修复。由于XRCC1在DNA修复通路的重要作用,主要突变体Arg194Trp、Arg280His以及Arg399Gln也被深入地研究。在本文中作者对XRCC1的结构、功能以及它的突变体在人类疾病发生中的作用作一概述。(本文来源于《东南大学学报(医学版)》期刊2014年03期）
颜微[7]（2014）在《人源DNA损伤修复蛋白PTIP和裂殖酵母tRNA甲基转移酶Trm10的结构与功能研究》一文中研究指出本论文前两章介绍了人源DNA损伤反应相关蛋白PTIP的结构与功能研究。DNA损伤应答是对于维持基因组的稳定性所必不可少的细胞内基本的过程,该过程对于细胞和有机体的功能的发挥至关重要。在细胞周期的不同时期,一旦DNA被内源性或外源性的一些因子损伤,许多蛋白都能被招募到DNA损伤位点,这些蛋白在这里可以组成一个复杂的相互作用网络进而激活DNA损伤修复系统。在哺乳动物细胞中的DNA损伤修复途径中,组蛋白变异体H2AX的C-末端磷酸化是最早发生的染色质修饰,同时也是DNA修复过程中一个重要的早期事件,其目的在于招募DNA损伤修复蛋白到DNA双链断裂位点(DSBs)。值得一提的是,在包含串联BRCT结构域(BRCA1-C-末端结构域)的蛋白中,例如hMDCl, hMCPH1, spBrc1和spCrb2(53BP1在裂殖酵母菌属中的同源物),BRCT结构域与H2AX(yH2AX)或磷酸化的H2A(在酵母中为γH2A)结合。本论文开展了人源PTIP蛋白的结构生物学研究,PTIP蛋白包括六个BRCT结构域：其中两个在氨基端,另外四个在羧基端。已有的研究表明PTIP的第二个BRCT结构域直接和PAl作用,同时它的C端四个BRCT结构域在电离辐射(IR)以后可以与yH2AX共定位形成foci现象。研究表明,通过定向的肽库筛选,PTIP BRCT5-BRCT6结构域可以和模式为pS/T-Q-V-F的磷酸化的小肽结合。人源yH2AX的C末端尾巴有一个相似的序列模式(pS-Q),具有与BRCT5-BRCT6结构域结合的最佳小肽序列,人源PTIP的裂殖酵母同源物Brc1可通过其C-末端的串联BRCT结构域与γH2A相互作用,暗示人源PTIP也可能识别yH2AX。我们通过荧光偏振实验证明PTIP BRCT5-BRCT6结构域与yH2AX小肽在体外有很强的相互作用,进而我们解析了2.15埃的BRCT5-BRCT6与yH2AX小肽复合物的晶体结构。该结构表明PTIP BRCT5-BRCT6具有保守的结合磷酸化底物的残基,而且对pSer+3位也有一定的选择性。我们的研究结果阐明了人源PTIP BRCT5-BRCT6结构域识别yH2AX的分子基础。本论文后两章节介绍了裂殖酵母tRNA甲基转移酶spTrm10的结构与功能研究。tRNA甲基化为tRNA发挥其生物学功能所必需,它不仅影响到蛋白翻译的效率,而且还与tRNA叁维结构的正确折迭有直接的关系。到目前为止,在tRNA中共发现两个位点的m1G的甲基化：一个是m1G37,它是由古细菌和真核生物的Trm5和细菌中的TrmD催化完成。Trm5属于经典的RFM甲基转移酶家族,而TrmD属于SPOUT甲基转移酶家族。另外一位是tRNA鸟嘌呤第九位的N1甲基化(m1G),被发现在真核生物和古细菌中广泛存在,它是由甲基转移酶中的Trm10家族催化完成。Trm10家族与上述的Trm5家族和TrmD没有任何的序列同源性,为了研究Trm10的催化机制,在本论文报道了tRNA甲基转移酶spTrm10(裂殖酵母)单独以及它与甲基供体产物S-腺苷-高半胱氨酸(SAH)复合物的晶体结构。同时,我的合作者邵振华也解析了在酿酒酵母同源物scTrm10与SAH的复合物晶体结构。我们的晶体学研究表明裂殖酵母spTrm10家族的甲基转移酶结构域(催化结构域)呈现出典型的SPOUT折迭类型。另外,X-射线小角散射分析表明spTrm10在溶液中以单体形式存在,然而,SPOUT家族中其他的成员均是以同二聚体的形式发挥功能。我们也进行了tRNA甲基转移酶活性分析、等温滴定热量测定实验(ITC)、凝胶迁移阻滞实验以及突变分析等实验手段,我们揭示了裂殖酵母spTrm10甲基转移酶识别底物tRNA的机制。(本文来源于《中国科学技术大学》期刊2014-04-15）
张乔,袁方,黄亚琴,陈志文,杨劲[8]（2014）在《DNA损伤修复蛋白XPF影响肾癌细胞顺铂耐药》一文中研究指出目的探索DNA损伤修复蛋白XPF表达水平影响肾癌细胞顺铂耐药的作用与机制。方法 Western blot法检测不同肾癌细胞株的XPF蛋白水平;采用shRNA干扰技术,筛选稳定低表达XPF的细胞株;采用克隆形成实验及细胞凋亡检测实验,比较XPF低表达细胞株与XPF正常表达细胞株的顺铂敏感性;通过β-半乳糖苷酶染色法,检测细胞的衰老程度。结果在肾癌细胞786-0、ACHN和Caki-1中,ACHN细胞的XPF表达水平最高,其顺铂耐药程度也最高。shRNA干扰获得稳定低表达XPF的ACHN细胞,顺铂处理后,其克隆形成率低于对照(P<0.05),细胞凋亡率高于对照,衰老细胞比例也显着高于对照(P<0.01)。结论肾癌化疗不敏感可能与其高表达DNA损伤修复蛋白XPF有关,干预并下调肾癌ACHN细胞XPF表达,可增强顺铂的凋亡诱导效应并加速衰老,从而提高其顺铂敏感性。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2014年09期）
刘郝静[9]（2013）在《乙肝病毒对于肝癌细胞DNA双链断裂损伤后修复蛋白CtIP功能的影响》一文中研究指出研究背景：原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，乙肝病毒（HBV）感染是导致其发生发展的常见诱因。DNA双链断裂损伤（DSBs）是导致肿瘤恶性发展的一个主要因素。研究显示，HBV感染可以引起不同程度的DNA损伤，包括DSBs。抑癌蛋白CtIP在DSBs发生后再修复过程中发挥着至关重要的作用。关于HBV感染是否影响肝癌细胞在遭受DSBs后修复过程中抑癌蛋白CtIP蛋白的正常功能未见研究报道，有待于进一步的深入研究。目的：研究HBV感染对肝癌细胞DSBs修复过程中抑癌蛋白CtIP表达及功能的影响。方法：选择稳定转染HBV基因组的HepG2.2.15作为实验组细胞株，选择经典原发性肝癌HepG2作为对照组细胞株，分别给予低浓度抗肿瘤药物博来霉素（BLM）处理诱导产生DSBs，利用Realtime-PCR与Western Blot技术检测DSBs发生后CtIP在RNA、总蛋白表达水平及磷酸化水平的改变。结果：实验结果表明（1）低浓度BLM给药24h后，DSBs金标准蛋白γ-H2AX表达显着上升，证实BLM处理细胞株24h后DSBs发生（2）Realtime-PCR结果显示：两组肝癌细胞株在给药处理后CtIP RNA表达均显着上调；实验组细胞株与对照组细胞株之间，给药前及给药后HepG2.2.15细胞株RNA表达均高于HepG2细胞株；P值<0.05（3）Western Blot分别检测给药前及给药后各个细胞株的CtIP总蛋白表达情况，结果显示：同种细胞间，给药处理后CtIP总蛋白表达明显上调；实验组与对照组之间，给药前及给药后HepG2.2.15细胞株CtIP总蛋白表达量均明显高于HepG2细胞株CtIP总蛋白表达量；P值<0.05（4）检测给药前和给药后各个细胞株的丝氨酸位点磷酸化CtIP蛋白表达情况：给药前各个细胞株，CtIP磷酸化蛋白基本不表达；给药处理后，各个细胞株的CtIP磷酸化蛋白均显着上调，而实验组细胞株的CtIP磷酸化程度明显低于对照组。结论：肝癌细胞DNA双链断裂损伤后其关键性修复蛋白CtIP功能的发挥主要依靠总蛋白表达量和磷酸化功能蛋白的表达程度，我们研究发现， HBV感染在肝癌细胞DSBs前后均显着上调修复蛋白CtIP的RNA及总蛋白表达量，但是并不引起丝氨酸位点磷酸化CtIP功能蛋白表达的提高，这也许是HBV感染造成肝癌细胞修复障碍并最终推动HBV相关性肝癌发生发展的主要原因之一。(本文来源于《华中科技大学》期刊2013-05-01）
罗树立[10]（2011）在《DNA损伤修复蛋白在肺癌发生中的作用》一文中研究指出肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,是癌症引起患者特别是男性患者死亡的主要原因。世界卫生组织(WHO)公布的资料显示,肺癌无论从发病数量还是死亡数量来看,均为全球最主要的癌症。同期预测,我国将成为21世纪的肺癌大国。肺癌几乎包括来源于气管、支气管或肺上皮的肿瘤,其基本病理类型包括鳞状细胞癌、腺癌,大细胞癌(统称非小细胞肺癌,NSCLC)及小细胞肺癌。除了吸烟,肺癌阳性家族史被认为是一个危险因素。基因改变包括p53基因的频繁突变,激活癌基因KRAS的点突变,FHIT基因杂合子频繁丢失和异常转录,CDK抑制子P16纯合子缺失和转录沉默。肺癌风险的增加与特定的细胞色素P450基因的多态性和DNA修复能力缺陷包括DNA碱基切除修复基因XRCC1,PARP-1和ERCC4相关。DNA是生命体中最重要的遗传物质,DNA损伤引起的细胞应激反应对于保证遗传物质的稳定性、抑制基因突变的产生及维持细胞寿命具有重要意义。如同其它恶性肿瘤的发生一样,NSCLC的发生也是一个多因素、多阶段、多步骤的复杂的过程。其主要机制是各种因素导致的原癌基因激活或抑癌基因失活,DNA损伤修复基因功能低下或缺失,以及一些信号通路共同参与的结果。DNA损伤修复基因在维护遗传基因的完整性和稳定性,防止细胞癌变方面具有非常重要的作用。本实验主要探讨参与DNA损伤修复蛋白Mre11、Ku80的表达与肺癌患者相关性,并构建DNA损伤修复蛋白PARP-1缺失的小鼠肺癌细胞系,为进一步临床抗肿瘤药物研究提供细胞评价平台。实验方法：(1)采用免疫组织化学的方法检测DNA损伤修复蛋白在人肺癌组织中的表达情况,进行统计学分析,运用非参数检验的方法,进而评价肺癌组织中Mre-11、Ki67蛋白的表达与患者性别、年龄、临床分期及病理分型的相关性。(2)应用PARP-1敲除小鼠肺肿瘤模型进行原代培养,通过形态学观察、免疫荧光及致瘤性分析,以此鉴定构建PARP-1缺失的小鼠肺腺癌细胞系。实验结果：(1)通过免疫组化学及统计学分析表明,虽然Mre-11蛋白表达量与患者年龄、性别、病理分型、肿瘤大小(TNM分期)无明显关系(P>0.05),但其在Ⅰ期肺腺癌组织中表达较低,随着肿瘤的进展表达上升,在Ⅱ期标本中表达达到峰值,在Ⅲ期标本中表达又回落至较低水平,统计学上具有显着差异(P<0.05),提示DNA损伤修复蛋白Mre11与肺癌的发生具有相关性。(2)建立了有效的小鼠原代肺癌细胞培养方法。(3)成功的获得了两例原代小鼠肺腺癌细胞株,光镜和电镜下具有典型的上皮特征。裸鼠移植瘤接种检测表明这些上皮来源的细胞具有致瘤性。结论：(1)通过免疫组织化学结果分析表明DNA损伤修复蛋白Mre-11的表达与人肺腺癌组织临床分期有显着关联性(P<0.05),根据在各期表达的规律,提示Mre-11在肺腺癌进展过程中可能起到抑制作用；而Ki67蛋白的表达则与肺腺癌患者性别、年龄、临床分期、TNM分期及病理分化程度均无明显关系(P>0.05)。(2)成功建立了PARP-1缺失的小鼠肺腺癌原代培养细胞株,并证明导致肿瘤的发生；此细胞系的确立,为临床抗肿瘤药物提供了一个研究平台。(本文来源于《吉林大学》期刊2011-05-01）
损伤修复蛋白类论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景与目的:据统计,胃癌在全球恶性肿瘤致死率中居于第3位。胃癌的发病因素众多,目前已明确幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染在慢性非萎缩性胃炎发展到胃癌这一过程中发挥关键作用。细胞毒素相关蛋白(CagA)为Hp致病的关键毒力因子之一。目前,Hp确切的致病机制尚未阐明。DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是指DNA双链在相邻位点发生的断裂,是DNA损伤最致命的形式之一。DSBs可导致细胞基因组不稳定,并可能最终导致细胞恶变。我们的前期研究及新近国内外研究均发现Hp感染可诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs。而DSBs的精确修复依赖DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)及同源重组修复机制(homologous recombination,HR)。Rad51蛋白是同源重组修复的关键蛋白,可在BRCA2B等的募集和负载下,结合至经切除修饰的DNA损伤部位,参与同源部位搜寻与DNA单链交换等过程。我们的前期研究发现,Hp感染在诱导胃黏膜上皮细胞发生DSBs的同时,抑制HR修复关键蛋白Rad51的表达。进一步研究发现,Hp感染通过抑制细胞自噬促进DSBs发生,且Rad51在自噬调控DNA损伤过程中起着重要作用。然而,自噬调控Rad51的分子机制及其在Hp致病中的作用仍不清楚。P62,又称SQSTM1,是一种多功能蛋白,除了作为自噬受体蛋白外其本身也是自噬的选择性底物之一。当细胞发生自噬时,p62蛋白降解;而当自噬活性减弱或自噬功能缺陷时,p62蛋白则在细胞中累积,因此p62是反映自噬活性的标记蛋白之一。同时,p62是链接泛素化蛋白到自噬机制的重要调控分子,可链接LC3和泛素化底物,进而被整合到自噬体中,并在自噬溶酶体中被降解。P62含多个结构域,其C端包含一个泛素联合结构域(UBA域),其UBA序列可选择性结合多泛素化蛋白,并通过N端UBL结构域能够直接作用于蛋白酶体的亚基,将多泛素化蛋白底物定位于蛋白酶体并降解。基于我们的前期研究基础及以往文献报道的综合分析,我们推测:Hp感染导致的DNA损伤修复蛋白Rad51表达下调是由p62介导其发生泛素化降解导致。本研究将探讨Hp感染及毒力因子CagA对p62、Rad51的影响,进一步明确Hp感染致病过程中自噬底物p62对Rad51的分子调控机制。材料与方法:(一)体内外研究Hp感染对p62、Rad51蛋白的影响及毒力因子CagA在其中的作用:1.Hp7.13活菌体外与GES-1及AGS细胞共培养,改变感染复数及感染时间,通过Western blot检测不同感染条件下p62及Rad51的表达;2.构建HpSS1感染C57BL/6小鼠动物模型,通过免疫组化及荧光原位杂交检测Hp在小鼠胃内的定植情况,荧光定量PCR检测小鼠胃内炎症因子改变,通过免疫组化、Western blot检测小鼠胃黏膜组织p62及Rad51的表达。3.Hp7.13及Hp7.13-CagA~-活菌分别与GES-1及AGS细胞共培养,通过Western blot检测毒力因子CagA对p62及Rad51蛋白的影响。(二)Hp感染通过p62泛素化降解Rad51蛋白的机制探讨:1.探讨Hp感染致病过程中干扰p62的表达对Rad51蛋白的影响:将p62过表达及敲减质粒转染至GES-1和AGS细胞中,Western blot检测Rad51蛋白表达的变化;Hp7.13活菌与p62敲减的GES-1及AGS共培养,Western blot检测Rad51蛋白表达的变化;构建HpSS1感染C57BL/6小鼠的动物模型,干预小鼠胃黏膜组织p62的表达水平后,通过免疫组化及Western blot检测Rad51蛋白表达的变化。2.研究Hp感染后p62与Rad51蛋白是否存在相互作用:Hp7.13活菌与GES-1及AGS细胞共培养,细胞免疫荧光检测感染后p62及Rad51蛋白的细胞定位;将Myc-p62及Flag-Rad51质粒共转染细胞,免疫共沉淀(Co-IP)检测p62及Rad51的相互作用;String数据库预测p62与Rad51蛋白互作关系;3.Hp感染通过p62泛素化降解Rad51的机制探讨:蛋白酶体抑制剂MG-132预处理AGS细胞后与Hp共培养,Western blot检测Rad51蛋白的表达变化;将HA-Ub及Flag-Rad51质粒共转染细胞,并与Hp共培养,通过免疫共沉淀检测Hp感染对Rad51泛素化水平的影响;对AGS细胞中p62蛋白进行敲减,检测Rad51蛋白半衰期的变化;将Myc-p62、Flag-Rad51及HA-Ub质粒共转染至GES-1及AGS细胞中,通过泛素化实验检测p62能否引起Rad51的泛素化降解。结果:(一)体内外研究Hp感染对p62、Rad51蛋白的影响及毒力因子CagA在其中的作用:Hp 7.13标准菌株以不同感染复数(MOI)作用于GES-1及AGS细胞24h,或以MOI=200作用于细胞不同时间,发现Hp体外感染以浓度依赖的方式导致p62蛋白表达升高,Rad51蛋白表达减少。同时,在HpSS1体内感染的C57BL/6小鼠中,同样发现p62蛋白表达水平升高,而Rad51蛋白表达水平则下降。另外,将Hp 7.13标准菌株与Hp7.13 CagA~-活菌分别与GES-1及AGS细胞共培养,通过Western blot检测p62及Rad51蛋白表达水平的变化。实验发现,CagA敲除后可显着降低Hp感染引起的p62蛋白积累,并上调Hp感染导致的Rad51蛋白表达下降。上述实验提示:Hp体内外感染可导致p62蛋白堆积及Rad51蛋白水平下降,且毒力因子CagA在其中起重要作用。(二)Hp感染通过p62泛素化降解Rad51蛋白的机制探讨:将p62过表达质粒或敲减质粒转染至细胞中,发现p62过表达时,Rad51蛋白水平明显下降;而将p62敲减时,Rad51蛋白水平则明显升高。在Hp体内外感染同时干预小鼠胃内p62蛋白的表达水平,发现干扰p62蛋白表达后,Rad51蛋白表达水平发生改变。以上结果提示:在Hp体内外感染过程中,p62蛋白可负性调控Rad51蛋白的表达。随后,我们采用细胞免疫荧光检测在Hp7.13感染后p62与Rad51蛋白的细胞内定位,发现Hp感染后二者存在共定位,提示二者存在相互作用。进一步,我们利用免疫共沉淀的方法验证了p62与Rad51的相互作用关系。为探讨p62对Rad51的调控机制,我们使用String数据库发现p62与Rad51蛋白通过泛素化UBB蛋白连接在一起,提示p62泛素化调控Rad51的表达。蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后可显着抑制Hp感染引起的Rad51蛋白水平下降。进一步,我们将Flag-Rad51、HA-Ub共转染至细胞中,其后分别与Hp7.13、Hp 7.13 CagA~-活菌共培养,发现Hp 7.13感染的细胞中可见明显的Rad51蛋白泛素化条带,而在Hp 7.13 CagA~-感染的细胞中,Rad51蛋白泛素化水平明显下降。表明Hp感染可诱导Rad51泛素化降解,毒力因子CagA在其中起重要作用。此外,我们发现Hp感染时敲减p62蛋白可显着延长Rad51蛋白的半衰期,提示p62降解Rad51蛋白参与了Hp感染的致病过程。最后,我们将Myc-p62、Flag-Rad51及HA-Ub质粒共转染至细胞中,通过泛素化实验发现转染p62过表达质粒后,Rad51蛋白的泛素化水平明显升高,表明p62可泛素化降解Rad51蛋白。结论:1.Hp体内外感染可导致p62蛋白堆积及Rad51蛋白水平下降,且毒力因子CagA在其中起重要作用。2.Hp感染通过自噬底物p62介导DNA损伤修复关键蛋白Rad51的泛素化降解。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
损伤修复蛋白类论文参考文献
[1].宋志全.电离辐射对DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs及其结合RNA作用的研究[D].军事科学院.2019
[2].王欢.自噬底物p62泛素化降解DNA损伤修复蛋白Rad51在幽门螺杆菌致病中的机制研究[D].南昌大学.2019
[3].黄巧婷,许杰,林家仕.运动性骨骼肌损伤大鼠膜修复蛋白dysferlin的作用机制[J].中国组织工程研究.2018
[4].黄瑜琳,熊建平,王章定,周建伟.DNA修复蛋白JWA对DEN致肝损伤的作用和机制研究[C].中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集.2015
[5].贾金婧,曾宪思.DNA损伤修复蛋白在炎症免疫反应中的作用[J].生命的化学.2015
[6].徐诚,严丽锋,王心如,顾爱华.DNA损伤修复蛋白XRCC1的研究进展[J].东南大学学报(医学版).2014
[7].颜微.人源DNA损伤修复蛋白PTIP和裂殖酵母tRNA甲基转移酶Trm10的结构与功能研究[D].中国科学技术大学.2014
[8].张乔,袁方,黄亚琴,陈志文,杨劲.DNA损伤修复蛋白XPF影响肾癌细胞顺铂耐药[J].第叁军医大学学报.2014
[9].刘郝静.乙肝病毒对于肝癌细胞DNA双链断裂损伤后修复蛋白CtIP功能的影响[D].华中科技大学.2013
[10].罗树立.DNA损伤修复蛋白在肺癌发生中的作用[D].吉林大学.2011